王光麗　周小輝

維生素K2抑制肝癌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究

王光麗周小輝

【摘要】目的探討維生素K2抑制肝癌細(xì)胞(HCC)增殖的可能機(jī)制。方法人肝癌細(xì)胞株(HuH7)傳代培養(yǎng)，以不同濃度的(0、10、30 μM)維生素K2處理HuH-7細(xì)胞96 h，以實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定和Western印跡分析分別測(cè)定血小板衍生因子α受體(PDGFR-α)mRNA和蛋白的表達(dá)；用pluc-a2(PDGFRα啟動(dòng)子熒光素酶載體)轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株(HepG2)，用維生素K2處理24 h后采用熒光素酶測(cè)定其熒光活性。結(jié)果維生素K2抑制HuH7細(xì)胞的增殖；維生素K2以劑量依賴的方式抑制PDGFR-α mRNA和蛋白的表達(dá)；PDGFR-α啟動(dòng)子的活性被維生素K2抑制并呈劑量依賴關(guān)系。結(jié)論維生素K2可能通過下調(diào)PDGFR-α的轉(zhuǎn)錄抑制肝癌細(xì)胞的增殖。

【關(guān)鍵詞】維生素K2；肝癌細(xì)胞；血小板衍生因子α受體

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:014～017)

肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見惡性腫瘤之一。在癌癥相關(guān)的死亡中，肝癌居于第3位[1-2]。到目前為止，包括肝內(nèi)注射給藥在內(nèi)的密集化療已被應(yīng)用于晚期肝細(xì)胞癌的治療。然而，由于復(fù)發(fā)率高及癌組織對(duì)門靜脈的侵襲，患者的愈后并不樂觀[3-4]。

維生素K是1種脂溶性維生素，屬于結(jié)構(gòu)相似的2-甲基-1，4萘醌親脂家族，該家族包括維生素K1、K2和K3[4-5]。迄今為止，維生素K2在日本被廣泛應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥的治療，無明顯副作用[4]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，維生素K2在體內(nèi)外均能抑制包括肝癌細(xì)胞在內(nèi)的眾多腫瘤細(xì)胞的增殖[1,3,6]。另一項(xiàng)臨床研究表明，維生素K2預(yù)防了病毒性肝硬化導(dǎo)致的肝細(xì)胞癌的發(fā)生[7]。然而，維生素K2抑制肝癌增殖的機(jī)制尚不明確。血小板衍生因子受體α(PDGFRα)與配體結(jié)合后，便處于激活狀態(tài)，能引起細(xì)胞內(nèi)特異性底物的磷酸化，這些底物屬于受體酪氨酸激酶家族[8-9]。在基底細(xì)胞癌、腦腫瘤、胃腸道間質(zhì)瘤等多種腫瘤組織中，PDGFR-α的表達(dá)明顯升高。近期的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織比較，肝癌組織中PDGFR-α的表達(dá)也是升高的。小鼠體內(nèi)高表達(dá)肝特異性的PDGFR-α配體PDGF-CC，逐步進(jìn)展為肝硬化與肝癌[10]?？筆DGFR-α單克隆抗體具有抑制多種人與小鼠來源的腫瘤細(xì)胞的增殖，其中包括肝細(xì)胞癌的細(xì)胞系[2]。根據(jù)上述研究結(jié)果，我們假設(shè)PDGFR-α可能在肝癌的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，抑制PDGFR-α可能對(duì)于肝癌治療是有意義的。既往研究顯示維生素K2處理肝癌細(xì)胞(HepG2)后，采用基因芯片技術(shù)測(cè)定發(fā)現(xiàn)PDGFR-α的表達(dá)是下降的[11]。那么維生素K2抗腫瘤增殖的作用，是否可能通過抑制PDGFRα的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的？

1材料與方法

1.1　材料

肝癌細(xì)胞系HuH7與HepG2(ATCC),DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司,美國(guó))，胎牛血清(Signa公司，美國(guó))，維生素K2(Eisai公司，日本)，MTT(Roche公司,美國(guó))，PDGFR-α 與β-actin抗體(Santa Cruz公司，美國(guó))，磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrgen公司，美國(guó))，熒光素酶測(cè)定試劑盒(Promega公司，美國(guó))，RNA提取試劑盒(Nakalai Tesque公司，日本)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司，美國(guó))，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Pierce公司，美國(guó))，ABC試劑盒(Vector,Burlingame,美國(guó))。包含PDGFR-α啟動(dòng)子區(qū)域的質(zhì)粒pluc-a2由日本兵庫(kù)大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Yutaka Kitami教授饋贈(zèng)。維生素K2來自日本Eilai公司，以酒清作為溶劑，配制不同濃度的維生素K2儲(chǔ)液(0.01,0.1,1,10,30 mM)，然后用DMEM-10%胎牛血清(FBS)稀釋至工作液的乙醇濃度3‰。

1.2　方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人肝腫瘤細(xì)胞HuH7與HepG2均用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入10%胎牛血清(FBS)，青霉素(100 U/ml),鏈霉素(100 mg/ml)，在37 ℃含5%CO2飽和濕度的細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合達(dá)80%以上時(shí)，用胰酶(含0.25%胰酶和0.02%EDTA)消化傳代。細(xì)胞經(jīng)不同濃度的維生素K2處理96 h后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組細(xì)胞加入與實(shí)驗(yàn)組終濃度相同的酒精。HuH7用于MTT、熒光定量PCR和western blot，HepG2細(xì)胞用于熒光素酶測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

1.2.2四氮唑藍(lán)比色分析法(MTT比色法)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HuH7細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞密度為2.5×103/孔，加入100 μl培養(yǎng)基。細(xì)胞貼壁后，加入含有不同濃度維生素K2(0.01,0.1,0,1,10,30 μM)的新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞孵育48、72及96 h后，加入MTT1液繼續(xù)孵育4 h，每孔中加入100 μl溶劑DMSO，選擇單波測(cè)定(540 nm)，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定每孔的光密度值，并將OD測(cè)定值轉(zhuǎn)換為相應(yīng)細(xì)胞數(shù)予以計(jì)算。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR采用不同濃度的維生素K2(0,10和30 μM)處理HuH7細(xì)胞96 h后，按照試劑盒說明(Nakalai Tesque,Kyoto,Japan) 提取細(xì)胞總RNA，濃度調(diào)整為0.5 μg/μl。用分光光度計(jì)，在260 nm與280 nm處分別測(cè)定RNA樣本的吸光度值。A260/A280 1.8的樣本中提取1 μg總RNA進(jìn)行RT-PCR。20 μl PCR反應(yīng)體系中加入1 μl cDNA，終濃度為0.2 μM的上游與下游引物，混勻，4 000 rmp瞬間離心，20 ℃反應(yīng)10 min,37 ℃反應(yīng)120 min,85 ℃反應(yīng)5 S,4 ℃反應(yīng)5 min結(jié)束，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR?；虮磉_(dá)水平用ABI PRISM 7700序列測(cè)定系統(tǒng)(Applied Biosystems,Foster City,CA)根據(jù)說明書來檢測(cè)。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 3 s，60 ℃30 s，循環(huán)40次。引物序列如下：PDGFR-α 上游:5'-GACCCTATGCAGCTGCCTTA-3',下游:5'-GGAAGCTACCCTATTCTTATG-3';β-actin上游:5'-CCTAGAAGCATT TGCGGTGG-3',下游:5'-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3'。條帶的強(qiáng)度用光密度分析儀定量測(cè)定，并與參照物β-actin條帶結(jié)果比對(duì)分析。

1.2.4Western bolt用不同濃度的維生素K2(0,10和30 μM)處理HuH7細(xì)胞96 h后，用預(yù)冷的PBS洗2次，加入裂解液冰上裂解(1×PBS,1% NP-40,0.5%去氧膽酸鈉,0.1% SDS,100 μg/mL PMSF,45 μg/mL抑肽酶,100 mM原釩酸鈉)。離心后收集上清，BCA法測(cè)定各樣本蛋白濃度，調(diào)整上樣量一致，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h后，一抗4 ℃過夜，二抗室溫孵育1 h。加入化學(xué)發(fā)光液，暗室中顯影，用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值。目的蛋白條帶的灰度值與本組actin的灰度值相除，對(duì)所得數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.2.5瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與熒光素酶測(cè)定PDGFR-α啟動(dòng)子報(bào)告基因的結(jié)構(gòu)如圖1所示。HepG2細(xì)胞接種于直徑為35 mm的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度為5×103/孔，用含5%FBS-CCS的不含酚紅的DMEM培養(yǎng)。細(xì)胞用4 μg Pluc-a2轉(zhuǎn)染,同時(shí)用0.1 μg of PRL-TK轉(zhuǎn)染，后者用于矯正轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染24 h后，培養(yǎng)基更換為含不同濃度(0,10和30 μM)維生素K2的新鮮培養(yǎng)基，孵育24 h，測(cè)定細(xì)胞裂解液中熒光素酶的活性。

圖1　PDGFR-α啟動(dòng)子報(bào)告基因的結(jié)構(gòu)

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1　維生素K2對(duì)細(xì)胞增殖的作用

前期研究發(fā)現(xiàn)，維生素K2能以劑量依賴的方式抑制HepG2細(xì)胞的增殖[4]。與此相符，維生素K2也能抑制HuH7細(xì)胞的增殖。在HuH7細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，10與30 μM的維生素K2分別抑制細(xì)胞增殖的比例為48.9%與65.7% (P<0.05)?；诖税l(fā)現(xiàn)，我們選擇10與30 μM作為進(jìn)一步研究的藥物濃度。

2.2　維生素K2對(duì)PDGFR-α mRNA表達(dá)的影響

為了探討維生素K2抑制HuH7細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，以及了解PDGFR-α是否在此過程中發(fā)揮作用，我們采用不同濃度的維生素K2(0,10和30 μM)處理HuH7肝癌細(xì)胞96 h后，用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)不同組PDGFR-α mRNA的表達(dá)。如圖2所示，與對(duì)照組相比，10與30 μM的維生素K2處理的細(xì)胞中PDGFR-α mRNA的表達(dá)分別減少了(0.65±0.37)和(0.94±0.05)(P<0.01)。維生素K2以劑量依賴的方式抑制PDGFR-α mRNA的表達(dá)。

圖2　維生素K2對(duì)PDGFR-α mRNA表達(dá)的影響

2.3　維生素K2對(duì)PDGFR-α蛋白表達(dá)的影響

用不同濃度維生素K2處理細(xì)胞96 h后，western blot檢測(cè)不同組PDGFR-α蛋白的表達(dá)，用Quantity One軟件測(cè)定條帶的灰度值。如圖3所示，維生素K2顯著抑制PDGFR-α蛋白的表達(dá)。10 和 30 μM濃度的維生素K2處理組細(xì)胞內(nèi)PDGFR-α的蛋白表達(dá)水平分別為對(duì)照組的(0.53±0.03)和(0.57±0.05)倍(P<0.05)。由此可見，維生素K2不僅抑制PDGFR-α mRNA，同時(shí)也抑制蛋白的表達(dá)。隨后，我們檢測(cè)維生素K2是否也在轉(zhuǎn)錄水平抑制PDGFR-α的表達(dá)。

圖3　維生素K2對(duì)PDGFR-α蛋白表達(dá)的影響

2.4　維生素K2對(duì)PDGFR-α啟動(dòng)子活性的影響

熒光素酶實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)維生素K2對(duì)PDGFR-α啟動(dòng)子區(qū)域活性的作用。PDGFR-α報(bào)告基因質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HuH7細(xì)胞，隨后檢測(cè)熒光素酶的活性。如圖4所示，10和30 μM濃度的維生素K2處理組細(xì)胞內(nèi)PDGFR-α的熒光素酶相對(duì)活性分別為對(duì)照組的(0.75±0.12)和 (0.49±0.38)(P<0.05)。維生素K2抑制了PDGFR-α啟動(dòng)子活性。

圖4　維生素K2對(duì)PDGFR-α轉(zhuǎn)錄的影響

3　討論

研究發(fā)現(xiàn)，維生素K2具有抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用[4,8]。與此相符，我們的研究表明，用維生素K2處理細(xì)胞96 h后，HuH7細(xì)胞的增殖以維生素K2劑量依賴的方式受到抑制。當(dāng)用10 μM的維生素K2處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。細(xì)胞數(shù)量的減少是由于增殖受到抑制，而不是細(xì)胞死亡。因?yàn)椋阽R下并未觀察到培養(yǎng)基中存在大量死亡細(xì)胞的現(xiàn)象。到目前為止，維生素K2抑制肝癌增殖的機(jī)制并不明確。

PDGFR是特異的蛋白酪氨酸激酶細(xì)胞表面受體，有2種亞型，即PDGFR-α和-β。在PDGFR與其相應(yīng)的配體結(jié)合后，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路便被激活[12]。在生長(zhǎng)發(fā)育過程中，PDGFR-α在許多組織中發(fā)揮作用，它參與增殖、形態(tài)發(fā)生、上皮與間質(zhì)的相互作用[11,13]。近期的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，PDGFR-α僅在惡性程度高的肝細(xì)胞腫瘤組織的內(nèi)皮中高表達(dá)[10]。另有研究發(fā)現(xiàn)，以PDGFR-α為靶向的單克隆抗體處理人與小鼠肝癌細(xì)胞，能有效地抑制PDGFR-α的表達(dá)和細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移；同樣的，肝癌小鼠模型中的研究也表明，此單克隆抗體還能延長(zhǎng)肝癌小鼠的生存期[2]?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，我們可以做出假設(shè)：PDGFR-α可能參與維生素K2抑制肝癌增殖的機(jī)制。我們既往的研究發(fā)現(xiàn)，維生素K2能減少PDGFR-α的表達(dá)。

在本研究中，我們檢測(cè)了維生素K2對(duì)PDGFR-α mRNA與蛋白表達(dá)，以及對(duì)PDGFR-α啟動(dòng)子區(qū)活性的影響。首先，用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)PDGFR-α mRNA的表達(dá)。結(jié)果表明，用不同濃度的維生素K2處理細(xì)胞96 h后，隨著維生素K2的濃度增加，PDGFR-α的表達(dá)逐漸減少。隨后，我們用western blot的方法檢測(cè)PDGFR-α蛋白的表達(dá)，結(jié)果與實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果相符，PDGFR-α的表達(dá)以維生素K2劑量依賴的方式減少。以上研究結(jié)果表明，維生素K2能同時(shí)抑制PDGFR-α mRNA與蛋白的表達(dá)。然而，我們并不知道維生素K2的抑制作用是否因?yàn)槠渑cPDGFR-α的啟動(dòng)子相互作用所致。最后，我們用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與熒光素酶報(bào)告基因的方法，檢測(cè)維生素K2對(duì)PDGFR-α啟動(dòng)子活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)，隨著維生素K2的濃度增加，PDGFR-α的活性逐漸減弱。

越來越多的研究表明，PDGF信號(hào)通路與幾種病理狀態(tài)相關(guān)，其中包含了纖維變性疾病，如肺纖維化、肝纖維化、硬皮病等[14]。近期的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，過度表達(dá)PDGFR-α的一種配體PDGFR-C能導(dǎo)致肝纖維化，后者是由于膠原沉積于細(xì)胞外周與靜脈周圍形成的病理改變[15]。我們推測(cè)維生素K2可能通過抑制PDGFR-α的表達(dá)改善肝硬化。維生素K2改善肝纖維化的作用機(jī)理以及PDGFR在此過程中的作用，還有待進(jìn)一步研究。然而，我們的研究為維生素K2抑制肝癌增殖的作用提供了依據(jù)，可能的分子機(jī)制是維生素K2抑制了PDGFR-α的表達(dá)。維生素K2可能成為肝細(xì)胞癌的潛在治療劑。

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(編輯：吳小紅)

Mechanisms of Vitamin K2 on Suppression of Proliferation of Hepatocellular Carcinoma

WANGGuangli,ZHOUXiaohui.TheFirstAffiliatedHospitalofShantouUniversityMedicalCollege，Shantou,515041

【Abstract】ObjectiveTo investigate the mechanism of inhibition proliferation of hepatocellular carcinoma (HCC) cell lines in vitro.MethodsHuman hepatoma cells (HuH7) were treated with various concentrations of vitamin K2 for 96 h,then the expression of PDGFR-α mRNA and protein was investigated by real time PCR and western blot analysis respectively.human hepatoma cells (HepG2) were transfected with pluc-a2 (PDGFR-α promoter-luciferase vector),and the luciferase activity after 24 h treatment with Vitamin K2 was assessed.ResultsVitamin K2 suppressed the expression of PDGFR-α mRNA and protein in a dose dependent manner.The PDGFR-α promoter activity was suppressed by Vitamin K2 administration in a dose dependent manner.ConclusionVitamin K2 suppresses the proliferation of hepatocellular carcinoma cells via down-regulating the transcription of PDGFR-α.

【Key words】Vitamin K2；Human hepatoma cells；Platelet-derived growth factor receptor-α

中圖分類號(hào)：R735.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2016)01-0014-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.01.005

通訊作者：周小輝

基金項(xiàng)目：作者單位:515041 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院

收稿日期(2015-01-01修回日期 2015-04-22)