趙皖秋，任文娟，李偉，劉珊

(陜西省婦幼保健院生殖中心，西安　710003)

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HBV感染者胚胎中HBV DNA的測定及其相關(guān)因素分析

趙皖秋，任文娟，李偉，劉珊*

(陜西省婦幼保健院生殖中心，西安710003)

【摘要】目的檢測父/母為乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染者的胚胎中是否存在HBV DNA，探討HBV經(jīng)配子垂直傳播的可能性，同時評估影響垂直傳播發(fā)生的相關(guān)因素。方法收集單方HBV感染的229對夫妻的310個廢棄胚胎。采用套式聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法測定胚胎樣本中的HBV DNA。采用Logistic回歸分析患者年齡、血清HBV DNA載量、血清HBV多種抗原或抗體存在情況及授精方法等因素與HBV DNA存在的相關(guān)性。結(jié)果7.74%(24/310)的胚胎中檢出了HBV DNA；血清HBV DNA載量與胚胎中存在HBV DNA呈顯著正相關(guān)[OR 4.128，95% CI(1.319，12.914)，P=0.015]；授精方式(IVF或ICSI)的差異對胚胎HBV DNA陽性檢查率幾乎無影響(P>0.05)；同一對夫妻的多個胚胎中只有部分胚胎存在HBV DNA。結(jié)論垂直傳播可能是HBV重要的傳播途徑之一。對于HBV DNA高載量的父/母，自然受孕或助孕治療前建議進(jìn)行針對性治療，以降低胚胎感染HBV的風(fēng)險。

【關(guān)鍵詞】乙型肝炎病毒；胚胎；垂直傳播；HBV載量

(JReprodMed2016，25(1)：39-43)

乙型肝炎病毒(HBV)感染可導(dǎo)致急慢性肝炎、肝硬化以及肝細(xì)胞癌。全球約20億人感染HBV[1]，其中超過3.50億人為慢性感染[2]。中國做為HBV感染高發(fā)地區(qū)，約60%的中國人有HBV感染史，9.8%的中國人為HBV慢性感染者[3]。HBV感染高發(fā)的一個重要原因是HBV可以垂直傳播，估計超過30%的HBV感染是通過母嬰垂直傳播獲得[4]。母嬰垂直傳播可分為產(chǎn)前傳播、產(chǎn)時傳播及產(chǎn)后傳播。產(chǎn)前傳播也稱宮內(nèi)傳播，通常認(rèn)為HBV突破胎盤屏障是造成胎兒宮內(nèi)感染的最主要原因；產(chǎn)時傳播主要是指胎兒在分娩過程中，由于宮縮而吞咽含有HBV的母體血液、羊水以及陰道分泌物等母體體液，或因為胎盤血管破裂，母血滲入胎兒血液中造成母嬰垂直傳播；產(chǎn)后傳播即通過接觸父母唾液、母乳喂養(yǎng)以及其他生活上的密切接觸而造成的HBV感染。

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，乙肝的垂直傳播就是母嬰垂直傳播，但自Hadchouel等[5]研究發(fā)現(xiàn)HBV DNA可整合到精子基因組中后，越來越多的研究提示HBV可能經(jīng)過精子垂直傳播[6-12]。近期的研究則發(fā)現(xiàn)HBV DNA可整合入倉鼠卵母細(xì)胞基因組中[13]，HBV感染者不同發(fā)育階段的卵母細(xì)胞均可檢出乙肝核心抗原(HBcAg)和HBV DNA[14]，提示HBV感染可能經(jīng)過生殖細(xì)胞(精子和卵母細(xì)胞)發(fā)生垂直傳播。

目前，雖然有間接證據(jù)提示HBV可能通過感染生殖細(xì)胞進(jìn)行垂直傳播，但尚缺乏足夠的直接證據(jù)支持。本研究通過檢測父/母為HBV慢性感染者的廢棄胚胎中是否存在HBV DNA，為HBV是否可通過生殖細(xì)胞傳播提供直接證據(jù)，同時評估影響該垂直傳播發(fā)生的相關(guān)因素。

材料與方法

一、主要設(shè)備與試劑

Applied Biosystems Veriti 96 Well Thermal Cycler PCR儀購自美國Life Technologies公司；Bio-RAD PowerPac電泳儀購自美國伯樂公司；JS-680CR全自動凝膠成像分析儀購自上海培清科技有限公司；HBV DNA Detection試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。

二、研究方法

1. 樣本收集及處理：實驗樣本來源于2012年9月至2014年3月在我院輔助生殖中心行輔助生殖助孕治療、單方HBV感染的229對不育夫婦的廢棄胚胎(共310個)。本研究將乙肝表面抗原(HBsAg)陽性持續(xù)半年以上者認(rèn)定為HBV感染。從單純男方HBV感染的140對夫婦中獲得廢棄胚胎181個，從單純女方HBV感染的89對夫婦中獲得廢棄胚胎129個。本研究經(jīng)我院倫理委員會審議通過，并患者知情同意。

另外，選取同期在我院接受輔助生殖助孕治療、未感染HBV的不育夫婦的廢棄胚胎80例做為陰性對照。

本研究所納入胚胎均為人工授精后培養(yǎng)72 h的廢棄胚胎(異常受精或低于移植標(biāo)準(zhǔn)的胚胎)。經(jīng)PBS清洗3次后，用毛細(xì)吸管將胚胎移入聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)管底，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

三、HBV DNA檢測

使用HBV DNA Detection試劑盒檢測胚胎中是否存在HBV DNA。采用套式PCR法特異性擴(kuò)增乙肝病毒DNA中的S基因(基因序列第506~645)，S基因編碼合成乙肝表面抗原的主蛋白，其與前S抗原共同組成乙肝表面抗原。因商品試劑盒PCR引物序列保密，故本文不能提供引物序列信息。首次PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物大小約510 bp，二次PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物大小約230 bp。以試劑盒提供的陽性模版做為陽性對照，其首次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約603 bp，二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約350 bp。

套式PCR操作如下：向含有胚胎樣本的PCR管中直接加入PCR反應(yīng)液25 μl，振蕩、離心后，按以下條件進(jìn)行第1次擴(kuò)增：94℃預(yù)變性1 min，94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)；再取2 μl第1次擴(kuò)增產(chǎn)物做為模版，加入23 μl PCR反應(yīng)液，按以下條件進(jìn)行第2次擴(kuò)增：94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳，顯示特異性擴(kuò)增條帶者視為HBV DNA陽性。

HBV DNA載量的測定，則按照臨床常規(guī)，由我院臨床檢驗科統(tǒng)一測定。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，分類變量比較采用卡方檢驗，相關(guān)性分析采用Logistic回歸分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、PCR檢測結(jié)果

單純男方HBV感染的140對夫妻中13例(9.3%)檢測到HBV DNA陽性胚胎，單純女方HBV感染的89對夫妻中 11例(12.4%)檢測到陽性結(jié)果(表1)。

在所檢測的310例胚胎樣本，檢出HBV DNA陽性胚胎樣本24個，檢出率為7.74%。其中男方HBV感染者來源的181例胚胎中檢出13例陽性，檢出率為7.18%；女方HBV感染者來源的129例胚胎中檢出11例，檢出率為8.53%。經(jīng)卡方檢驗，兩者檢出率無顯著性差異(P>0.05)。

80例陰性對照胚胎未有陽性結(jié)果檢出。

設(shè)立穿越高鐵現(xiàn)場值班室和遠(yuǎn)程監(jiān)控調(diào)度室，由側(cè)穿高鐵橋梁樁基工作小組統(tǒng)一指揮，進(jìn)行24h監(jiān)測、值班和巡視制度，確保盾構(gòu)下穿鐵路期間地表、洞內(nèi)、值班室信息互通，出現(xiàn)問題第一時間處理。

二、胚胎HBV感染相關(guān)性因素分析

胚胎HBV感染相關(guān)性因素分析采用Logistic回歸分析，入選因素包括：男/女方年齡、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb、HBcAb-IgM、HBS1Ag、血清HBV DNA載量和授精方式[體外受精(IVF)或卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)]。

Logistic回歸初始模型分析發(fā)現(xiàn)HBeAg陽性、HBeAb陽性和HBV DNA高載量(HBV DNA拷貝數(shù)>106/ml)與胚胎HBV感染具有顯著相關(guān)性(P<0.05)。排除混雜因素后，Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)僅HBV DNA高載量與胚胎HBV感染呈顯著正相關(guān)[OR4.128，95%CI(1.319，12.914)，P=0.015](表2)。此外，單獨對單純男/女方為HBV感染者的樣本采用卡方檢驗和Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)：授精方式(IVF或ICSI)的差異對胚胎感染HBV的幾率無顯著影響(P>0.05)(表1)。

研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)：4對單純男性HBV感染和5對單純女性HBV感染夫妻同一批次多個胚胎中，僅有1個胚胎檢出HBV DNA，并非所有受檢胚胎HBV DNA均為陽性(表3)，提示源于同一對夫妻的多個胚胎中只有部分胚胎感染HBV。

表1單純男/女HBV感染者不同授精方式與胚胎HBV感染的相關(guān)性

授精方式HBV感染者胚胎HBVDNA陽性檢出率(%)單純男方HBV感染單純女方HBV感染IVF7.5(8/106)15.1(11/73)ICSI14.7(5/34)0(0/16)

注：卡方檢驗和Logistic回歸分析P值均>0.05

表2各相關(guān)因素與胚胎HBV感染的相關(guān)性(Logistic回歸分析，n=229)

相關(guān)因素數(shù)值OR值95%CIP值男方年齡(歲)31.0±4.40.9730.834-1.1360.732女方年齡(歲)29.9±4.00.9710.869-1.0850.602HBsAb陽性率(%)0(0/229)N/AN/AN/AHBeAg陽性率(%)28.8(66/229)0.9990.289-3.4470.998HBeAb陽性率(%)47.6(109/229)0.3530.093-1.3380.125HBcAb陽性率(%)100.0(229/229)N/AN/AN/AHBcAb-IgM陽性率(%)4.4(10/229)3.1560.314-31.6870.329HBS1Ag陽性率(%)62.4(143/229)1.2310.291-5.1990.778HBVDNA高載量比率(%)22.3(51/229)4.1281.319-12.9140.015*授精方式(IVF/ICSI)173/560.7950.282-2.2360.663

注：N/A：不適用；*P<0.05，呈顯著正相關(guān)

表3同一對夫妻來源的多個胚胎HBV DNA檢測結(jié)果

患者編號男方HBV感染女方HBV感染總檢測胚胎數(shù)(個)HBVDNA陽性胚胎數(shù)(個)10-+4116+-2121+-2125-+5194-+21125-+21131+-21136+-21140-+31

討論

Hadchouel等[5]研究首次發(fā)現(xiàn)HBV DNA可整合到精子基因組中，其他研究通過熒光原位雜交方法亦觀察到HBV的基因序列整合到精子染色體上[6，9]。Ali等[7]從分化出1～2個細(xì)胞的胚胎中發(fā)現(xiàn)了HBV基因，而該胚胎來源于感染了HBV的人類精子與倉鼠去透明帶卵母細(xì)胞的體外受精操作。以上研究提示HBV可能經(jīng)精子垂直傳播給胚胎。對女性HBV感染者的研究也發(fā)現(xiàn)，HBsAg、HBcAg和HBV DNA在不同發(fā)育階段的卵細(xì)胞和卵巢組織中均可檢出[14-15]，且HBV DNA可整合入倉鼠卵母細(xì)胞基因組中[13]，提示HBV也可能經(jīng)卵細(xì)胞垂直傳播。但是，目前對于HBV通過生殖細(xì)胞垂直傳播的直接證據(jù)研究尚少。本研究結(jié)果顯示，單純男方HBV感染的140對夫妻中13例(9.3%)胚胎檢測到陽性結(jié)果，單純女方HBV感染的89對夫妻中 11例(12.4%)胚胎檢測到陽性結(jié)果，在體外條件下的廢棄胚胎中檢測到HBV DNA，提示人類精子或卵細(xì)胞可能作為載體將HBV傳播給胚胎。上述實驗結(jié)果為“HBV經(jīng)生殖細(xì)胞垂直傳播”的假說提供了直接證據(jù)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，源于同一對夫妻的同批次多個胚胎，只有部分胚胎檢出HBV DNA，表明HBV對精子和卵母細(xì)胞的感染具有一定限制性，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。其中不同卵母細(xì)胞感染HBV的差異性，可能與卵母細(xì)胞透明帶的高度異構(gòu)性有關(guān)[16]。此外，在本研究中，廢棄胚胎中的HBV DNA需重復(fù)PCR后才能檢測到，表明HBV DNA在感染胚胎中含量極低，提示HBV DNA在胚胎中不復(fù)制或僅極低水平的復(fù)制，其具體發(fā)生機(jī)制亦需要后續(xù)的深入研究來驗證。

與模擬自然受精的IVF不同，ICSI是將精子通過顯微注射注入卵母細(xì)胞，由于直接跨過了透明帶的保護(hù)，外部HBV有可能直接進(jìn)入胚胎，從而增加HBV感染的可能性，因此，歐洲許多國家反對為HBV感染者行ICSI[17]。目前，對于使用HBV感染者精液行ICSI后是否會增加胚胎HBV感染率尚存在爭議，而對于單純女性HBV感染者卵母細(xì)胞行ICSI后是否增加胚胎HBV感染率則尚無研究報道[17]。本研究結(jié)果顯示，單純男方HBV感染時，行ICSI助孕操作后胚胎HBV DNA的陽性率略高于行IVF的胚胎，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；單純女方為HBV感染時，行ICSI助孕操作后胚胎HBV DNA的陽性率低于行IVF的胚胎，但差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。ICSI是否會顯著增加胚胎感染HBV的幾率，尚需更大樣本的研究探討。

已有研究報道母親HBeAg陽性和高血清HBV DNA水平能增加HBV垂直傳播的風(fēng)險[18-22]，其中HBV宮內(nèi)傳播的風(fēng)險與HBV DNA水平密切相關(guān)[23]，HBV DNA水平較HBeAg水平更能體現(xiàn)胎兒免疫預(yù)防HBV感染的失敗率[22]。為確定經(jīng)生殖細(xì)胞垂直感染HBV與HBeAg陽性、高血清HBV DNA水平等影響因素的相關(guān)性，本研究分析了男/女方年齡、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb、HBclgM-Ab、HBS1Ag及血清HBV DNA載量等因素與胚胎HBV感染的相關(guān)性。經(jīng)Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)僅血清HBV DNA高載量與胚胎HBV感染呈顯著性正相關(guān)，表明高濃度的HBV環(huán)境可顯著增加胚胎HBV感染率，提示HBV感染者孕前應(yīng)檢測血清HBV DNA載量，對于高載量的患者應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)治療，在降低HBV DNA載量后再懷孕，以降低胚胎感染HBV的可能性。

綜上所述，無論男方或女方感染HBV，均可能出現(xiàn)胚胎HBV感染，提示經(jīng)生殖細(xì)胞(精子和卵母細(xì)胞)垂直傳播可能是HBV重要的傳播途徑之一。對于男方或女方感染HBV者，臨床上進(jìn)行ICSI或IVF輔助治療前要進(jìn)行綜合評價，對于HBV DNA高載量的父/母，自然受孕或進(jìn)行輔助生殖助孕治療前均應(yīng)進(jìn)行針對性治療，以降低胚胎感染HBV的風(fēng)險。

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[編輯：肖曉輝]

Detection of HBV DNA in human embryos and analysis of risk factors of HBV vertical transmission

ZHAOWan-qiu，RENWen-juan，LIWei，LIUShan*

AssistedReproductionCenter，Maternal&ChildHealthCareHospitalofShaanxiProvince，Xi’an710003

【Abstract】

Objective： To detect whether hepatitis B virus (HBV) DNA exists in the embryos of the parents infected by HBV，and explore the passibility of HBV vertical transmission via the germ cell.

Methods： A total of 310 human embryos from 229 couples，in whom one of the spouses exhibited seropositive hepatitis B surface antigen (HBsAg)，were collected. HBV DNA in the embryos was detected by nested PCR. The correlation between the influence factors including patient age，serum HBV DNA load，serum HBV antigen/antibody level & insemination method and the presence of HBV DNA in embryos were evaluated by logistic regression analysis.

Results： HBV DNA was exhibited in 7.74% (24/310) of embryos. HBV DNA load in embryos were significantly positively correlated with the serum HBV DNA level (OR4.128，95%CI： 1.319-12.914，P=0.015). The insemination mode (IVF or ICSI) was not significantly related with HBV DNA positive rate in embryos (P>0.05). HBV DNA was only presented in part of embryos of the same parents with high serum HBV DNA level.

Conclusions： Vertical transmission is one of the important routes of HBV transmission. The targeted therapy should be recommended before natural conception or IVF treatment for the parents with high load of HBV DNA to reduce the risk of HBV infection to embryos.

Key words：Hepatitis B virus；Embryo；Vertical transmission；HBV DNA load

【作者簡介】趙皖秋，男，陜西涇陽人，學(xué)士，主治醫(yī)師，生殖醫(yī)學(xué)專業(yè).(*通訊作者，Email：123564787@qq.com)

【基金項目】陜西省婦幼保健院青年醫(yī)生科研基金項目(Q201304)

【收稿日期】2015-04-25；【修回日期】2015-08-11

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.1.008