趙 剛 張寅靜 郭小娟 楊艷霞 夏 純 黃志軍

(1 健民藥業(yè)集團(tuán)兒童藥物研究院,武漢,430052; 2 湖北省食品藥品安全評價中心,武漢,430073)

健脾生血顆粒遺傳毒性研究

趙 剛1張寅靜2郭小娟1楊艷霞1夏 純1黃志軍1

(1 健民藥業(yè)集團(tuán)兒童藥物研究院,武漢,430052; 2 湖北省食品藥品安全評價中心,武漢,430073)

目的:考察健脾生血顆粒的遺傳毒性。方法:分別采用組氨酸營養(yǎng)缺陷性鼠傷寒沙門氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535回復(fù)突變試驗(Ames試驗),CHO-K1細(xì)胞染色體畸變試驗,以及小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗考察健脾生血顆粒的遺傳毒性。結(jié)果:Ames試驗結(jié)果顯示,健脾生血顆粒無論在含有和不含有S9的條件下,在所有評估劑量水平的所有測試菌中均可觀察到重復(fù)正常生長,且所有劑量的回復(fù)突變數(shù)與陰性對照組相比均無2倍或以上的顯著上調(diào),且無劑量反應(yīng)關(guān)系;CHO-K1細(xì)胞染色體畸變試驗結(jié)果顯示,健脾生血顆粒650、130、26 μg/mL 3個劑量組的CHO-K1細(xì)胞染色體畸變率均小于5%;小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗結(jié)果顯示,健脾生血顆粒3個劑量組[2 000、1 000和500 mg/(kg·d)]與陰性對照組間微核率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論:在本試驗條件下,健脾生血顆粒未見遺傳毒性作用。

健脾生血顆粒;遺傳毒性;微粒體回復(fù)突變試驗;染色體畸變試驗;微核試驗

健脾生血顆粒與健脾生血片是健民藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司獨家產(chǎn)品,二者處方一致,主要成分均為黨參、茯苓、黃芪、山藥、雞內(nèi)金、龜甲、大棗等,臨床常用于妊娠期婦女、小兒以及成人缺鐵性貧血的治療,尤其是脾胃虛弱及心脾兩虛、氣血兩虛型貧血。該產(chǎn)品臨床應(yīng)用已有30余載,有效性和安全性得到了充分驗證[1-3]。然而,隨著產(chǎn)品市場不斷擴大,患者安全意識逐漸提高,以及醫(yī)生對該產(chǎn)品的深入認(rèn)識需求不斷加大,國家鼓勵藥企對已批準(zhǔn)生產(chǎn)的藥品進(jìn)行上市后再評價研究,尤其是安全性評價研究[4]。為了進(jìn)一步驗證其安全性,我們在已有一般毒性研究資料的基礎(chǔ)上開展了生殖毒性和遺傳毒性試驗研究。本課題將通過體外細(xì)菌[5]、離體細(xì)胞[6]、以及在體動物[7]等載體分別建立試驗?zāi)Ｐ?考察健脾生血顆粒的遺傳毒性情況。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品 健脾生血顆粒(健民藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn),批號:140111-18)。溶媒對照為純水(實驗室自制)和二甲基亞砜(DMSO,分析純)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn),批號:20121130)。陽性對照:疊氮鈉(Amresco公司生產(chǎn),批號:0703C083),敵克松(Dr.Ehrenstorfer GmbH公司生產(chǎn),批號:70321),2-氨基芴(Sigma-Aldrich公司生產(chǎn),批號:S90850V),1,8-二羥基蒽醌(Dr.Ehrenstorfer GmbH公司生產(chǎn),批號:10507),環(huán)磷酰胺(Sigma-Aldrich公司生產(chǎn),批號:079K1569),甲磺酸乙酯(Sigma-Aldrich公司,批號:BCBC4573V)。

1.2 菌株及細(xì)胞 組氨酸營養(yǎng)缺陷性鼠傷寒沙門氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535,購于MOLTOX公司。CHO-K1細(xì)胞株,購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué))。凍存的細(xì)胞株復(fù)蘇后經(jīng)過傳代、培養(yǎng),細(xì)胞密度達(dá)到1.5×105～3×105/mL時用于本課題相關(guān)試驗。

1.3 實驗動物 SPF級昆明種雄性小鼠,6～8周齡,體重25～30 g,購于湖北省實驗動物研究中心,實驗動物使用許可證號:SYXK(鄂)2012-0065,所有動物適應(yīng)性喂養(yǎng)及檢疫期5 d后給藥。動物飼養(yǎng)于IVC籠中,每籠3只,墊料為武漢市萬千佳禾實驗動物養(yǎng)殖有限公司提供的刨花墊料。動物房相對濕度控制范圍為45%～58%,溫度控制范圍為22～25 ℃。光照:10 h明/14 h暗循環(huán)交替至實驗結(jié)束。

1.4 實驗方法

1.4.1 Ames試驗 取TA97a、TA98、TA100、TA102以及TA1535作為試驗菌株,采用平板摻入法,分為含有和不含有大鼠肝勻漿S9兩種情況試驗。健脾生血顆粒選5個劑量用于試驗,分別為65.00、21.67、7.22、2.41和0.80 μg/皿。陽性對照組選用敵克松(50 μg/皿)為TA97a、TA98、TA102菌株不含S9的陽性對照物;疊氮鈉(1.5 μg/皿)為TA100、TA1535菌株不含S9的陽性對照物;2-氨基芴(10 μg/皿)為TA97a、TA98、TA100菌株含有S9的陽性對照物;1,8-二羥基蒽醌(50 μg/皿)為TA102菌株含有S9的陽性對照物;環(huán)磷酰胺(50 μg/皿)為TA1535菌株含有S9的陽性對照物。同體積(0.1 mL)的溶媒為陰性對照物,自發(fā)回變組不對試驗菌液做任何處理。所有試驗平板在摻入法操作結(jié)束后,在(37±2)℃溫度下倒置培養(yǎng)(52±4)h,計數(shù)菌落數(shù)。

1.4.2 CHO-K1細(xì)胞染色體畸變試驗 健脾生血顆粒選取3個劑量用于試驗,分別為650、130和26 μg/ mL,各劑量組受試物制劑無菌條件下配制后用于試驗。同時設(shè)置2組陰性對照組(分別給予總體積0.5%的DMSO和純水)和2組陽性對照組,后者給予同體積的20 μg/mL除菌環(huán)磷酰胺(+S9)和0.25 μL/mL除菌甲磺酸乙酯(-S9)。大鼠肝勻漿混合液+S9均加入0.5 mL。在含有或不含代謝活化條件的系統(tǒng)(+S9/-S9)下,對正在增殖期的細(xì)胞進(jìn)行給藥,給藥持續(xù)時間4 h,并在給藥開始后22 h收獲細(xì)胞。收獲前以秋水仙堿處理細(xì)胞培養(yǎng)物4 h。各組細(xì)胞培養(yǎng)物分別離心(1 000 r/min)5 min、低滲處理20 min、預(yù)固定2 min、固定5 min,1 000 r/min離心富集細(xì)胞,染色,以制備染色體于顯微鏡下觀察染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)的改變。每個組別至少計數(shù)200個分散良好的中期分裂相細(xì)胞,計數(shù)其染色體畸變率。

1.4.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗 試驗小鼠隨機分為5組,分別為健脾生血顆粒高、中、低劑量組[給藥劑量分別為2 000、1 000和500 mg/(kg·d)]、陰性對照組(給予同體積的純水)以及陽性對照組(單次腹腔注射給予環(huán)磷酰胺10 mL/kg)。除陽性對照組外,其余動物均采取單次灌胃方式給藥。陰性對照組及健脾生血顆粒各劑量組中的一半動物于給藥開始后24 h處死,另一半于給藥開始后48 h處死,陽性對照組動物于給藥后24 h處死。處死后的動物取股骨,蘸取少量小牛血清作骨髓涂片,甲醇固定,Gimesa染色,顯微鏡下觀察并對微核進(jìn)行計數(shù),每只小鼠計數(shù)1 000個嗜多染紅細(xì)胞(PCE),以含微核的PCE千分率計算微核率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 Ames試驗統(tǒng)計分析時的實驗單位為平皿數(shù),計數(shù)每個平皿的回變菌落數(shù),并統(tǒng)計各劑量3個平皿回變菌落數(shù)的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。對于某個菌株任一個劑量的健脾生血顆粒所誘導(dǎo)的菌落回變數(shù),與相應(yīng)的溶媒對照組相比,具有2倍或以上的顯著上調(diào),并且該上調(diào)具有顯著的劑量相關(guān)性,則認(rèn)為該受試物為誘變陽性。CHO-K1細(xì)胞染色體畸變試驗和小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗均采用χ2檢驗方法,與陰性對照組進(jìn)行比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ames試驗結(jié)果 菌落計數(shù)結(jié)果顯示,健脾生血顆粒無論在含有和不含有S9的條件下,在所有評估劑量水平的所有測試菌中均可觀察到重復(fù)正常生長,且所有劑量的回復(fù)突變數(shù)與陰性對照組相比均無2倍或以上的顯著上調(diào),且無劑量反應(yīng)關(guān)系。所有陽性和陰性對照值在可接受范圍內(nèi),并滿足所有有效試驗的標(biāo)準(zhǔn),表明健脾生血顆粒對鼠傷寒沙門氏菌無致突變性。見表1、表2。

2.2 CHO-K1細(xì)胞染色體畸變試驗 CHO-K1細(xì)胞染色體觀察結(jié)果顯示,純水陰性對照組和DMSO陰性對照組的CHO-K1細(xì)胞染色體畸變率均小于5%,而環(huán)磷酰胺陽性對照組和甲磺酸乙酯陽性對照組的CHO-K1細(xì)胞染色體畸變率均大于10%,驗證了該評價系統(tǒng)的有效性。受試物健脾生血顆粒高、中、低3個劑量組的CHO-K1細(xì)胞染色體畸變率均小于5%,呈陰性結(jié)果,表明在該試驗條件下,健脾生血顆粒對CHO-K1細(xì)胞染色體無致畸作用。見表3。

2.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗 健脾生血顆粒各劑量組在給藥直至取材前,所有動物均未見異常。健脾生血顆粒對小鼠骨髓細(xì)胞微核率的影響。結(jié)果顯示,健脾生血顆粒各劑量組與陰性對照組間小鼠骨髓細(xì)胞微核率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),結(jié)果為陰性,表明健脾生血顆粒無致突變作用。見表4。

表1 健脾生血顆粒Ames試驗第1次菌落計數(shù)結(jié)果(Mean±SD)

表2 健脾生血顆粒Ames試驗第2次菌落計數(shù)結(jié)果(Mean±SD)

表3 健脾生血顆粒CHO-K1細(xì)胞染色體畸變試驗結(jié)果

注:與純水對照組比較,*P<0.05。

表4 健脾生血顆粒對小鼠骨髓細(xì)胞微核率的影響

注:與陰性對照組比較，**P<0.01。

3 討論

健脾生血顆粒成分主要為黨參、茯苓、白術(shù)、甘草、黃芪、山藥、雞內(nèi)金、龜甲、麥冬、南五味子、龍骨、牡蠣、大棗、硫酸亞鐵等,無毒性藥材,并且多為藥食兩用藥材。從成分分析,該產(chǎn)品幾無毒性作用,僅硫酸亞鐵可能會引起胃腸道不適[8]。張峰等[9]對硫酸亞鐵主要不良反應(yīng)進(jìn)行了研究,提示其可能具有的胃腸道刺激作用(包括惡心、口腔異味、腹瀉等)。當(dāng)然,其不良反應(yīng)與服用劑量有關(guān),劑量越大,發(fā)生不良反應(yīng)的概率越高。此外,硫酸亞鐵的不良反應(yīng)還與聯(lián)合用藥或產(chǎn)品組方也有關(guān),戴瓊[10]通過比較健脾生血顆粒(原健脾生血沖劑)與硫酸亞鐵顆粒的胃腸道刺激作用,發(fā)現(xiàn)前者不良反應(yīng)遠(yuǎn)低于后者,其中藥部分具有健脾和胃之功,同時還可以降低硫酸亞鐵與胃腸壁持續(xù)接觸的機會,從而降低不良反應(yīng)的發(fā)生率。以上主要基于健脾生血顆粒的一般毒性作用進(jìn)行分析,本試驗則從另一方面證實,該產(chǎn)品未見遺傳毒性作用,進(jìn)一步驗證了該產(chǎn)品的安全性,為該產(chǎn)品在臨床上各類貧血患者人群的安全應(yīng)用提供參考。

[1]孫艷.健脾生血顆粒治療嬰幼兒缺鐵性貧血50例臨床觀察[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生,2015,8(3):127-129.

[2]賴鵬程,沈朝霞.健脾生血顆粒治療小兒缺鐵性貧血臨床研究[J].兒科藥學(xué)雜志,2014,20(4):36-38.

[3]白婧.妊娠合并貧血64例臨床診治分析[J].中國實用醫(yī)藥,2014,9(2):137-138.

[4]王永炎,王志飛,謝雁鳴.以再評價為契機的中藥上市后系統(tǒng)研究[J].中國中藥雜志,2014,39(18):3421-3423.

[5]吳彥,邸莎,李賢煜,等.銀菘香的急性毒性及致突變性研究[J].中國藥物警戒,2016,13(6):321-324,337.

[6]田逸君,鄭怡文,朱玉平,等.雷公藤內(nèi)酯醇的遺傳毒性評價[J].藥學(xué)實踐雜志,2016,34(3):215-218.

[7]吳露露,汪岱迪,宗衛(wèi)峰,等.木糖醇的小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗[J].海峽藥學(xué),2016,28(4):32-33.

[8]周惠琴,周慧霞.缺鐵性貧血補鐵的給藥方法與療效及不良反應(yīng)臨床觀察[J].航空航天醫(yī)學(xué)雜志,2013,24(7):834-835.

[9]張峰,張玲.用不同劑量的硫酸亞鐵治療小兒缺鐵性貧血的效果研究[J].當(dāng)代醫(yī)藥論叢,2015,13(16):132-133.

[10]戴瓊.健脾生血沖劑與硫酸亞鐵治療缺鐵性貧血比較[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2003,22(1):51-52.

(2016-12-05收稿 責(zé)任編輯：王明)

Genotoxicity evaluation of Jianpi Shengxue Granule

Zhao Gang1,Zhang Yinjing2,Guo Xiaojuan1,Yang Yanxia1,Xia Chun1,Huang Zhijun1

(1AcademyofPediatricDrugs,JianminPharmaceuticalGroup,Wuhan430052,China; 2CenteroffoodanddrugsafetyevaluationinHubei,Wuhan430073,China)

Objective:To evaluate the genotoxicity of Jianpi Shengxue Granule.Methods:Genotoxicity of Jianpi Shengxue Granule was studied using Ames test,CHO-K1 cell chromosomal aberration test,and mouse bone marrow cell micronucleus assay,respectively.Results:The Ames test results indicated that Jianpi Shengxue Granule did not affect the normal growth of tested bacteriums at all dosages with or without S9.Compared with the negative control group,all number of reversion mutation had no significant up-regulation,and no dose-response relationship was found.Results of CHO-K1 cell chromosomal aberration test indicated that the aberration rates of Jianpi Shengxue Granule group(650,130,and 26 μg/mL)were all less than 5%.Results of micronucleus assay indicated that there was no statistical difference of micronucleus rate between the Jianpi Shengxue Granule group(2 000,1 000,and 500 μg/mL)and negative group(P>0.05).Conclusion:No genotoxicity of Jianpi Shengxue Granule was found under the conditions of this study.

Jianpi Shengxue Granule; Genotoxicity; Ames test; Chromosomal aberration test; Micronucleus assay

武漢市“漢陽英才計劃”項目(編號:A3-17)

趙剛(1983—),男,博士,高級工程師,從事藥物新藥開發(fā)、藥理毒理研究,Tel:(027)84523889,E-mail:158200458@qq.com

黃志軍(1972—),男,博士,教授級高級工程師,從事中藥藥理學(xué)研究,Tel:(027)84520229,E-mail:542354589@qq.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.12.061