王　艷，謝耀堅，李國清，吳志華

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桉樹青枯病病原菌的分子鑒定及其致病性測定

王艷1,2，謝耀堅1，李國清1，吳志華1＊

(1.國家林業(yè)局桉樹研究開發(fā)中心, 廣東湛江 524022；2. APP中國林務(wù)事業(yè)部, 海南儋州578101;)

對華南4個地區(qū)的桉樹青枯病病原菌進行了分子鑒定和致病性測試研究，以期為有效預(yù)防其發(fā)生提供依據(jù)。分別對來源于不同區(qū)域的11株桉樹青枯病病原菌進行分子鑒定和致病力強弱測試比較，11株病原菌與序列形成支持率為86%分枝，表明其病原菌16S rRNA 基因序列與具有高度同源性。以桉樹無性系DH32-29組培苗為材料，采用傷根法對11個菌株進行致病力測試，不同菌株間在致病性上差異顯著(<0.01或<0.05)，以發(fā)病高峰期、高峰期發(fā)病率和平均發(fā)病率進行K-均值聚類分析(K=3)，結(jié)果表明來源于廣東、廣西、海南的各菌株間致病性存在差異，HY01、HY02、DA01、HP04菌株與HP05分為1類，DA02和DA03為第2類，而YJ01、HP01、HP02和HP03為第3類。對4個不同地區(qū)(采樣點)的青枯病菌株平均發(fā)病率進行方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)來源廣東陽江菌株致病性顯著地低于其他來源菌株。不同地理來源菌株之間在致病性上無明顯相關(guān)性，同一地區(qū)內(nèi)同時存在著致病力強弱菌株，HP03的生物型4-1菌株與其他生物型3菌株在致病性亦無明顯的差別。

桉樹青枯?。环肿予b定；致病性；生物型

青枯病(Bacterial wilt)是由引起的土傳性細菌病害[1]。近年來，我國南方桉樹()、木麻黃()、桑樹()等林木青枯病害的發(fā)生，造成較大經(jīng)濟損失，已成為林業(yè)上一種毀滅性病害[2]。桉樹青枯病最早在我國廣西柳桉()、巨桉()等幼樹上首次發(fā)現(xiàn)[3]。廣東、廣西及海南是我國桉樹人工林主產(chǎn)區(qū)，隨著桉樹人工林不斷發(fā)展，桉樹青枯病發(fā)生日趨嚴(yán)重，為害面積和分布范圍逐年增大，對桉樹人工林發(fā)展造成災(zāi)難性損失，已成為當(dāng)前限制我國桉樹發(fā)展的主要因子之一。

青枯病病原菌經(jīng)寄主根的傷口或者次生根根冠部侵入，然后通過木質(zhì)部繁殖擴散[4]，形成侵填體[5]，堵塞植物的維管束系統(tǒng)[6-7]，造成寄主植物迅速萎蔫、枯死，而莖葉仍保持綠色[8]。目前生產(chǎn)上的桉樹品種均不同程度上受其危害。特別是臺風(fēng)襲擊后，感病品系幼林發(fā)病率達20% ~ 40 %，高感品系甚至60%以上[9]。桉樹品種受到侵染后，將大幅度降低其生長勢，影響桉樹產(chǎn)量和林木質(zhì)量，嚴(yán)重威脅著桉樹人工林可持續(xù)發(fā)展。

盡管可通過培育抗病品種、改變不同耕作如輪作等措施防治其發(fā)生，但由于受立地土壤類型、病原菌種源、栽培模式、氣候因素和品種等因素影響，加之青枯病病原菌的危害程度大、分布廣、土壤存活時間長，青枯病仍然是桉樹生產(chǎn)實際上面臨的重要障礙。

吳清平等[10]發(fā)現(xiàn)廣東雷州不同桉樹樹種分離獲得的青枯菌菌株，其致病力基本相同，病原菌對桉樹的致病力比對木麻黃、番茄()、甘薯()及花生()強。王勝坤[11]對采集于華南地區(qū)的30個桉樹青枯菌菌株進行了致病性測試，結(jié)果表明青枯菌菌株的致病力和地理來源相關(guān)性不明顯，地理來源相距較遠的菌株，致病力差異不顯著，而在同一地區(qū)，菌株致病力存在強弱分化，差異顯著。由于桉樹青枯病病原菌復(fù)雜，給生產(chǎn)和防治帶來許多的困難和挑戰(zhàn)。因此，本試驗對來源于華南不同地區(qū)11株病原菌進行了分子鑒定和致病性測試等研究，以期為有效預(yù)防其發(fā)生和培育抗性品系提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試病原菌于2011年9―10月分別從華南3省各地不同桉樹采集(表1)，采集的病株均已表現(xiàn)出青枯病典型癥狀，即病株葉片失水萎蔫，伐倒后木質(zhì)部呈黑褐色，片刻可見乳白色至淡黃褐色菌膿溢出。純化后的菌株采用-70℃長期保存，或置無菌水中保存于室溫或4℃下數(shù)月到數(shù)年，本實驗保存于無菌水中。病原菌的分離活化培養(yǎng)采用CPG、TZC和NA等培養(yǎng)基。經(jīng)前期形態(tài)學(xué)鑒定確定其病原菌為[12]。

表1 供試菌株來源及其生物型

注：*表示青枯菌生物型采用苯酚紅為指示劑的改良法測試[13]，依照當(dāng)前分類標(biāo)準(zhǔn)，無對應(yīng)的生物型。這與曾憲銘等[14]在花生、姜和甘薯菌株中發(fā)現(xiàn)的情況相同，本研究中不確定生物型是首次在桉樹無性系上發(fā)現(xiàn)。參照文獻曾憲銘等標(biāo)準(zhǔn)，暫定為生化型Ⅳ的亞型(4-1)。

1.2 試驗苗木

試驗的尾巨桉無性系組培苗DH32-29由廣東省湛江市南方國家級林木種苗示范基地苗圃提供。待幼苗長至株高約20 cm時，選擇長勢健壯組培苗木試驗測試用。

1.3 試驗方法

1.3.1 供試菌株的分子生物學(xué)鑒定

(1)病原菌基因組DNA的提取

純化的菌株于CPG上28℃活化24 h，使TaKaRa寶生物有限公司的Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR提取病原菌基因組DNA。蘸取適量新鮮菌液置50 μL裂解液中，輕攪動幾下后取出，80℃熱變性15 min后低速離心，取上清液作為PCR反應(yīng)模板。模板用的DNA以Nanodrop 2000微量紫外分光光度計檢測純度。

(2) PCR擴增

參照文獻[15]以16sRNA為靶基因進行青枯菌特異性引物序列OLI1/Y2(OLI1:5’GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC3’, Y2 :5’CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT3’)設(shè)計引物和合成[英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司]。PCR反應(yīng)體系與瓊脂糖凝膠電泳依據(jù)文獻[16]實施。

(3)病原菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物序列測定(華大基因公司)結(jié)果通過BLAST數(shù)據(jù)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)同源性分析[17]，以相似性較高(>98%)的序列作為同源序列，相鄰屬模式菌株16S rRNA序列作為外源序列(Outgroup)。MAFFT 7.0進行分子序列比對(軟件具體設(shè)置為Scoring Maxtrix：1PAM/κ=2；Gap opening penalty=1.53；Offset value=0.0)，序列比對完成后用BioEdit軟件進行剪切編輯。以PAUP 4.0軟件采用最大簡約法(Maximum parsimony，MP)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過Bootstrap進行1000次可靠性檢驗，以Treeview軟件對構(gòu)建的發(fā)育樹瀏覽。

1.3.2 病原菌的分離、純化及菌懸液配制

病原菌分離培養(yǎng)基為TZC培養(yǎng)基(每升TZC培養(yǎng)基包含1 g水解乳蛋白、10 g蛋白胨、5 g葡萄糖和17 g瓊脂，1%的2，3，5-氯化三苯四氮唑5 mL)，調(diào)至適宜pH 6.5 ~ 7.0；于121 ?C 高溫滅菌20 min。

不同來源菌株致病性差異比較中的病原菌的分離、純化及菌懸液配制如下：在酒精燈旁無菌環(huán)境下取常溫保存的病原菌菌懸液一環(huán)，分別劃線于TZC培養(yǎng)基，選擇有強致病性的白色暈圈的粉紅色菌落進行純化培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)好的菌落用無菌水洗脫菌體，10000×g離心10 min，去除上清液，無菌水梯度稀釋后平板計數(shù)。并配制成108cfu·mL-1菌懸液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 桉樹青枯病原菌致病性測試

2012年6月初，對分離純化的11株菌株進行致病性測試。20 cm左右苗高的桉樹組培苗先洗去基質(zhì)，無菌水洗滌3次，消毒后的解剖刀距根尖1~ 2 cm處截斷須根傷根，然后放入100 mL 108cfu·mL-1菌懸液中，每個處理30株組培苗，重復(fù)3次，無菌水對照。25 ~ 30°C溫度及70% ~ 90%濕度、自然光照下培養(yǎng)10 d觀察發(fā)病情況并統(tǒng)計試驗期間的株數(shù)。在進行各試驗指標(biāo)統(tǒng)計之前，對病株作病原菌的分離鑒定，以排除非青枯死亡的影響，保證試驗的準(zhǔn)確性。

發(fā)病率計算參照文獻[18]公式：發(fā)病率/% = (感染株數(shù)/總株數(shù)) × 100%。每天定時統(tǒng)計發(fā)病株數(shù)，計算日發(fā)病率，至試驗結(jié)束時統(tǒng)計總發(fā)病株數(shù)并計算菌株的平均發(fā)病率。采用DataFit 7.1對每日發(fā)病率進行回歸分析，根據(jù)回歸模型確定試驗期的發(fā)病率曲線情況和“發(fā)病高峰期(接種后到最大日發(fā)病率的天數(shù))”。病原菌致病性(發(fā)病率經(jīng)反正弦平方根處理值)采用方差分析和相關(guān)分析等方法統(tǒng)計各處理平均值的差異，并在SPSS 18.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中采用Duncan檢驗法對相關(guān)指標(biāo)進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 桉樹病原菌16S rRNA基因序列鑒定

電泳結(jié)果如圖1，以O(shè)LI1/Y2為特異性引物擴增16S rRNA基因序列，從采集的11株病原菌致病性測試發(fā)病桉樹無性系組培苗中再次分離出病原菌后，均可在4 h內(nèi)擴增出單一的特異性條帶。測序結(jié)果與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫的Blast對比分析表明，供試病原菌均能與相似性高達99%。以PAUP 4.0軟件采用最大簡約法(Maximum parsimony，MP)分別對11株供試菌株與屬中的5個16S rRNA測序的模式菌株進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)果如圖2。11株病原菌和序列形成支持率為86%的分枝。系統(tǒng)發(fā)育分析也表明，11株病原菌16S rRNA 基因序列與具有高度同源性。

圖1　11個菌株擴增后的電泳圖譜

圖2　11個菌株的分子系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 桉樹青枯病原菌致病性測試

桉樹DH32-29苗通過傷根法接種病原菌后，均能在24 ~ 48 h內(nèi)出現(xiàn)典型失水萎焉的青枯癥狀(圖3)，對照組不發(fā)病。通過對發(fā)病組培苗病原菌的形態(tài)及上述分子鑒定結(jié)果顯示，進一步確定青枯癥狀由引起。

圖3 桉樹組培苗接種HY01處理后發(fā)病情況

注：圖A－C：從左到右依次為無菌水對照組，接種菌株HY01處理和接種菌株YJ01處理。

進一步對不同菌株致病力進行了苗木測試，結(jié)果如圖4和表2。桉樹組培苗經(jīng)不同菌株接種處理后，分別對桉樹組培苗不同處理每天發(fā)病株數(shù)進行線性回歸方程分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同菌株的發(fā)病率多集中在第4 天至第5 天表現(xiàn)出典型的感染癥狀(表3)，其中YJ01處理最早達到發(fā)病高峰期(理論值為3.83 d)，試驗期內(nèi)其處理平均發(fā)病率最低(40.00%)，DA02處理苗木至發(fā)病高峰期的時間最長，超過5 d?？傮w而言，致處理桉樹苗木平均發(fā)病率最大的菌株為DA03，平均發(fā)病率為86.67％，超過80％的菌株還有HY01、HP02、HP05。

圖4　桉樹組培苗接種不同來源的菌株后日發(fā)病率情況率情況

表2　不同菌株總平均發(fā)病率比較

注：顯著性列中為平均值數(shù)值處理后比較結(jié)果，不同大寫字母表示在0.01水平上差異極顯著，小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。下同。

以最后菌株的平均發(fā)病率值分別對測試菌株進行單因素方差分析，表明各病原菌在致病性(平均發(fā)病率值)上存在極顯著的差異(<0.01)，最低平均發(fā)病率的YJ01(40%)與最大平均發(fā)病率的DA03(86.67%)，HP03(生物型4-1)菌株與DA03、HP05菌株在致病性表現(xiàn)出極顯著差異(< 0.01)，同時HP03與HY01、HY02、YJ01、DA03、HP02、HP05均表現(xiàn)出0.05水平上的顯著差異。采用K-均值聚類分析法(K=3)，以發(fā)病高峰期、高峰期發(fā)病率和平均發(fā)病率為變量，對不同地理來源菌株間致病性差異比較，結(jié)果表明HY01、HY02、DA01、HP04和HP05聚為第1類，DA02和DA03聚為第2類，其余為第3類(表3)。對4個不同來源(采樣點)的菌株平均發(fā)病率進行方差分析，結(jié)果表明，來源廣東陽江菌株與其他3個來源地菌株在致病性上差異顯著(圖5)。

圖5　不同來源菌株致病性比較分析

3 討論與結(jié)論

由勞爾氏菌引起的青枯病具有遺傳多樣性，其寄主、地理分布、致病性以及生物型均有差異[19]。本研究結(jié)果表明，分離獲得的病菌菌株進行致病性的測試，接種桉樹組培苗試驗后，觀察到的發(fā)病癥狀與林間自然發(fā)病一致，盡管不同種源的菌株之間在致病力中存在著顯著差異，但經(jīng)生化型測定[12]以及16S rDNA序列分析鑒定，桉樹青枯病均由病原菌引起，也說明不同種源以及同一種源內(nèi)的存在著地理分布、致病性以及生物型等方面的差異。已有的研究表明我國的桉樹青枯病菌株的主要為生理型3，與其宿主的互作機制中，青枯病菌屬于分泌蛋白型細菌( proteobacteria)的III型(Type III Secretion System，T3SS)[20]，而青枯病病菌致病力大小與保守T3SS序列中作用的效應(yīng)因子類型有關(guān)[21]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株致病力與地理來源無明顯的關(guān)聯(lián)性，即使具有高度同源的16S rRNA基因，來源于同一區(qū)域菌株在致病力存在著差異，不同生物型致病性亦無顯著性差異，這也表明不同地理區(qū)域的青枯菌在與其寄主長期協(xié)同進化的過程中,會演化出明顯的生理分化或菌系多樣性，這些可能與其T3SS效應(yīng)因子的Rip (protein injected into plant cells)基因多樣性密切相關(guān)[21]。本研究僅對1個桉樹無性系進行致病性測試，不同地理來源菌株對其他桉樹品系的致病力是否一致，有待于進一步研究。綜上所述，桉樹青枯菌種群組成較復(fù)雜。因此在生產(chǎn)實踐中對桉樹青枯病生物防治時，應(yīng)充分了解各桉樹栽培區(qū)病菌的致病力等方面的差異以及其作用機制，以此有針對性地進一步的生物防治、抗性桉樹無性系選育等試驗研究。

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Molecular Identification and Pathogenicity Bacterial Wilt Isolated from DifferentClones

WANG Yan1,2, XIE Yao-jian1, LI Guo-qing1, WU Zhi-hua1

11isolates obtained from differentclones were used to identify phylogeny and compare differences in pathogenicity. Tissue culture seedlings of the hybrid eucalypt clone DH32-29 were used in pathogenicity tests, which involved infection by dipping of wounded roots. The results of phylogeny showed that the 16S rRNA sequences of all 11 isolates were highly homologous tothe type strain ofwith86% bootstrap support, and all belonged to the same phylotype. There were significant differences in wilt incidence among 11 isolates (<0.01 to<0.05). Based on three features of the isolates – fastigium, pathogenicity of fastigium and mean morbidity – the isolates were segregated into 3 groups by clustering on k-means: HY01, HY02, DA01, HP04 and HP05 formed one group; DA02 and DA03 formed a second group; and, YJ01, HP01, HP02 and HP03 formed a third group. One-way analysis of variance (ANOVA) was used to compare wilt pathogenicity of the 11 isolates, which had been collected from four different locations; the results showed that an isolate collected from Yangjiang, Guangdong province, differed significantly (<0.01) to all others in this respect. In view of all factors, there was no significant difference (<0.05) in wilt incidence between 2 of the biovars (biovar 3 and biovar 4-1), which had been obtained from the same plantation. The results from this study provide technical support to both efforts to prevent and control the occurrence ofbacterial wilt and also to the breeding of resistant eucalypt varieties for the eucalypt industry in southern China.

bacterial wilt; molecular identification; pathogenicity; biovar

S763.13

A

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃專題“南方短周期工業(yè)用材林病蟲害控制技術(shù)”(2012BAD19B0802)

王艷(1986—)，碩士，助理工程師，主要從事森林可持續(xù)發(fā)展研究.

吳志華(1974—)，碩士，副研究員. E-mail:wzhua2889@163.com