張文通 魏鳳 李峰 沈志強(qiáng)

摘 要：通過(guò)RA病原學(xué)研究、分子生物學(xué)研究、診斷方法研究、防治研究四個(gè)方面的闡述，了解目前鴨疫里氏桿菌病的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：鴨疫里氏桿菌??；研究進(jìn)展

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.32 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1673-1085（2016）02-0043-06

鴨疫里氏桿菌（Riemerella Aanatipestifer，RA）病，曾名鴨疫巴氏桿菌（Pasteurella AanatiPestifer）病，是家鴨、鵝、火雞及其它家禽和野禽的一種急性、接觸性、敗血性傳染病，又稱為新鴨病、鴨敗血癥、鴨疫綜合癥、鴨疫敗血癥和鴨傳染性漿膜炎。鴨疫里氏桿菌感染發(fā)病率可達(dá)10%～60%，死亡率為30%～90%，是造成養(yǎng)鴨業(yè)經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重的傳染病之一[1]。到目前為止，美國(guó)、英國(guó)、西班牙、澳大利亞、加拿大、德國(guó)、新加坡、泰國(guó)、韓國(guó)等均有本病發(fā)生。我國(guó)，1982年郭璞玉等[2]首次報(bào)道北京郊區(qū)鴨場(chǎng)于1980～1981年曾發(fā)生過(guò)此病，并分離到了病原菌。隨后全國(guó)多個(gè)省份都相繼報(bào)道了此病。

1 RA病原學(xué)研究

1.1 分類(lèi)地位 1932年美國(guó)學(xué)者Henderickson和Hilbert對(duì)病原菌進(jìn)行分離鑒定，并稱之為鴨疫斐佛氏菌（Pfeifferella anatiestlfer）[3]。1954年Bruner和Fabricant通過(guò)比較，建議采用鴨疫莫拉克氏菌（Moraxella anatipestifer）這一名稱[4]。此后，在第七版《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中根據(jù)其形態(tài)與染色特性將其列入巴氏桿菌屬，命名鴨疫巴氏桿菌（Pasteurella AanatiPestifer）。1991年Rossau等對(duì)原來(lái)列入巴氏桿菌屬的鴨疫巴氏桿菌（Rasteorella anatipestifer，RA）與黃桿菌/噬纖維菌群的成員進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)它們具有較多的相似性[5]。1993年Segers等通過(guò)分析RA的rRNA（Segers et al.，1993），進(jìn)一步證實(shí)了以上觀點(diǎn)。但由于RA在蛋白質(zhì)及脂肪酸組成、培養(yǎng)特性、酶活性等許多方面又明顯不同于黃桿菌/噬纖維菌rRNA同源群中關(guān)系較近的其他細(xì)菌，因此Segers等提出將RA歸入黃桿菌/噬纖維菌rRNA同源群，并建議單列一屬，稱為里氏桿菌屬，其代表種為鴨疫里氏桿菌，并將該菌所引起的疾病命名為鴨疫里氏桿菌病[6]。

1.2 血清型 目前報(bào)道鴨疫里默氏桿菌共有21個(gè)血清型[7-8]，不同血清型之間缺乏交叉保護(hù)[9]，其中鴨疫里氏桿菌2型是國(guó)內(nèi)外被頻繁分離到的血清型。我國(guó)許多地區(qū)都有分離到本菌的報(bào)道，張大丙等證實(shí)國(guó)內(nèi)存在1、2、6、10、11、13和14共7種血清型[10]。

1.3 生物學(xué)特性 RA菌體呈桿狀或橢圓形，偶見(jiàn)個(gè)別長(zhǎng)絲狀，多為單個(gè)，少數(shù)成雙或鏈狀排列?？尚纬汕v膜，無(wú)芽孢，無(wú)鞭毛。革蘭氏染色陰性，印度墨汁染色可見(jiàn)莢膜著色，瑞氏染色時(shí)大部分細(xì)菌呈兩極著色特性[11]。韋強(qiáng)等通過(guò)電鏡首次觀察到了血清l、2型的RA的固體培養(yǎng)物經(jīng)負(fù)染或超薄切片后可觀察到約1/3的菌體具有特殊的贅生物形態(tài)結(jié)構(gòu)；其內(nèi)部有類(lèi)似菌體的結(jié)構(gòu)，有一層類(lèi)似于菌體的“細(xì)胞壁”，但較薄[12]。

本菌在巧克力瓊脂、血液瓊脂和胰酶大豆瓊脂中生長(zhǎng)良好。多次繼代培養(yǎng)可在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，在麥康凱瓊脂上不生長(zhǎng)。在胰酶大豆瓊脂中添加0.05%酵母浸出物，5%新生牛血清以及含有5%～10%的CO2環(huán)境可促進(jìn)其生長(zhǎng)。血液瓊脂上培養(yǎng)24h，形成邊緣整齊、透明、無(wú)色素的光滑型菌落，RA的最適生長(zhǎng)溫度是37℃。

本菌不同的血清型，即使同一血清型的不同菌株的生化反應(yīng)也不盡相同?？偟膩?lái)說(shuō)，不發(fā)酵葡萄糖、蔗糖，也不發(fā)酵半乳糖、乳糖、果糖、木糖、甘露醇、山梨醇、甘露糖和棉實(shí)糖。極少數(shù)菌株發(fā)酵麥芽糖和肌醇。硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用、VP、甲基紅試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生、尿素分解均為陰性。氧化酶、觸酶試驗(yàn)為陽(yáng)性。多不溶血，多液化明膠[11]。

2 RA的分子生物學(xué)研究

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從16SrRNA、外膜蛋白、莢膜、質(zhì)粒、耐藥性、致病性及相關(guān)因子等方面開(kāi)展了RA的分子生物學(xué)研究。Subramandam等對(duì)4株RA編碼16srRNA的基因序列的PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析，同時(shí)與產(chǎn)吲哚黃桿菌、粘黃桿菌等相關(guān)細(xì)菌進(jìn)行了同源性分析，結(jié)果表明4株RA處于黃桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上；對(duì)PCR擴(kuò)增的16SrRNA基因經(jīng)限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分析表明：即使是同一血清型的不同RA菌株，16SrRNA基因仍有差異[13]。Rimler等運(yùn)用DNA指紋技術(shù)進(jìn)行了鴨疫里默氏菌DNA指紋圖譜的研究，用限制性核酸內(nèi)切酶HinfⅠ對(duì)從美國(guó)、英國(guó)、澳大利亞、加拿大、德國(guó)和以色列6個(gè)國(guó)家分離的89株RA進(jìn)行了DNA指紋圖譜分析，結(jié)果表明不同來(lái)源的RA其DNA指紋圖譜存在明顯差異，即使是同一地區(qū)同一禽類(lèi)分離的RA菌株，其DNA指紋圖譜也有所不同[14]。

Chang等對(duì)60株RA的質(zhì)粒進(jìn)行了分子生物學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)77%的RA菌株至少帶有1個(gè)質(zhì)粒，60%的RA菌株含3.9kb的質(zhì)粒，12%的RA菌株含6.5kb和16.0kb的質(zhì)粒，5%的RA含2.0kb、16.0kb、18.0kb的質(zhì)粒；23%的RA菌株不帶質(zhì)粒。他們挑選了3.9kb的質(zhì)粒作DNA序列分析，發(fā)現(xiàn)G+C含量為27%，含3966bP和4個(gè)開(kāi)放讀碼區(qū)（ORF）即vapDI、VapD2、RepAI、RepA2。RA質(zhì)粒的RepA讀碼區(qū)的上游有一富含AT的區(qū)段，并連有4個(gè)由2lbp組成的完全重復(fù)的區(qū)段和1個(gè)由20bp組成的不完全重復(fù)的區(qū)段。對(duì)含或不含質(zhì)粒的RA菌株進(jìn)行VapD1序列的PCR檢查，表明VapD1序列僅存在于含質(zhì)粒的RA菌株中[15]。

目前國(guó)內(nèi)外己經(jīng)對(duì)RA的一些免疫原性蛋白進(jìn)行了研究，蘇敬良等用提純的RA莢膜免疫7日齡北京雛鴨后，可100%抵抗同源菌株攻擊[16]。程安春等對(duì)流行于我國(guó)的l、2、4和5型RA外膜蛋白多肽的組成及免疫原性進(jìn)行了研究，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)1型RA的44KDa、2型的40KDa、4型的75KDa和5型的39KDa外膜蛋白是主要的免疫原蛋白[17]。Subramaniam等對(duì)RA的一種優(yōu)勢(shì)免疫原性O(shè)mpA的特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)OmpA由外膜蛋白樣結(jié)構(gòu)構(gòu)成的羧基端保守區(qū)和一個(gè)氨基端可變區(qū)組成，這與其他一些革蘭氏陰性菌的OmpA結(jié)構(gòu)相似，所不同的是RA的OmpA具有6個(gè)EF一手銬結(jié)合域和2個(gè)PEST結(jié)構(gòu)域，這些基序的出現(xiàn)表明它們?cè)谕饽さ鞍锥玖Ψ矫嬗兄匾饔?，而且編碼外膜蛋白的基因存在于RA標(biāo)準(zhǔn)株和所有血清型參照株中[18]。

劉穎等用PCR技術(shù)擴(kuò)增26株鴨疫里默氏菌的部分螺旋酶gyrA序列，通過(guò)與大腸桿菌（ABA36537）比較氨基酸序列找到了對(duì)喹諾酮類(lèi)抗生素耐藥菌株的基因突變熱點(diǎn)和突變規(guī)律[19]。

Weng等報(bào)道了一個(gè)3.9kb的質(zhì)粒pCFC1和一個(gè)5.6kb質(zhì)粒pCFC2，分子生物學(xué)研究表明，質(zhì)粒pCFC2很可能與RA的致病性相關(guān)[20]。Crasta等首次對(duì)RA的CAMP溶血素進(jìn)行研究，鑒定出CAMP溶血素決定簇所需的最小DNA片段為3566bp，含一個(gè)l026bp的ORF。將CAMP基因cam經(jīng)PCR擴(kuò)增后克隆到E.coli M15表達(dá)CAMP溶血素，SDS-PAGE和Western-blot分析證實(shí)了重組菌表達(dá)一種37KDa的蛋白，該蛋白具有免疫原性，能協(xié)同其它細(xì)菌產(chǎn)生溶血作用，可能與致病性有關(guān)[21]。

3 RA診斷學(xué)研究

3.1 RA的流行病學(xué)研究 本病主要感染家鴨，曾有報(bào)道鵝、火雞自然暴發(fā)鴨疫里默氏桿菌病，從雛雞、珍珠雞、鶴鶉、澳州長(zhǎng)尾錐和其它水禽中也曾分離到鴨疫里默氏桿菌。1～8周齡的鴨都易感，但尤以2～3周齡的小鴨最易感。

本病一年四季均可發(fā)生，但以冬春季發(fā)病最多?？赏ㄟ^(guò)污染的飼料、飲水、飛沫、塵土經(jīng)呼吸道、消化道、刺破的足部皮膚的傷口、蚊子叮咬等多種途徑傳播，庫(kù)蚊是RA的重要傳播媒介。本病潛伏期的長(zhǎng)短與菌株的毒力、感染途徑以及應(yīng)激等因素有關(guān)。

3.2 臨床診斷及病理變化 病鴨精神沉郁，食欲下降，縮頭垂翅，羽毛蓬松，呼吸困難，閉目，眼鼻分泌物增多，呼吸困難，腿軟，走動(dòng)困難，多伏地。部分病鴨關(guān)節(jié)腫大，跛行或頭頸扭斜，并伴有頭部震顫等神經(jīng)癥狀，扎堆，拉黃色或黃綠色稀糞。2～3d內(nèi)死亡，死前出現(xiàn)痙攣、搖頭、角弓反張等癥狀。病死鴨剖檢發(fā)現(xiàn)：心包變厚，內(nèi)有大量含纖維素性絮狀滲出液體；心包膜和胃腸粘膜表面有厚薄不均的纖維蛋白粘附；心外膜、心冠肝、脾、胰、肌胃及腸管出血明顯；肝腫大呈暗紅色或土黃色，表面大小不一的壞死灶；鼻腔有多量的粘液，關(guān)節(jié)面粗糙，附有干酪樣物質(zhì)，關(guān)節(jié)變厚，內(nèi)有大量淡紅色液體；腦膜、腦組織充血、出血。

3.3 診斷方法研究

3.3.1 分離鑒定 適于分離的病料有病鴨的心血、腦、氣囊、肝和病變的滲出物。根據(jù)其在普通培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，及其培養(yǎng)和生長(zhǎng)特性、生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果等可作出判定。

3.3.2 瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（Agargeli～unodiffosion，AGID）簡(jiǎn)稱瓊擴(kuò)試驗(yàn)，是在瓊脂凝膠中進(jìn)行的抗原抗體免疫沉淀反應(yīng)，可用于血清學(xué)定型，簡(jiǎn)便快捷。

3.3.3 凝集試驗(yàn) 凝集試驗(yàn)分為玻片凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)兩種。應(yīng)用玻片凝集試驗(yàn)可以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的快速鑒定，并對(duì)分離到的菌株的血清型進(jìn)行大范圍的粗略篩選，但要準(zhǔn)確定型還必須依賴于試管凝集試驗(yàn)。試管凝集試驗(yàn)可以更準(zhǔn)確的進(jìn)行血清型鑒定、血清流行病學(xué)調(diào)查以及抗體效價(jià)檢測(cè)。當(dāng)供試菌與參照菌的凝集效價(jià)相等或僅差l個(gè)滴度時(shí)，一般可認(rèn)為二者屬于相同的血清型；當(dāng)凝集效價(jià)相差3個(gè)或3個(gè)以上滴度時(shí)，一般可認(rèn)為該二者屬于不同的血清型[22]。

3.3.4 熒光抗體法 郭玉璞等應(yīng)用直接熒光抗體法檢測(cè)急性病例，涂片標(biāo)本上可見(jiàn)黑暗的背景有帶綠色熒光的菌體，本法特異性強(qiáng)，快而簡(jiǎn)便，效果良好[23]。朱琪等建立間接免疫熒光抗體試驗(yàn)，對(duì)發(fā)病小鴨的檢測(cè)結(jié)果表明，鴨腦組織鼻竇及肝臟等細(xì)菌檢出率較高[24]。

3.3.5 PCR快速檢測(cè)法 胡清海等根據(jù)已發(fā)表的鴨疫里默菌15型CVLI10/89株編碼42KDa主要外膜蛋白的基因序列，在國(guó)內(nèi)外首次成功地建立了運(yùn)用一對(duì)引物檢測(cè)出不同鴨疫里默菌的PCR方法，可以用于該菌的快速診斷和快速鑒別診斷以及流行病學(xué)調(diào)查[25]。2006年曲豐發(fā)等建立了基于鴨疫里氏桿菌16SrRNA PCR檢測(cè)方法[26]。2007年楊苗等根據(jù)鴨疫里氏桿菌16SrRNA基因保守序列設(shè)計(jì)特異引物建立了一種檢測(cè)鴨疫里氏桿菌的PCR方法[27]。楊建遠(yuǎn)等根據(jù)GenBank中25株RA的外膜蛋白A（OmpA）基因序列，在其高度保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，建立了一種檢測(cè)鴨疫里氏桿菌的PCR方法[28]。2010年馮金牛等利用16SrRNA保守序列設(shè)計(jì)特異引物PCR擴(kuò)增鑒定鴨疫里氏桿菌，測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與GenBank上分布的RA的16SrRNA同源性達(dá)到99.99%[29]。

3.3.6 間接免疫酶組織化學(xué)法 劉維平等應(yīng)用鴨源血清1型鴨疫里默菌作為抗原，免疫兔制備兔抗RA的lgG并加以純化，建立了檢測(cè)雛鴨感染鴨疫里默菌的間接免疫酶組織化學(xué)法（indirect inununo histochemical technique），在對(duì)雛鴨人工感染RA病例和疑似病例的各組織器官進(jìn)行檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，RA抗原分布于細(xì)胞漿、組織間隙和血液[30]。

3.3.7 間接ELISA法 張鶴曉等用裂解的l型RA菌體作為包被抗原，建立間接ELISA方法，檢測(cè)鴨血清中抗RA抗體[31]。胡清海等用脂多糖（LPS）作為包被抗原，建立了間接ELISA方法，人工感染RA的鴨在感染72h即可檢出抗體[32]。程安春等用超聲裂解法分別制備2型RA的裂解物包被酶標(biāo)版，成功的制備了分別針對(duì)這四種血清型的ELISA方法[33]。Huang等使用一種被推測(cè)為RA表面抗原P45末端片段41KDa的重組蛋白rP45N'作為包被抗原建立的間接ELISA方法能成功的檢測(cè)出1、10、15、19四種血清型的RA和ATCC11845菌株免疫鴨的血清[34]。周祖濤用大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白OmpA建立了RA抗體OmpA-ELISA檢測(cè)方法，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)能夠應(yīng)用于臨床RA抗體檢測(cè)[35]。

4 RA防治研究

加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和環(huán)境衛(wèi)生是最重要的預(yù)防措施。做好鴨舍消毒和通風(fēng)，冬天要做好保暖等措施。在此基礎(chǔ)上還包括藥物防治和疫苗防治。

4.1 藥物防治 鴨RA病藥物防治主要為抗生素和磺胺類(lèi)藥物，但RA對(duì)抗生素的敏感性各地報(bào)道不盡相同。劉穎等對(duì)全國(guó)各地85株RA菌進(jìn)行藥敏檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，100%對(duì)氨節(jié)西林、阿莫西林等青霉毒類(lèi)藥物和頭孢噻肟、頭孢呋辛、頭孢噻吩等頭孢菌素類(lèi)、西環(huán)素等四環(huán)素類(lèi)藥物敏感[36]。鐘登科等[37]通過(guò)藥敏試驗(yàn)證實(shí)鴨疫里氏桿菌1型對(duì)頭孢曲松、復(fù)方新諾明高度敏感。

4.2 疫苗防治 由于不同血清型對(duì)異型強(qiáng)毒沒(méi)有保護(hù)力或保護(hù)力很低，所以有必要做好RA血清型的監(jiān)測(cè)工作，有利于生產(chǎn)出針對(duì)性強(qiáng)的疫苗。目前國(guó)內(nèi)外RA的疫苗類(lèi)型有以下幾種：

4.2.1 RA滅活菌苗的研究 張鶴曉等用間接ELISA檢測(cè)不同疫苗在免疫鴨后抗體消長(zhǎng)規(guī)律發(fā)現(xiàn)油佐劑的效果最好，甲醛滅活苗二次免疫次之，甲醛滅活苗一次免疫效果最差[31]。黃渝等比較了滅活鋁膠苗、滅活蜂膠苗以及滅活油乳劑苗的免疫效果，結(jié)果表明三種不同佐劑菌苗的保護(hù)效果逐漸增強(qiáng)，但同時(shí)這三種佐劑的副作用也逐漸增加[38]。

4.2.2 RA弱毒活菌苗的研究 Sandhu等選擇1、2、5型的RA自然弱毒株，并經(jīng)鴨體回傳10代無(wú)毒力返強(qiáng)，用這些弱毒株研制了三價(jià)活毒苗，經(jīng)飲水和氣霧免疫1日齡雛鴨，對(duì)攻毒和野外感染均有較好的保護(hù)效果[39]。Higgins等在研究不同RA疫苗的免疫應(yīng)答機(jī)制時(shí)，選用分離的1型RA野毒株，經(jīng)連續(xù)62代的肉湯和血瓊脂培養(yǎng)基傳代，篩選出弱毒株，通過(guò)皮下注射、氣霧和飲水途徑免疫雛鴨，應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測(cè)血清抗體，通過(guò)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)（LTT）研究其細(xì)胞免疫應(yīng)答，結(jié)果該弱毒菌苗不僅產(chǎn)生長(zhǎng)時(shí)間高水平抗體，而且引發(fā)了較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答[40]。

4.2.3 亞單位疫苗 林世棠等也對(duì)亞單位成分（莢膜和外膜蛋白）進(jìn)行了提取并測(cè)定其免疫原性，結(jié)果表明RA亞單位成分免疫保護(hù)效果與提取物中的蛋白濃度呈正相關(guān)[41]。Pathanasophon用1、19型RA培養(yǎng)基無(wú)細(xì)胞濾液（Cell-free CultureFiltrate，CCF）免疫雛鴨后能很好地抵抗同型菌株的攻擊，CCF制作的疫苗有免疫原性，可能是濾液中的亞單位成分在發(fā)揮作用，因?yàn)镽A在培養(yǎng)過(guò)程中有部分莢膜要分離菌體[42]。蘇敬良采用十六烷基二甲醛澳化按（CTAB）提取出1型RA的莢膜成分，其粗提物與純化物免疫雛鴨后對(duì)同型菌株的攻毒保護(hù)率分別為90%和70%[43]。呂敏娜等證實(shí)，主要成分為蛋白質(zhì)多糖復(fù)合物的可溶性莢膜抗原較全菌滅活苗有著更好的免疫效果[44]。蘇敬良等提取了l型RA的OmpA，通過(guò)研究也證明RA外膜蛋白是具有良好免疫保護(hù)效果的一種亞單位成分[45]。

4.2.4 改進(jìn)的液體培養(yǎng)和鴨胚培養(yǎng)工藝苗 鮑國(guó)連等用從浙江省發(fā)病鴨廠病死鴨中分離鑒定的RA-J、RA-L菌株研制疫苗，采用改進(jìn)的液體和鴨胚培養(yǎng)工藝進(jìn)行增菌培養(yǎng)，制備的疫苗有較高的保護(hù)率。另外，他們還發(fā)現(xiàn)疫苗中加入左旋咪唑作為免疫增強(qiáng)劑，可促進(jìn)外周免疫活性細(xì)胞功能，誘導(dǎo)早期T細(xì)胞分化成熟，促進(jìn)淋巴因子產(chǎn)生，從而增強(qiáng)免疫功能[46]。

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Abstract：By etiology， molecular biology， diagnostic methods， revention research of RA described in four areas， understand the current duck anatipestifer disease research.

Key words：Riemerella anatipestifer； Research