伍善東， 雷 平， 郭照輝， 單世平， 付祖姣， 程 偉

(湖南省微生物研究院， 湖南 長沙 410009)

1株高效解鉀菌的分離、鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化

伍善東， 雷 平， 郭照輝， 單世平*， 付祖姣， 程 偉

(湖南省微生物研究院， 湖南 長沙 410009)

為獲得高效的解鉀菌株，從長沙縣油菜田土壤中分離有較強解鉀能力的菌株，結合菌落形態(tài)和生理生化特性及16SrDNA序列分析鑒定菌株，通過單因子試驗與正交試驗對解鉀能力最強的菌株發(fā)酵條件進行優(yōu)化。結果表明：解鉀能力最強菌株JK-3為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，其發(fā)酵上清液中有效鉀含量較對照增加13.7 mg/L。最優(yōu)培養(yǎng)基為4.0%葡萄糖、0.1%蛋白胨、1.0%魚粉、0.5%MgSO4·7H2O；最優(yōu)培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度28℃、培養(yǎng)時間36 h、初始pH 7.2、轉速180 r/min、接種量2.0%，500 mL三角瓶裝液量為40 mL。

解鉀菌； 分離； 枯草芽孢桿菌； 微生物肥料

鉀是作物生長的重要營養(yǎng)要素之一。據土壤普查資料顯示[1]，我國耕地缺鉀和嚴重缺鉀的比例分別約為70%和45%，肥料中的氮、磷、鉀比例為1∶0.4∶0.16，遠小于發(fā)達國家的 1∶0.5∶0.4，已成為限制作物產量和品質提高的重要因素。農業(yè)生產中常施用化學鉀肥提供給作物生長所需的鉀元素，但易破壞土壤結構、有機質含量下降[2]，不利于農業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。土壤中95%的鉀為礦物鉀形態(tài)，存在于鉀長石和云母這二大礦物中[3]，不能直接被植物吸收利用。解鉀細菌多是硅酸鹽細菌，其能分解礦物并釋放鉀等元素供植物利用，將土壤中無效鉀元素轉化為有效態(tài)鉀，同時也有固氮和解磷功能[4]。利用微生物從鉀長石中獲得可供作物利用的有效鉀，有能耗低、成本少、無污染和方法簡單等優(yōu)勢，被認為是最有前途的鉀長石提鉀方法[5]。盛下放等[6]分離到有高效解鉀活性的硅酸鹽細菌NBT，經搖瓶振蕩培養(yǎng)120 h，菌株NBT的釋鉀量較對照增加226.0%。這些研究表明，解鉀菌釋鉀的相對量較多，但絕對量較小，有必要篩選更具解鉀效率的菌株。因此，筆者從油菜田中分離高效解鉀菌，對其進行鑒定并且優(yōu)化菌株的發(fā)酵條件，以期為微生物肥料的開發(fā)與應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

NA培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂18.0 g，pH 7.2，去離子水1000.0 mL。亞歷山鮑羅夫培養(yǎng)基[7]：蔗糖5.0 g，Na2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeCl35.0 mg，CaCO30.1 g，鉀長石粉1.0 g(去離子水5次清洗)，瓊脂20.0 g，pH 7.0，去離子水1 000.0 mL。液體培養(yǎng)基不加瓊脂。基礎培養(yǎng)基：蔗糖10.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO31.0 g，(NH4)2SO41.0 g，NaCl 0.1 g，酵母膏0.5 g，K2HPO42.0 g，pH 7.4，去離子水1 000.0 mL。

1.2 解鉀菌的分離

采用5點取樣法，從長沙縣油菜田采集土壤。稱取10 g土壤樣品加入到90 mL無菌水中，充分混勻，靜置5 min，按梯度稀釋至10-7，分別從10-5、10-6、10-73個稀釋梯度中各吸取0.2 mL菌液加入亞歷山鮑羅夫培養(yǎng)基平皿中，涂抹均勻，每個稀釋梯度3次重復，平皿倒至于30℃恒溫箱中培養(yǎng)4～5 d，挑取生長勢好的菌落，劃線純化，3次重復，直至獲得純培養(yǎng)，保藏于4℃冰箱中。

1.3 菌株解鉀能力的測定

將待測菌株挑取一環(huán)接種于50 mL亞歷山鮑羅夫液體培養(yǎng)基中，以不接種的作為空白對照，30℃，180 r/min搖床培養(yǎng)14 d。培養(yǎng)液經4℃，5 000 r/min離心10 min，收集上清液，利用火焰分光光度計測其鉀含量[8]。

1.4 菌株的鑒定

1.4.1 解鉀菌株的形態(tài)特征、生理生化鑒定 將菌株劃線接種于NA培養(yǎng)基上，置于30℃的恒溫箱中培養(yǎng)2 d，觀察菌落特征，用接種環(huán)挑取純化后的菌株進行革蘭氏染色，鏡檢。生理生化試驗依據《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]對菌株進行鑒定。

1.4.2 解鉀菌株的16SrDNA序列分析 提取DNA后，對16S rDNA目的片斷進行PCR擴增[10]。引物序列：F， 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

PCR反應體系(50 μL)：去離子水39 μL，PCR buffer 5 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，Taq DNA聚合酶1 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)。72℃終末延伸10 min。PCR產物由上海生工進行序列測定。序列輸入GenBank數據庫中進行比對，選擇同源性高的序列使用MEGA5.2軟件鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 培養(yǎng)基成分的篩選試驗

1.5.1 種子液的制備 將活化后的菌株接種于NA液體培養(yǎng)基，在30℃、180 r/min的條件下，搖床培養(yǎng)20 h。

1.5.2 培養(yǎng)基成分的篩選 通過單因子試驗篩選適合菌株的最佳碳源、氮源和無機鹽，再用正交試驗法確定培養(yǎng)基各組分的最佳含量。

1) 碳源。分別以含量為20 g/L的淀粉、麥芽糖、木糖、葡萄糖、甘露醇和蔗糖替換基礎培養(yǎng)基中碳源，500 mL三角瓶中裝液量為100 mL，每個搖瓶中接入5 mL種子液，于30℃，180 r/min條件下搖床培養(yǎng)48 h。按平板菌落計數法測定發(fā)酵液中的活菌數。

2) 氮源。分別以含量為20 g/L的黃豆粉、牛肉膏、魚粉、蛋白胨、尿素、NH4NO3替換基礎培養(yǎng)基中的氮源，方法同上。

3) 無機鹽。分別添加1 g/L的K2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4、ZnSO4、NaCL、CaCO3，替換基礎培養(yǎng)基中的無機鹽，方法同上。

1.5.3 正交試驗 以優(yōu)化的碳源、氮源、無機鹽進行正交試驗，確定各組分的最佳含量，方法同上。

1.6 培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗

以優(yōu)化的碳源、氮源及無機鹽配制培養(yǎng)基，進行最適培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、初始pH、轉速、接種量和裝液量試驗[11-12]。培養(yǎng)溫度設置為20℃、24℃、28℃、32℃、36℃、40℃，培養(yǎng)時間設置為12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h和54 h，初始pH設置為6.0、6.4、6.8、7.2、7.6和8.0，轉速設置為90 r/min、120 r/min、150 r/min、180 r/min和210 r/min，接種量設置為l.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%和6.0%，500 mL三角瓶裝液量設置為40 mL、60 mL、80 mL、100 mL、120 mL和140 mL，方法同上。

1.7 試驗驗證

培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件優(yōu)化后，進行50 L罐發(fā)酵驗證，測定發(fā)酵液中的活菌數。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離篩選

從亞歷山鮑羅夫培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中初步分離到21株細菌，從中挑取生長勢好的菌株6株，劃線純化后分別命名為JK-1、JK-2、JK-3、JK-4、JK-5和JK-6，保藏于4℃冰箱中。

2.2 菌株的解鉀效果

6株菌經搖瓶發(fā)酵試驗與對照上清液中有效鉀的含量分別為3.6～14.5 mg/L和0.8 mg/L，上清液中有效鉀的增加量為2.6～13.7 mg/L。其中，以JK-3發(fā)酵上清液中有效鉀的增加量最大，為13.7 mg/L。故選擇JK-3菌株進行下一步試驗。

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 菌落與形態(tài)特征 JK-3菌落在NA培養(yǎng)基上呈橢圓形或圓形，白色，表面干燥，邊緣不整齊。油鏡下觀察，菌體呈桿狀，圓端，有芽孢，卵圓形。(0.8～1.6)μm ×(1.9～5.5)μm，革蘭氏染色陽性。

2.3.2 生理生化特征 JK-3能利用葡萄糖、蔗糖、木糖發(fā)酵產酸，甲基紅、V. P.試驗陽性，不能產生吲哚和卵黃卵磷脂酶，能使明膠液化，水解淀粉，產生過氧化氫酶、氧化酶、硫化氫，利用檸檬酸鹽。初步確定JK-3為芽孢桿菌屬。

2.3.3 16S rDNA序列 菌株JK-3與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)親緣關系最近(圖示)，結合JK-3菌株的菌落形態(tài)特征和生理生化特征，確定該菌株為枯草芽孢桿菌。

圖示 16S rDNA序列為基礎構建的JK-3 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig. The phylogenetic tree of JK-3 strain based on 16S rDNA sequence

2.4 最佳培養(yǎng)基成分的確定

2.4.1 最佳碳源、氮源和無機鹽的篩選 由表1可知，當以葡萄糖為碳源時，其發(fā)酵液中的菌液濃度達最大值，為6.2×108CFU/mL；以淀粉為碳源時，其發(fā)酵液中的菌液濃度最小，僅0.9×108CFU/mL。故最佳碳源為葡萄糖。在最佳氮源的篩選試驗中，以蛋白胨為唯一氮源時，其發(fā)酵液中的菌液濃度最大，為8.9×108CFU/mL；其余依次為牛肉膏、魚粉、黃豆粉、尿素和NH4NO3，考慮成本因素，選擇蛋白胨和魚粉為氮源。在最佳無機鹽的篩選試驗中，當培養(yǎng)基中添加MgSO4·7H2O時，其發(fā)酵液中的菌液濃度最大，為6.4×108CFU/mL，故最佳無機鹽為MgSO4·7H2O。

表1 培養(yǎng)基中加入不同碳源、氮源和無機鹽后發(fā)酵液中的活菌數

2.4.2 碳源、氮源、無機鹽的最佳添加量 由表2可見，通過正交試驗統(tǒng)計均值和極差分析，影響菌株JK-3發(fā)酵液中的菌液濃度的因素依次為B蛋白胨>A葡萄糖>D MgSO4·7H2O>C魚粉。經方差分析，A葡萄糖(F=973.25>F0.01=6.23)、B蛋白胨(F=1226.00>F0.01=6.23)、C魚粉(F=140.25>F0.01=6.23)和D MgSO4·7H2O(F=369.25>F0.01=6.23)對菌株JK-3發(fā)酵液中菌液濃度影響均達極顯著水平，區(qū)組間差異不顯著(F=0.25

表2 菌株發(fā)酵的正交試驗各因素水平均值及極差

2.5 培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗

從表3可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌株JK-3發(fā)酵菌液濃度逐漸變大，當培養(yǎng)溫度為28℃時，菌液濃度達最大值，為14.1×108CFU/mL，隨后培養(yǎng)溫度的升高菌液濃度逐漸變小。隨著培養(yǎng)時間的增加，其菌液濃度呈先升高后降低趨勢，當培養(yǎng)36 h時，其菌液濃度最高，達12.5×108CFU/mL。當培養(yǎng)基的初始pH在6.0～8.0時，發(fā)酵液中菌液濃度的變化較小，當初始pH為6.0時，其菌液濃度最小，為9.1×108CFU/mL，初始pH為7.2時，其菌液濃度最大，為13.4×108CFU/mL。隨著轉速的增加，菌液濃度呈先升高后降低趨勢，當轉速為180 r/min時，菌液濃度達最大，為12.2×108CFU/mL。當接種量為2%時，菌液濃度達最大值，為13.7×108CFU/mL，但接種量再增大，菌液濃度反而變小，說明接種量過大造成營養(yǎng)物質消耗增大，不利于菌體生長。當裝液量為40 mL時，發(fā)酵液菌液濃度最大，為14.3×108CFU/mL，隨著裝液量的增加，菌液濃度減小。綜合分析，最優(yōu)培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時間36 h，初始pH7.2，轉速180 r/min，接種量2%，裝液量40 mL。

表3 不同處理方式發(fā)酵液中的活菌數

2.6 50 L發(fā)酵罐試驗驗證

依據培養(yǎng)基的最優(yōu)成分及其添加量和最優(yōu)培養(yǎng)條件，采用50 L罐進行菌株JK-3的發(fā)酵，其發(fā)酵菌液濃度為2.4×109CFU/mL，說明此培養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件有利于菌株JK-3的發(fā)酵。

3 結論與討論

已報道的解鉀菌(硅酸鹽細菌)雖破壞鉀礦釋放可溶性鉀的能力顯著，但解鉀絕對量卻十分有限[13-14]。解鉀細菌從硅酸鹽礦物中濾取SiO2和K+的作用，是胞外多糖和有機酸等共同參與的結果[15]。鉀細菌浸取鉀礦釋放有效鉀仍存在解鉀效率低、解鉀速度慢等問題，限制了其工業(yè)應用[5]。因此，分離選育高效解鉀菌株很有必要。

本研究從土壤中分離到1株有較強解鉀能力的菌株JK-3，發(fā)酵上清液中有效鉀的含量比對照增加13.7 mg/L，結合其菌落形態(tài)和生理生化特性及16SrDNA序列分析，鑒定其為枯草芽孢桿菌。經單因子試驗和正交試驗，確定發(fā)酵培養(yǎng)條件為4.0%葡萄糖、0.1%蛋白胨、1.0%魚粉、0.5%MgSO4·7H2O、培養(yǎng)溫度28℃、培養(yǎng)時間36 h、初始pH 7.2、轉速180 r/min、接種量2.0%、裝液量40 mL。50 L罐發(fā)酵驗證，發(fā)酵菌液濃度為2.4×109CFU/mL。下一步的工作將是JK-3菌肥的生產及大田試驗。

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(責任編輯： 劉忠麗)

Isolation and Identification of an Efficiency Potassium-releasing Bacterium Strain and Its Optimization of Culture Conditions

WU Shandong, LEI Ping, GUO Zhaohui, SHAN Shiping*, FU Zujiao, CHENG Wei

(HunanAcademyofMicrobiology,Changsha,Hunan410009,China)

An efficient potassium-releasing bacterium strain isolated from the soil of rape fields in Changsha County was identified by 16 S rDNA sequence analysis according to its colony morphological feature and physiological-biochemical characteristics and then the fermentation conditions were optimized by single-factor and orthogonal tests. Results: Jk-3 strain, an efficient potassium-releasing bacterium strain isBacillussubtilisand the available potassium content in the fermented supernatant fluid increases by 13.7% compared with CK. The optimal medium for JK-3 strain is 4.0% glucose, 0.1% peptone, 1.0% fish meal and 0.5% MgSO4· 7H2O, and the optimal culture conditions include 2.0% inoculum size, 40 mL liquid volume/500mL triangular bottle, initial pH 7.2, 180 r/min and 28℃ for 36 h.

potassium-releasing bacterium; isolation;Bacillussubtilis; microbial fertilizer

2015-09-01； 2016-04-10修回

湖南省科技計劃項目“抗油菜菌核病微生物農藥的研究與示范”(2015HK3056)；湖南省自然科學基金項目“貪銅菌6-5富集土壤中重金屬鎘的分子機理研究”(13JJ2035)

伍善東(1978-)，男，工程師，從事植物保護與微生物肥料研究。E-mail:1059995305@qq.com

*通訊作者：單世平(1978-)，男，副研究員，博士，從事農田土壤重金屬污染防控、土壤肥料發(fā)酵工藝等研究。E-mail:ssp312@ hotmail.com

1001-3601(2016)05-0206-0077-04

Q938.1+3

A