鄒　迪　張守琳　王銀萍　王宏安　崔成姬

(長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腎病科，吉林　長春　130021)

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枸芪復(fù)腎丸對(duì)IgA腎病模型大鼠MMP-9、TIMP-1的影響

鄒迪張守琳王銀萍王宏安崔成姬

(長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腎病科，吉林長春130021)

〔摘要〕目的探討枸芪復(fù)腎丸治療IgA腎病的療效及作用機(jī)制。方法72只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、血尿膠囊組、枸芪復(fù)腎丸高、中、低劑量組。采用口服BSA和尾靜脈注射LPS方法建立IgA腎病大鼠模型。觀察給藥8 w后大鼠各時(shí)相尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、24 h尿蛋白定量(UTP)；腎組織基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、金屬蛋白酶組織抑制物(TIMP)-1的含量變化。結(jié)果給藥后各組大鼠尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)及UTP均有所下降，其中枸芪復(fù)腎丸中劑量組明顯優(yōu)于血尿膠囊組(P<0.05)；與空白組比，模型組大鼠血清及腎組織中MMP-9含量明顯降低，而TIMP-1含量升高，MMP-9/TIMP-1下降(P<0.05)；給藥后，治療組MMP-9含量明顯升高，TIMP-1含量明顯降低，MMP-9/TIMP-1升高，其中枸芪復(fù)腎丸中劑量組優(yōu)于血尿膠囊組(P<0.05)。結(jié)論枸芪復(fù)腎丸能降低IgA腎病血尿、蛋白尿。

〔關(guān)鍵詞〕枸芪復(fù)腎丸；IgA腎病；MMP-9；TIMP-1

第一作者：鄒迪(1980-)，女，主治醫(yī)師，主要從事腎病研究。

IgA腎病是臨床常見的原發(fā)性腎小球疾病之一，以腎臟病理顯示以IgA為主的免疫復(fù)合物沉積在腎小球系膜區(qū)為特征〔1〕。在我國和全世界范圍內(nèi)的發(fā)病率均較高，在亞洲占腎活檢發(fā)病率的47.2%。有報(bào)道稱其20年終末期腎病發(fā)生率為15%~40%〔2〕。枸芪復(fù)腎丸是我院的院內(nèi)制劑，用于治療IgA腎病療效顯著，本文就進(jìn)一步研究該藥治療IgA腎病的療效作用機(jī)制進(jìn)行研究。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇6周齡健康清潔級(jí)雄性Wistar大鼠72只，體重160~200 g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及藥物熒光顯微鏡TXM-500C，上海天省儀器有限公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀318C，上海昨非實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；組織破碎機(jī)BIO-950，上海般諾生物科技有限公司?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9)及金屬蛋白酶組織抑制物(TIMP-1)ELISA檢測試劑盒，由上海信裕生物科技有限公司提供；牛血清白蛋白、脂多糖，美國sigma公司；熒光素標(biāo)記兔抗大鼠IgA抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司。血尿膠囊由鄭州市協(xié)和制藥廠生產(chǎn)(國藥準(zhǔn)字Z20003007)；枸芪復(fù)腎丸，長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室〔長衛(wèi)藥制字(96)1413號(hào)〕。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1造模方法大鼠購買后先飼養(yǎng)1 w，以適應(yīng)環(huán)境，隨機(jī)分為空白組、模型組、血尿膠囊組、枸芪復(fù)腎丸高、中、低劑量組。1 w后參照陸慧渝等〔3〕報(bào)道的方法制備動(dòng)物模型，于第9周每組各選取2只，取腎組織行光鏡檢查驗(yàn)證模型是否成功。

1.2.2分組及給藥驗(yàn)證模型成功后，給予血尿膠囊對(duì)照組每日灌胃血尿膠囊0.547 g/kg；給予枸芪復(fù)腎丸高劑量組5.625 g·kg-1·d-1灌胃、中劑量組2.813 g·kg-1·d-1灌胃、低劑量組1.406 g·kg-1·d-1灌胃；空白組及模型組每天僅給予生理鹽水灌胃，4 ml/只。共給藥8 w。

1.2.3觀測指標(biāo)觀察大鼠的一般狀態(tài)，包括：體重、毛發(fā)、排尿的顏色及尿量，分別于第0、4、6、8、10、12、14、16周末，用代謝籠收集24 h尿液，觀察尿液顏色，記錄尿量、肉眼血尿次數(shù)及程度，取部分尿液行24 h尿蛋白測定，應(yīng)用尿沉渣法檢測尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，采用ELISA法分別檢測腎組織中MMP-9和TIMP-1含量(詳見試劑盒說明)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析單因素方差分析和多因素方差分析。

2結(jié)果

2.1一般情況實(shí)驗(yàn)過程中給予四氯化碳溶液及脂多糖后造模組共死亡5只，后每籠選取2只用于驗(yàn)證模型是否成功?？瞻捉M大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，狀態(tài)始終良好，無明顯異常。造模4 w各組大鼠出現(xiàn)進(jìn)食和活動(dòng)減少，毛色晦暗，體重下降、腹瀉及尿色變深；給藥后各治療組大鼠一般狀況明顯好轉(zhuǎn)，體重有所增加。

2.2各組大鼠尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)比較與空白組比較，其余各組大鼠6 w后尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)開始升高，且差異隨應(yīng)用藥物時(shí)間的延長逐漸增大；與模型組比較，血尿膠囊組與枸芪復(fù)腎丸組尿紅細(xì)胞均明顯減少，組間比較枸芪復(fù)腎丸組下降程度更加明顯(P<0.05)。見表1。

2.3各組大鼠24 h尿蛋白定量變化的比較與空白組比較，其余各組大鼠6 w后24 h尿蛋白定量開始出現(xiàn)差異，且差異隨應(yīng)用藥物時(shí)間的延長逐漸增大；與模型組比較，血尿膠囊組與枸芪復(fù)腎丸組24 h尿蛋白定量均明顯減少，組間比較枸芪復(fù)腎丸組下降程度更為明顯(P<0.05)。見表2。

2.4各組大鼠的腎組織中MMP-9、TIMP-1含量變化的比較與空白組比較，各組腎組織中MMP-9、TIMP-1有明顯變化(P<0.01)。與模型組比較，血尿膠囊組及枸芪復(fù)腎丸組大鼠的表達(dá)有較明顯差異(P<0.05)，組間比較，枸芪復(fù)腎丸組改變更加明顯(P<0.05)。MMP-9在空白組大鼠及治療組大鼠中含量較高，而模型組含量較少，TIMP-1在空白組大鼠及治療組大鼠中含量較低，而模型組含量較高。與空白組比較，各組腎組織中MMP-9/TIMP-1有明顯變化(P<0.05)。與模型組比較，枸芪復(fù)腎丸組及血尿膠囊組大鼠的表達(dá)有較明顯差異(P<0.05)，枸芪復(fù)腎丸組下降程度更加顯著(P<0.05)。見表3。

表1　治療前后各組大鼠各時(shí)相尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較±s,n=12)

與空白組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05；與血尿膠囊組比較：4)P<0.05；與枸芪復(fù)腎丸中劑量組比較：5)P<0.05，表2同

表2　治療前后各組大鼠24 h尿蛋白定量的比較

表3　各組大鼠腎組織中MMP-9、TIMP-1含量(pg/ml)及

與空白組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05；與血尿膠囊組比較：3)P<0.05；與枸芪復(fù)腎丸中劑量組比較：4)P<0.05

3討論

現(xiàn)代研究認(rèn)為：IgA 腎病是多種原因共同作用的結(jié)果〔4〕，在IgA腎病發(fā)病過程中多種因素可以導(dǎo)致腎小球硬化以及腎小管間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致腎衰竭。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的生成失衡和降解失衡可導(dǎo)致ECM過量積聚，導(dǎo)致腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，從而導(dǎo)致腎功能受損。TIMP是調(diào)節(jié)ECM生成和降解平衡的主要因素之一。MMP-9能夠降解ECM的膠原和非膠原成分；同時(shí)，MMP還受TIMP1和胞漿原性活性抑制物-1(PAI-1)的抑制。正常情況下ECM在這些因素的調(diào)解下處于動(dòng)態(tài)平衡，MMPs/TIMPs失衡是導(dǎo)致ECM降解異常的重要環(huán)節(jié)。研究表明，MMP-9/TIMP-1的異常表達(dá)在腎小球纖維化的進(jìn)展中起重要作用。在慢性間質(zhì)纖維化時(shí)，則有小管基底膜的增厚和小管間質(zhì)ECM的擴(kuò)增，其中小管上皮細(xì)胞對(duì)上述各因素的影響可能占有重要地位〔5〕。小管上皮細(xì)胞對(duì)ECM的影響還可以通過調(diào)節(jié)MMP的活性來實(shí)現(xiàn)。高糖引起近曲小管上皮細(xì)胞外Ⅳ型膠原(ColⅣ)和纖維連接蛋白(FN)的增加與TIMP1和TIMP2的增加有關(guān)〔6〕。試驗(yàn)以證明低氧引起的ECM增加與MMP2活性降低和TIMP1的增加有關(guān)。除小管上皮基底膜增厚外，有時(shí)可以見到基底膜的斷裂，這與ECM被MMP降解有關(guān)。因此可推測，MMP-9的含量與IgA模型大鼠的病情呈正相關(guān)，TIMP-1的含量與IgA模型大鼠的病情呈負(fù)相關(guān)。因此，可以通過調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1 在腎臟組織中的表達(dá)來改善腎小球纖維化的病變程度。

目前研究認(rèn)為，由IgA腎病引發(fā)腎小球源性血尿、蛋白尿大約在10~20年可進(jìn)展為終末期腎病。因此，積極控制血尿是不容忽視的問題。中醫(yī)藥治療IgA腎病取得了很好的療效，已經(jīng)被大量臨床實(shí)踐證明〔7~10〕。

枸芪復(fù)腎丸是我院名老中醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)方，是根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)研制而成，在臨床上效果較好，尤其是用于IgA腎病，可顯著降低血尿、蛋白尿。方中枸杞子、黃芪為君藥，黃芪與枸杞子同用既能補(bǔ)腎健脾有利于長養(yǎng)腎精精髓，同時(shí)能利尿祛濕。臣以生地黃、女貞子、旱蓮草、二薊既能助君藥清熱涼血止血以治標(biāo)，同時(shí)又能補(bǔ)腎養(yǎng)陰以培其本；佐使藥為槐花、赤芍、當(dāng)歸、益母草、白茅根、牡丹皮、梔子、大黃，可助君藥涼血止血而不留瘀。諸藥合用，攻補(bǔ)兼施，共奏補(bǔ)腎健脾以扶正，清熱涼血利濕，化瘀通絡(luò)以祛邪的作用，使血止而不留瘀。

本實(shí)驗(yàn)證明MMP-9、TIMP-1的表達(dá)與IgA腎病相關(guān)。經(jīng)枸芪復(fù)腎丸治療后，大鼠IgA腎病癥狀明顯改善，腎臟及血清中MMP-9、TIMP-1變化明顯改善，揭示了枸芪復(fù)腎丸可能通過調(diào)節(jié)MMP-9、TIMP-1的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1，起到治療作用。

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〔2015-03-27修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者：張守琳(1969-)，女，主任醫(yī)師，主要從事腎病研究。

基金項(xiàng)目：吉林省科技廳資助項(xiàng)目(20130206071YY；2015101214JC)；吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2014第65號(hào))

〔中圖分類號(hào)〕R28

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)03-0549-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.014