陳果 李曄

摘要：文章對彗星實驗在不同真核生物細胞DNA損傷中的應用進行了總結，并介紹了基于彗星實驗對植物、動物、人體細胞損傷的研究成果，同時也對彗星實驗的應用范圍、發(fā)展趨勢和前景做出了展望。

關鍵詞：彗星實驗技術；DNA損傷；真核細胞；損傷檢測；遺傳毒理問題 文獻標識碼：A

中圖分類號：Q523 文章編號：1009-2374（2016）06-0055-03 DOI：10.13535/j.cnki.11-4406/n.2016.06.028

隨著經濟的快速發(fā)展、城市化進程加快，環(huán)境問題成為人們日益關注的熱點問題。工業(yè)三廢、電離輻射、化學農藥等有毒有害物質對生物界造成了極大的危害，它們不但影響生物的生命活動，而且會影響下一代的遺傳性狀。因此，研究DNA損傷等遺傳毒理問題對于環(huán)境安全評價具有重要的意義。

目前，DNA損傷的檢測方法可以分為間接檢測DNA損傷和直接檢測DNA損傷。彗星實驗是直接檢測DNA損傷的一種方法，也稱單細胞凝膠電泳，1984年由Ostling建立，經Singh等改進。該檢測方法具有靈敏度高、所需樣品量少、應用范圍廣、材料消耗少、技術簡單、時間短、可進行單細胞水平的原位檢測等特點，被廣泛地應用于真核細胞的DNA損傷與修復、遺傳毒理、環(huán)境監(jiān)測以及氧化應激和細胞凋亡等相關研究中。

目前關于彗星實驗技術的應用進展大多從其應用領域、范圍著手，一定意義上限制了彗星實驗在細胞層面上的科學意義以及更寬泛的應用前景。文章從細胞角度切入，歸納總結近些年真核細胞作為彗星實驗在應用發(fā)展過程中所存在的問題，并就其發(fā)展提出發(fā)展暢想。

1 彗星實驗

彗星實驗原理是細胞經過實驗中裂解、DNA解鏈等過程后，電泳時損傷的DNA從核中溢出，朝陽極方向泳動，產生一個尾狀帶，未損傷的DNA部分保持球形，二者共同形成“彗星”。在一定范圍內，“彗星”的長度（代表DNA遷移距離）和經熒光染色后“彗星”熒光強度與DNA損傷程度相關，這樣就可以定量檢測單個細胞中的DNA損傷。通常實驗經過四個步驟：裂解、解旋、電泳及染色、鏡檢和圖像分析。

1.1 裂解

裂解細胞的目的是破膜、去蛋白，以便使斷裂的DNA片段能夠在外電場作用下從細胞核中遷移出來。去除細胞內蛋白主要有兩種方法高鹽鹽析和蛋白消化。

1.2 解旋

解旋是為了能夠降解對實驗干擾的RNA，將雙鏈DNA變成單鏈。通常采用pH大于13的堿性解旋液。這是因為高堿能夠降解RNA，同時又會讓DNA氫鍵斷裂解螺旋，變成單鏈。

1.3 電泳及染色

通常根據實驗要求設定場強0.5～14V/cm，室溫下進行電泳。要求靈敏度時必須在可控溫條件下進行。通常采用溴化乙錠（EB）染色。但有研究發(fā)現(xiàn)YOYO-1比EB有更高的熒光強度。

1.4 鏡檢和圖像分析

顯微鏡可直接觀察到彗星實驗的結果，分析通常采用商業(yè)軟件，較出名的有Komet，由Kinetic公司開發(fā)。

2 彗星實驗對不同真核細胞DNA損傷檢測應用

理論上，幾乎所有的真核細胞發(fā)生的DNA損傷都可以用彗星實驗來檢驗，包括人工培養(yǎng)的細胞株或者從動物組織分離出來的細胞，都可在離體或活體染毒后進行彗星實驗，但實際應用中受到很多限制。

2.1 對動物細胞DNA損傷檢測

動物細胞DNA損傷檢測的應用多集中在對動物血液、淋巴和骨髓細胞、肝腎等臟器細胞、生殖細胞等方面DNA損傷的檢測。

2.1.1 動物血液和骨髓、淋巴細胞DNA損傷檢測。對實驗動物血液、骨髓、淋巴細胞DNA損傷檢測實驗在近些年被廣泛應用到新藥評價、生物醫(yī)藥學、環(huán)境遺傳物質檢測、環(huán)境檢測、生物監(jiān)測以及海洋毒性物質檢測等各個領域中來，并且也進行了實驗條件的改造和

優(yōu)化。

Clements et al用五種除草劑在燒杯中對牛蛙的蝌蚪進行直接暴露實驗，收集紅細胞立即進行彗星實驗，結果顯示所有的除草劑均能引起彗星尾巴的增多。王軍霞等人研究了甲苯和甲醛聯(lián)合吸入染毒方式對小鼠骨髓細胞的遺傳毒性作用，結果顯示甲醛和甲苯這兩種物質對骨髓細胞彗星尾部DNA含量、彗星細胞尾距形成均有

影響。

2.1.2 動物臟器細胞DNA損傷檢測。彗星實驗在動物DNA損傷檢測中應用最多的集中在臟器損傷檢測。可用于彗星實驗的生物組織多種多樣，比如無脊椎動物的肌肉、腮、生殖腺、胚胎組織、消化腺、足、虹吸管等，脊椎動物的肝臟、腎臟、腸、脾、肌肉、腮、生殖腺以及植物和藻類的細胞等。

Nacci et al將苯并[a]芘添加到比目魚食物中，發(fā)現(xiàn)魚體只有腸道細胞DNA損傷具有統(tǒng)計意義。張青碧等人用小鼠肝細胞彗星實驗檢測飲用水氯化消毒前后的誘變性，結果表明：水源水和氯化消毒飲用水都能誘導動物細胞DNA損傷，經氯化消毒過后的飲用水其消毒產生的氯化副產物比水源水具有更強的致突變性。

2.1.3 動物生殖細胞DNA損傷檢測。對生殖細胞的DNA損傷檢測是遺傳毒性檢測的一部分，也是基因毒性檢測的一部分。越來越多的環(huán)境毒物暴露是此項檢測越來越普遍的一個最重要的原因，盡管這些檢測的方法基本一致，但對人類“趨利避害”還是具有重要意義的。

王曉平等人用不同劑量的甲醛對小鼠睪丸細胞進行染毒，用彗星實驗檢測睪丸細胞的損傷效應，結果顯示：甲醛在10、25、50μg·L-1時具有斷裂效應，在75μg·L-1時既有斷裂也有交聯(lián)作用。甲醛致睪丸細胞斷裂的臨界濃度在10μg·L-1左右，峰值濃度在50μg·L-1附近。郭紅剛等為了研究丙烯酰胺致小鼠睪丸細胞和外周血淋巴細胞DNA的損傷及修復情況，結果表明，兩種組織細胞可能是丙烯酰胺的作用位點；機體對丙烯酰胺造成的遺傳損傷有一定的修復能力；與淋巴細胞相比，睪丸細胞對丙烯酰胺導致的遺傳損傷更為敏感。高紅霞等人選取三類污灌農田土壤為研究對象，地下水灌溉的土壤為對照，提取土壤中的有機物，并用彗星試驗檢測土壤有機提取物對原代大鼠肝細胞DNA的損傷情況。結果顯示四組有機物的三個劑量組（0.3g·mL-1、0.6g·mL-1、0.9g·mL-1）均可導致DNA遷移長度增加，拖尾率增高；污灌的三組與對照組相同染毒劑量比較，DNA遷移長度增加，拖尾率增高。

2.2 對植物細胞DNA損傷檢測

1996年Kappen首次將彗星實驗技術引入到植物研究中，利用彗星實驗檢測到遺傳毒性物質能夠引起蠶豆根尖DNA雙鏈斷裂。近些年來，彗星實驗在植物環(huán)境檢測、污染治理和生態(tài)評估等方面的應用已經非常廣泛和

普遍。

張旭紅等人以蠶豆為研究對象，采用堿性、半堿性和中性彗星實驗方法研究Cd對植物DNA的損傷，結果表明Cd能夠引起蠶豆葉片DNA損傷，但是不同Cd濃度引起DNA損傷的種類不同。林愛軍等研究證實，骨炭灰能夠有效降低水溶態(tài)和交換態(tài)Pb、Cr、Cu的濃度，從而可以有效降低重金屬在植物體內累積，減少因重金屬污染對食物鏈上游生物的危害，通過植物彗星實驗發(fā)現(xiàn)，加入骨炭灰后植物細胞DNA損傷明顯降低。

2.3 對人體細胞DNA損傷檢測

對人體細胞DNA損傷檢測大體分為兩大類：一類是對經常接觸有毒有害物質的正常人群損傷檢測；另一類是對患者或者培養(yǎng)的人類癌細胞或者病變細胞的損傷檢測。這些檢測應用廣泛，但方法上還需略微改進。

2.3.1 對人體正常細胞DNA損傷檢測。李林鵬等人為了評估三氯生（TCS）和三氯卡班（TCC）對人體的遺傳毒性，利用彗星實驗研究兩種污染物對正常人肝細胞（L02）DNA的損傷效應。結果發(fā)現(xiàn)：三氯生和三氯卡班皆能引起人體肝細胞的DNA損傷，并呈現(xiàn)顯著的劑量-效應關系和時間效應關系。相比于TCS而言，L02細胞對TCC更為敏感，在低暴露劑量（2.38μmol·L-1）下就可以引起DNA斷裂損傷。孫明霞等人將人晶狀體上皮細胞（hLECs）置于sXc-1800細胞輻照系統(tǒng)內連續(xù)輻照2h，輻照強度[比吸收率（specific absorption rate，SAR）]輻照A、B、C、D組分別為1.0、2.0、3.0、4.0W·kg-1，輻照后0.0、0.5、1.0h分別進行彗星實驗，檢測細胞DNA的損傷及其修復情況，結果表明：SAR≤3W·kg-1的1.8GHz手機微波短期急性作用對體外培養(yǎng)的hLECs的DNA不產生或產生可修復的損傷，對其后的細胞增殖情況亦無影響，4.0W·kg-1的輻照劑量可導致細胞DNA不可逆性損傷，使細胞的增殖率下降。

對人體細胞的檢測因其直接性，往往能夠直觀地說明人體受損傷情況及保護和回復情況。理論上人體細胞是可以做這種檢測的，這對于人體健康來說具有很重大的意義。但實際上并非如此，盡管人體細胞培養(yǎng)已經很成熟，但人體對于異型生物質、毒物等的處理機制還是不能通過這些直接檢測手段完全驗證。體內體外實驗綜合運用又具有一定的實行障礙，所以對人體細胞的DNA損傷檢測結果和方法上的探討是下一步彗星實驗在人體細胞損傷檢測上的一個重要方向。

2.3.2 對人體病變細胞DNA損傷檢測的應用。孫麗蕊等人取15例宮頸鱗癌放療患者放療前及放療累積劑量為0Gy、10Gy、20Gy、30Gy、40Gy、50Gy、60Gy時的外周靜脈血，以彗星實驗檢測淋巴細胞的DNA損傷，結果表明：各累積劑量組淋巴細胞DNA拖尾率比照射前顯著升高（P<0.01）。史夢等用彗星實驗檢測不同濃度過氧化氫（H2O2）誘導的K562細胞、伊馬替尼預處理K562細胞的DNA損傷模型；用彗星實驗對各組細胞在DNA損傷后的修復進行動態(tài)觀測。結果顯示，經伊馬替尼預處理的K562細胞修復時間為120min，與未處理組修復時間60min相比，前者DNA損傷修復時間明顯延長（F=97.79，P<0.05）。

對病變或者癌癥細胞的DNA損傷檢測屬于醫(yī)學檢測的范圍，通常是被用作一種驗證實驗來進行。而且需要將彗星實驗標準定量化，實驗結果才能更有用、有效。因此要與其他實驗結合才能更好地說明某種物質的損傷程度或者某種損傷的機制。

3 展望

彗星實驗作為一種檢測真核細胞中DNA雙鏈單鏈斷裂的方法已經廣泛應用到遺傳毒理、環(huán)境生態(tài)監(jiān)測、臨床、飲食、氧化應激以及細胞凋亡等研究。在中國尤其是從2002年至今，該方法已被熟練應用到DNA損傷檢測中，但對于微生物和原生動物的DNA彗星實驗一直很少，這主要是由于微生物和原生動物的自身結構及DNA含量少等原因造成的。但由于微生物、原生動物對于環(huán)境污染程度具有良好的指示作用，因此微生物、原生動物的彗星實驗成為彗星實驗發(fā)展的一個新方向。但在實際應用過程中彗星實驗缺乏一個針對特定細胞相對標準的實驗體系，而且對DNA損傷檢測結果評價缺乏機制性的探討。

彗星實驗的未來發(fā)展趨勢：一是針對目標細胞進行相應的實驗方法上的創(chuàng)新改進；二是對于某些實驗中最主要的步驟要標準化；三是彗星實驗的評價結果分析要透徹；四是對于微生物和原生生物等其他真核生物的應用。隨著彗星實驗技術的不斷發(fā)展和完善，相信彗星實驗可以在解決實際科學問題方面以及實際應用方面都會取得卓越的成績。

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基金項目：環(huán)保公益項目（201109039）。

作者簡介：陳果（1976-），男，沈陽環(huán)境科學研究院工程師，研究方向：危險廢物處置與污染場地修復技術。

（責任編輯：陳 潔）