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轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的單克隆抗體OX26偶聯(lián)三氧化二砷免疫脂質(zhì)體對(duì)鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的體外抑制作用

陳巖郭美華海鑫張旭

【摘要】目的探討轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體(OX26)偶聯(lián)三氧化二砷(As2O3)免疫脂質(zhì)體對(duì)鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的體外抑制作用。方法體外培養(yǎng)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為鹽水組，As2O3(6 μmol·L-1)組和OX26偶聯(lián)As2O3脂質(zhì)體(6 μmol·L-1)組；采用四唑鹽比色法(MTT)，檢測(cè)OX26偶聯(lián)As2O3免疫脂質(zhì)體對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，DAPI染色觀察OX26偶聯(lián)As2O3免疫脂質(zhì)體對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞促凋亡的影響。免疫印跡法檢測(cè)OX26偶聯(lián)As2O3免疫脂質(zhì)體對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞膠質(zhì)瘤膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果MTT比色法檢測(cè)顯示：OX26偶聯(lián)As2O3免疫脂質(zhì)干預(yù)對(duì)腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的抑制率為40.21%，顯著高于As2O3組的25.77%，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；核染顯示：與鹽水組和As2O3組比較，OX26偶聯(lián)As2O3免疫脂質(zhì)組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的光密度和面密度值顯著減少，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Westernblot檢測(cè)顯示：OX26偶聯(lián)As2O3免疫脂質(zhì)組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞GFAP蛋白的表達(dá)較鹽水組和As2O3組少。結(jié)論OX26偶聯(lián)As2O3免疫脂質(zhì)體對(duì)鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有明顯的體外抑制作用，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和GFAP蛋白的表達(dá)相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】三氧化二砷；轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的單克隆抗體；腦膠質(zhì)瘤；膠質(zhì)瘤膠質(zhì)纖維酸性蛋白

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:007～009)

我們前期研究通過(guò)制備As2O3脂質(zhì)體，并且證實(shí)As2O3脂質(zhì)體可更顯著地誘導(dǎo)鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)載瘤鼠的存活時(shí)間，其療效優(yōu)于單純的As2O3治療[1]。本研究在前期基礎(chǔ)上，研究了轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的單克隆抗體(OX26)偶聯(lián)As2O3對(duì)C6 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)的抑制作用，為臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1　材料

日本關(guān)西醫(yī)科大學(xué)提供的大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株；As2O3注射液(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)伊達(dá)制藥廠)；注射級(jí)大豆卵磷脂(上海太偉藥業(yè))；膽固醇、維生素E粉、葡聚糖聚50水凝膠(Sigma 公司)；溴化二甲噻唑二苯四氮唑藍(lán)(MTT)、多聚賴氨酸、二甲基亞砜購(gòu)自Sigma公司；DMEM干粉培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清為杭州四季青生物制品公司產(chǎn)品；山羊血清封閉液、DAPI、第一抗體為兔抗GFAP均購(gòu)于博士德生物工程有限公司；兔抗β-Actin多克隆抗體為上?？婆d生物科技公司產(chǎn)品，批號(hào)A10938R；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗為北京中杉金橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品，批號(hào)A0208；倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，IX70-S8F)；酶標(biāo)儀AD340型( BECKMAN 公司)。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1As2O3脂質(zhì)體制備[1]將卵磷脂、膽固醇和維生素E按照20∶5∶1的比例稱(chēng)量，放置于茄形瓶，加入適量氯仿溶解，均勻混合，40 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；精密稱(chēng)取適量As2O3，于去離子水中加熱溶解，制成溶度為1 mg/mL的As2O3溶液，將該溶液加入上述磷脂和膽固醇脂質(zhì)膜的茄形瓶中，旋轉(zhuǎn)水化15 min，冰浴超聲，得到As2O3脂質(zhì)體溶液，通過(guò)具體的超聲時(shí)間和強(qiáng)度制成粒徑為0.25～1 μm的單層脂質(zhì)體。As2O3脂質(zhì)體的包封率參照《中華人民共和國(guó)藥典》采取銀鹽法測(cè)定[2]。

1.2.2OX26偶聯(lián)As2O3免疫脂質(zhì)體制備將轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體 OX26 按照 Traut's 試劑盒的實(shí)驗(yàn)步驟巰基化，將As2O3脂質(zhì)體凍干產(chǎn)品以蒸餾水重分散，加入巰基化的 OX26，室溫下氮?dú)獗Ｗo(hù)進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，得到OX26偶聯(lián)As2O3免疫脂質(zhì)體制備。

1.2.3C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)及處理[3]用含10 ml/L新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)：C6細(xì)胞分裝于培養(yǎng)瓶，加入適量DMEM培養(yǎng)液，置入37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱，培養(yǎng)生長(zhǎng)至所需的細(xì)胞數(shù)，在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大約80%時(shí)，用0.25 mL/L胰酶消化，離心，Hank's液吹打制成細(xì)胞懸液，接種。苔盼藍(lán)排斥試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力大于95%，接種前，收獲指數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，加入細(xì)胞懸浮，終濃度為每15 μL含2×106個(gè)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，再接種于12孔板或96孔板。

1.2.4實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)隨機(jī)將培養(yǎng)的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞分為3組：鹽水組，As2O3組和OX26偶聯(lián)As2O3脂質(zhì)體組。分別給予生理鹽水、As2O3液(6 μmol·L-1)和OX26偶聯(lián)As2O3免疫脂質(zhì)(6 μmol·L-1)進(jìn)行干預(yù)；1次/d，3組均干預(yù)2周；然后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.5MTT檢測(cè)[4]在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞終止培養(yǎng)前3 h ，每孔加入MTT溶液20 μl，常規(guī)繼續(xù)培養(yǎng)3 h，吸去孔板內(nèi)液體，加DMSO液，于搖床輕搖10 min，采用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)492 nm設(shè)置下檢測(cè)每孔腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞OD值。細(xì)胞抑制率(%)= [(對(duì)照組OD 值-治療組OD 值)/對(duì)照組OD 值]×100%。

1.2.6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡檢測(cè)采取細(xì)胞核(DAPI)染色法，吸取3組培養(yǎng)板內(nèi)的液體，分別加入DAPI(1∶1 000)各1 mL，5 min，用PBS漂洗3次，熒光顯微鏡下觀察和拍照。圖片處理采用C8圖像分析儀，每組細(xì)胞隨機(jī)選擇10張圖片檢測(cè)，每張圖片隨機(jī)選取10個(gè)視野，記錄每個(gè)視野下細(xì)胞光密度和面密度值。

1.2.7免疫印跡法檢測(cè)無(wú)菌條件下細(xì)胞經(jīng)裂解，BCA法蛋白定量，蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，硝酸纖維素膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和封閉，一抗兔抗GFAP(1∶8 000)孵育過(guò)夜，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶2 500)孵育，蛋白條帶用化學(xué)發(fā)光法顯示，膠片顯影、定影；采用β-actin作為內(nèi)參。圖片分析應(yīng)用NIH Image軟件。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1　OX26偶聯(lián)As2O3免疫脂質(zhì)對(duì)腦膠質(zhì)瘤抑制作用

MTT 法檢測(cè)顯示：相對(duì)于鹽水組，兩組干預(yù)后腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的OD值分別為0.72±0.18和0.58±0.12，明顯小于鹽水組(P<0.01)；與As2O3組比較，OX26偶聯(lián)As2O3免疫脂質(zhì)干預(yù)對(duì)腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的抑制率為40.21%，顯著高于As2O3組的25.77%，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表 1。

表1　OX26偶聯(lián)As2O3免疫脂質(zhì)對(duì)腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的抑制

2.2　OX26偶聯(lián)As2O3免疫脂質(zhì)促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤凋亡

核染顯示：相對(duì)于鹽水組，兩組干預(yù)后，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的核染色明顯減少。與As2O3干預(yù)比較，OX26偶聯(lián)As2O3免疫脂質(zhì)組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的光密度和面密度值顯著減少，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)，見(jiàn)表 2。

2.3　OX26偶聯(lián)As2O3免疫脂質(zhì)對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞GFAP蛋白表達(dá)影響

GFAP蛋白Western blot檢測(cè)顯示：鹽水組GFAP蛋白表達(dá)量較干預(yù)組少，而OX26偶聯(lián)As2O3免疫脂質(zhì)組GFAP蛋白表達(dá)量最多，見(jiàn)圖1。

表2　OX26偶聯(lián)As2O3免疫脂質(zhì)對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的

圖1　蛋白印跡法檢測(cè)各組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GFAP的表達(dá)

3　討論

膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性分布，手術(shù)治療未能將其徹底清除，易復(fù)發(fā)，且術(shù)后的放化療對(duì)患者的損害大[5]。探索新的有效治療方法和藥物是亟待解決的臨床難題。

As2O3作為傳統(tǒng)中藥砒霜的有效成份，已廣泛用于臨床白血病手術(shù)的化療。但是，單純的砷劑有治療代謝快、效用時(shí)間較短等缺點(diǎn)[6]。研究證實(shí)，脂質(zhì)體具有對(duì)癌細(xì)胞的靶向性高，毒副作用低，藥效高和生物降解性和生物相容性好等特點(diǎn)[1]。脂質(zhì)體能夠延緩藥物清除，有利于向病變組織分布，且局部靶向作用可極大提高藥物的作用療效[7]。研究表明，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體大量位于腫瘤細(xì)胞的表面，是腫瘤靶向轉(zhuǎn)運(yùn)的重要靶標(biāo)[8]。體內(nèi)內(nèi)源性轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量較高，與受體的結(jié)合接近飽和水平，所以轉(zhuǎn)鐵蛋白本身并不適合作為轉(zhuǎn)運(yùn)體。在本研究中，我們通過(guò)合成OX26偶聯(lián)As2O3脂質(zhì)體，極大提高了干預(yù)效果。本研究結(jié)果顯示，OX26偶聯(lián)As2O3脂質(zhì)體對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外具有明顯抑制作用，且能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，上述作用均優(yōu)于單純的As2O3干預(yù)。

研究治療方法和藥物干預(yù)對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用機(jī)制對(duì)臨床治療具有重要價(jià)值。GFAP為中間絲蛋白，特異性表達(dá)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞[9]。膠質(zhì)瘤細(xì)胞GFAP的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)往往標(biāo)志著瘤細(xì)胞趨向于好[10]。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，GFAP與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的分化程度密切相關(guān)，即分化程度越差，GFAP表達(dá)越少甚至不表達(dá)[11]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，OX26偶聯(lián)As2O3脂質(zhì)體對(duì)膠質(zhì)瘤體外干預(yù)后，GFAP蛋白表達(dá)較鹽水對(duì)照組合單純As2O3作用更多。提示了OX26偶聯(lián)As2O3脂質(zhì)體對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外抑制作用的作用機(jī)制。

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(編輯：吳小紅)

Inhibitory Effect of OX26 and As2O3Immunoliposome on Viability of

Glioma Cell in Rats in Vitro

CHENYan,GUOMeihua,HAIXin,etal.TheFirstHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin,150001

【Abstract】ObjectiveTo observe the inhibitory effect of OX26 and As2O3immunoliposome on viability of glioma cell in rats in vitro.MethodsC6 glioma cells were cultured in vitro and divided into saline water group,As2O3group,and combination group of OX26 and As2O3immunoliposome.MTT colorimetric method was used to detect inhibitory effect of combination of OX26 and As2O3immunoliposome on viability of glioma cells.DAPI staining was used to observe apoptosis of combination of OX26 and As2O3immunoliposome on glioma cells.Western blot method was used to evaluate expression of glial fibrillary acidic protein(GFAP) combination of OX26 and As2O3immunoliposome on glioma cells.ResultsMTT method showed inhibitory rate of combination of OX26 and As2O3immunoliposome on glioma cells was 40.21%,which was higher than As2O3group 25.77%(P<0.05).Compared with saline water group and As2O3group,optical density and areal density of glioma cells in combination group of OX26 and As2O3immunoliposome were obviously decreased by DAPI staining(P<0.01).Western blot method showed that GFAP expression in combination group of OX26 and As2O3immunoliposome was less than saline water group and As2O3group.ConclusionInhibitory effect of combination of OX26 and As2O3immunoliposome on viability of glioma cell rats in vitro is remarkable,and its mechanism may be related with promote apoptosis and GFAP expression of glioma cells.

【Key words】As2O3；OX26；Glioma；Glial fibrillary acidic protein(GFAP)

中圖分類(lèi)號(hào)：R730.264

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2016)01-0007-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.01.003

通訊作者：張旭

基金項(xiàng)目：作者單位:150001 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院

收稿日期(2015-01-09修回日期 2015-05-04)