崔榮花　王美清　彭大為　李建旺　張曙波　謝宗宙　程小珍　毛山山　元建華

rAd-p53聯合順鉑對胃癌細胞生長及KAI1/CD82蛋白表達的影響

崔榮花王美清彭大為李建旺張曙波謝宗宙程小珍毛山山元建華

作者單位:570208 中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院

【摘要】目的觀察rAd-p53、順鉑(DDP)單獨及聯合作用于人胃癌SGC7901細胞后，對腫瘤細胞增殖凋亡情況、KAI1/CD82蛋白表達情況的影響。方法rAd-p53、DDP單獨及聯合作用于胃癌SGC7901細胞株24、48、72 h后，CCK-8法測定SGC7901細胞體外增殖活性，流式細胞術檢測細胞凋亡率，免疫組化法檢測KAI1/CD82蛋白表達情況。結果rAd-p53、DDP單獨及聯合作用于SGC7901細胞后，細胞增殖被抑制，并呈劑量和時間依賴性，且兩藥聯合組細胞增殖抑制率明顯高于單用組，與陰性對照組相比差異均有統計學意義(P<0.05)；rAd-p53、DDP單獨及兩藥聯合作用SGC7901細胞48h后，細胞凋亡率為36.94%±0.78%、28.79%±2.37%，69.26%±0.63%；rAd-p53、DDP單獨及兩藥聯合均可上調KAI1/CD82蛋白表達，且兩藥聯合組更明顯。結論rAd-p53、DDP單獨及兩藥聯合均可抑制胃癌SGC7901細胞的生長，誘導其凋亡，二者聯合對胃癌細胞的抑制作用增強，rAd-p53可能通過上調KAI1/CD82的表達誘導SGC7901細胞凋亡，同時增強DDP的抗腫瘤作用。

【關鍵詞】重組人P53腺病毒注射液；SGC7901；KAI1/CD82

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:010～013)

胃癌是世界上威脅人類健康最常見的惡性腫瘤之一，多數病例確診時已屬中、晚期，臨床治療效果欠佳。目前針對其相關生物靶點的基因治療的研究很少，因此尋找胃癌治療的新策略迫在眉睫。順鉑為臨床上胃腸道腫瘤化療常用藥物，但其藥理作用的發(fā)揮往往需要很高劑量，毒副作用很大，其很多患者出現耐藥，因此無法通過進一步增加劑量來提高療效。人類p53基因在惡性腫瘤的激化演變過程中起著重要作用，有野生型和突變型兩種，突變型p53能促進細胞惡性轉化，研究證實其在胃癌中突變率達32℅，它的缺失與突變與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、預后有密切的關系[1-2]。重組人p53腺病毒注射液(Recombinant Human adenovirus p53 injection，rAd-p53)-今又生(Gendicine)是世界上第一個獲準上市的腫瘤基因治療藥物，由正常人腫瘤抑制基因p53和改構的5型腺病毒基因重組而成，其中腺病毒起載體作用，攜帶治療基因p53進入靶細胞內發(fā)揮作用[3]。KAI1/CD82是近幾年國內外研究比較熱的1種特異性腫瘤抑制基因,最初在研究前列腺癌時發(fā)現[4],研究證實其能夠通過多種通路抑制腫瘤侵襲轉移[5]，且其與p53在在惡性腫瘤中的表達及相關性國內外研究不一，因此本研究擬觀察rAd-p53、DDP單藥及聯合對胃癌SGC7901細胞的生長增殖、凋亡作用，并觀察KAI1/CD82蛋白表達情況，為rAd-p53治療胃癌提供更多的理論依據，為進一步開發(fā)胃癌的靶向治療提供新的思路。

1材料與方法

1.1　材料

人胃癌SGC7901細胞株由海口市人民醫(yī)院中心實驗室保存，重組人p53腺病毒注射液購于深圳市賽百諾基因技術公司，順鉑購于云南個舊藥業(yè)股份有限公司，CCK-8為日本同仁化學研究所產品，兔抗人KAI1/CD82單克隆抗體為北京博奧森公司產品，AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒為Biovision公司產品，RPMI1640為美國Gibco公司產品，胰酶、DMSO為美國Sigma公司產品。

1.2　方法

1.2.1細胞培養(yǎng)細胞常規(guī)培養(yǎng)于含有10%小牛血清培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細胞鋪滿瓶底時，以0.25%胰酶消化傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2實驗分組實驗分為rAd-p53組(濃度分別為5×108vp/ml、 5×109vp/ml、5×1010vp/ml)；DDP組(濃度分別為2.5 mg/L、5mg/L、7.5 mg/L)；兩藥聯合組(濃度分別為5×108vp/ml +2.5 mg/L，5×109vp/ml +5 mg/L，7.5 mg/L+ 5×1010vp/ml)；同時設陰性對照組。

1.2.3CCK-8法檢測胃癌細胞增殖抑制情況取對數生長期的SGC7901細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，置培養(yǎng)箱中待24 h細胞貼壁生長后棄上清，按照1.2.2實驗分組設計分組，分別加入不同濃度的rAd-p53、DDP單藥及聯合用藥，每組設6個復孔，重復2板，分別培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h后棄上清，每孔加入CCK-8溶液10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出培養(yǎng)板，酶標儀測定450 nm處的吸光度，計算抑制率：抑制率=(1-給藥組OD值/空白組OD值)×100%。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡取對數生長期SGC7901細胞以每孔2×105個/ml的細胞密度接種于6孔板，分設陰性對照組，DDP 7.5 mg/l組、rAd-p53 5×1010組、DDP 7.5mg/l+ rAd-p53 5×1010組，干預48 h后收集細胞，胰酶消化離心細胞，1 000 rpm/min，4 ℃離心5 min棄上清，PBS洗滌2次后,將細胞重懸于500 μl Binding Buffer中，加入10 μl AnnexinV-FITC和5 μl碘化丙啶(PI)，輕輕混勻,室溫避光5 min，收集進行流式細胞術檢測。

1.2.5免疫細胞化學SP法檢測SGC7901細胞中各蛋白的表達取對數生長期SGC7901細胞以每孔2×105個/ml的細胞密度接種于每孔覆有6張蓋玻片的6孔板，每孔2 ml，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，待24 h細胞貼壁生長后，吸除培養(yǎng)液，加藥干預，分設陰性對照組、DDP 7.5 mg/l組、rAd-p53 5×1010組、DDP 7.5 mg/l+ rAd-p53 5×1010組，每組設3個復孔，每組每孔分別加入含有rAd-p53、DDP及兩者混合液的培養(yǎng)液各2 ml，繼續(xù)培養(yǎng)48 h取出玻片，PBS沖洗，10%中性甲醛固定20 min，晾干后每組取3張蓋玻片進行染色。

1.3　統計學處理

應用SPASS 16.0進行統計分析,各組數據以mean±SD表示,組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1　單獨及聯合應用rAd-p53、DDP對SGC7901細胞生長的影響

不同濃度的rAd-p53、DDP單藥及聯合用藥作用于SGC7901細胞24、48及72 h后，細胞的生長受到不同程度的抑制，與對照組相比有統計學意義(P<0.05)，其抑制率隨濃度增加和時間的延長逐漸升高，且兩藥聯合組抑制率均大于rAd-p53和DDP單藥作用抑制率，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1、2、3。

表1　不同濃度rAd-p53作用不同時間對SGC7901細胞抑制作用

A為陰性對照組，B為5×108vp/ml組，C為5×109vp/ml組，D為5×1010vp/ml組；與對照組比較：*為P<0.05，不同時間段組間和組內各濃度比較：▲為P<0.05。

表2　不同濃度DDP作用不同時間對SGC7901細胞抑制作用

A為陰性對照組，B為2.5 mg/L組，C為5 mg/L組，D為7.5 mg/L組；與對照組比較：*為P<0.05；不同時間段組間和組內各濃度比較：▲為P<0.05。

表3　rAd-p53聯合DDP作用不同時間對SGC7901細胞抑制作用

注：A為陰性對照組，B 為5×108vp/ml+2.5 mg/L組，C為5×109vp/ml+5 mg/L組，D為7.5 mg/L+ 5×1010組；與陰性對照組比較：*為P<0.05；不同時間段組間和組內各濃度比較：▲為P<0.05。

2.2　單獨及聯合應用rAd-p53、DDP作用于SGC7901細胞48 h后誘導細胞凋亡

流式細胞儀檢測結果顯示：DDP 7.5 mg/L、rAd-p53 5×1010、DDP 7.5 mg/L+ rAd-p53 5×1010作用于胃癌SGC7901細胞48 h后，細胞凋亡率分別為28.79%±2.37%、36.94%±0.78%、69.26%±0.63%，與陰性對照組(16.72%±1.54%)相比差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.3　單獨及聯合應用rAd-p53、DDP48 h后對SGC7901細胞KAI1/CD82蛋白表達的影響

免疫組化結果顯示,陽性細胞染色為棕黃色，DDP 7.5 mg/L、rAd-p53 5×1010、DDP 7.5 mg/L+rAd-p53 5×1010作用于胃癌SGC7901細胞48 h后，KAI1/CD82蛋白表達率增高，與陰性對照組相比差異具有統計學意義(P<0.05)，且兩藥聯合組其表達率增高情況更明顯(52.43±3.42)(表4)。

表4　rAd-p53、DDP作用SGC7901細胞48 h后KAI1/CD82

注:與陰性對照組比較，*為P<0.05。

3　討論

人類p53基因定位于17號染色體的短臂上(17P13.1)，全長16-20 kb，有11個外顯子和10內含子。它分為野生型和突變型2種，野生型p53被稱為“分子警察”，它具有①抑制細胞的增殖，為細胞周期調節(jié)蛋白；②與病毒蛋白或細胞蛋白結合而抑癌；③監(jiān)視損傷和誘導細胞凋亡；④誘導細胞分化；⑤影響其他基因的表達[6-7]。

突變型p53具有癌基因的作用，促進細胞惡性轉化，p53蛋白的缺失、突變和失活在惡性腫瘤激化演變過程中起著重要作用，其不僅能夠直接作用于腫瘤細胞，還能調控其他癌基因或抑癌基因來影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[8]。因此通過導入野生型p53基因來重建細胞內變異的p53已成為腫瘤治療的新策略[9]，而研究證實60%的胃癌存在p53的突變，p53基因的突變與缺失不僅與胃癌的發(fā)病與預后有關，而且與胃癌細胞對化療的敏感性亦有密切關系[10]。

重組人p53腺病毒注射液(recombinant human adenovirus p53 injection，rAd-p53)-今又生(gendicine)，就是通過腺病毒起載體作用，攜帶治療基因p53進入靶細胞內發(fā)揮抗腫瘤作用。KAI1/CD82是近幾年研究較熱的腫瘤抑制基因，它參與細胞間、細胞與胞外基質間的反應，這兩種反應在腫瘤的侵襲和轉移中起相當重要的作用，研究證實它可以通過參與調節(jié)細胞粘附功能、抑制腫瘤細胞運動遷移，參與免疫應答、增強抗瘤免疫，參與細胞內信號通路等抑制腫瘤細胞生長、轉移[11-12]。目前已有研究證實它是p53基因的靶基因，p53參與調控KAI1/CD82在惡性腫瘤中的表達[13]。但是也有的研究得出了相反的結論。因此本研究我們以胃癌細胞系SGC7901為靶細胞,探討rAd-p53聯合順鉑對胃癌細胞的增殖抑制、誘導凋亡及對KAI1/CD82蛋白表達作用的影響。結果表明rAd-p53、DDP單藥及兩藥聯合均能抑制胃癌細胞生長，同時抑制率隨藥物濃度的增加和作用時間的延長逐漸增加，即呈劑量和時間依賴性，且兩藥聯合抑制作用更強。流式細胞術凋亡率檢測發(fā)現：rAd-p53和DDP作用后隨藥物濃度的增加凋亡率逐漸升高，與陰性對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；聯合用藥組較單藥組作用更明顯。同時通過免疫組化實驗我們發(fā)現，rAd-p53單用及聯合DDP作用后，KAI1/CD82蛋白表達上調，且兩藥聯合后上調作用更為明顯，據此我們推測rAd-p53可增強DDP對胃癌細胞化療作用，具體機制可能與野生型p53重新表達，從而進一步致KAI1/CD82表達上調，這也與既往研究證實p53功能的缺失是KAI1/CD82在進展期腫瘤中表達減少或缺失主要原因之一相一致[14]，因此該研究結果為胃癌的化療聯合基因治療提供了理論基礎，同時也為進一步開發(fā)胃癌的基因靶向治療提供了新的靶點。

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(編輯：吳小紅)

Effect of rAd-p53 and Cisplatin on the Growth of Gastric Cancer Cells and the

Expression of KAI1/CD82 Protein

CUIRonghua,WANGMeiqing,PENGDawei,etal.HaikouMunicipalHospital(XiangyaHaikouHospitalofCentral-SouthUniversity),Haikou,570208

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect and mechanism of rAd-p53 alone or in combination with DDP on growth and apotosis of human gastric cancer cell SGC7901 and expression of KAI1/CD82.MethodsSGC7901cells were treated with rAd-p53 alone or in combination with DDP for 24、48 and 72 hours.Their proliferation was examined by CCK-8 assay.Analyze the apotosis of the tumor cells by flow cytometry(FCM).KAI1/CD82 protein expression was detected by immunohistochemistry staining.ResultsThe proliferation of SGC7901 cell was significantly inhibited in a time-and concentration-dependent manner after treated with rAd-p53 alone or in combination with DDP,the inhibitory effect was significantly enhanced by the combination compared with the negative control group(P<0.05).After treated the with rAd-p53 alone or in combination with DDP treatment for 48 hours，the apotosis rate of SGC7901 cell was 36.94%±0.78%、28.79%±2.37%、69.26%±0.63%.the KAI1/CD82 protein expression was significantly up-regulated after treated with rAd-p53 alone or in combination with DDP，and the role in combined treatment groups was more significant than monotherapy groups.ConclusionThe proliferation of SGC7901 could be inhibited by rAd-p53 alone or in combination with DDP，while their combination enhances the inhibition of gastric cancer cell.rAd-p53 can induce apotosis and inhibit the proliferation of SGC7901 cells,possibly by regulating KAI1/CD82 protein expression，And the 2 agents have synergistic effect.

【Key words】rAd-p53；SGC7901；KAI1/CD82

中圖分類號：R735.2

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)01-0010-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.01.004

基金項目：2012年海南省衛(wèi)生廳項目(瓊衛(wèi)2012LX-16)

收稿日期(2015-04-21修回日期 2015-10-08)