康曉育，李幗英，趙新紅

試驗(yàn)研究

4個(gè)蘋果品種和2種砧木試管苗對(duì)熱處理脫毒效應(yīng)的研究

康曉育，李幗英，趙新紅

本試驗(yàn)采用變溫?zé)崽幚斫Y(jié)合莖尖培養(yǎng)對(duì)4個(gè)蘋果品種和2種砧木組培苗脫除潛隱性病毒的效應(yīng)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：不同的蘋果品種和砧木耐熱性不同。其中王林、珠美海棠的耐熱性最強(qiáng)，L-6、金矮生的耐熱性居中，首紅、天汪1號(hào)耐熱性最差。在相同處理?xiàng)l件下，不同的蘋果基因型脫毒率存在差異。其中王林脫毒效率最高，3種病毒的同時(shí)脫除率達(dá)到100%；金矮生ACLSV和ASPV兩種病毒的同時(shí)脫除率達(dá)到100 %；ASGV的脫除率也在80%以上；株美海棠、L-6、天汪1號(hào)、首紅的脫除率較低。另外，不同病毒種類脫除的難易程度也存有差異，ACLSV最容易脫除，ASGV最難脫除，ASPV居中。

蘋果品種；砧木；熱處理；脫毒率

蘋果是世界四大水果之一，以其豐富的營養(yǎng)價(jià)值和較高的經(jīng)濟(jì)效益而成為世界上主要栽培的經(jīng)濟(jì)果樹。病毒病害是蘋果生產(chǎn)上的主要病害之一，蘋果樹受病毒侵染后，病毒在細(xì)胞核內(nèi)增殖，干擾、破壞樹體的正常生理機(jī)能，導(dǎo)致生長(zhǎng)勢(shì)減退，產(chǎn)量下降，品質(zhì)變劣，因此，果樹無毒化栽培已成為現(xiàn)代果樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展的方向[1]。

蘋果潛隱性病毒包括蘋果莖痘病毒(ASPV)、蘋果莖溝病毒(ASGV)、蘋果褪綠葉斑病毒(ACLSV)。該類病毒雖無明顯癥狀，但可導(dǎo)致果樹樹勢(shì)變?nèi)?，果品品質(zhì)變劣，給果樹生產(chǎn)帶來極大危害[2]。目前主要通過莖尖培養(yǎng)、熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)進(jìn)行脫除[3-5]。傳統(tǒng)的病毒檢測(cè)一般采用酶聯(lián)免疫法，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前逐漸被先進(jìn)的RT-PCR方法代替[6-9]。由于不同的果樹品種有其不同的結(jié)構(gòu)和生理特點(diǎn)[10]，因此脫毒效率各不相同。

本試驗(yàn)以4個(gè)蘋果品種和2種砧木為試材，采用熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)進(jìn)行脫毒處理，比較不同基因型和砧木在脫毒過程中的反應(yīng)和脫毒效率，以期為蘋果病毒的脫除方法研究提供指導(dǎo)，同時(shí)為蘋果品種和砧木無病毒材料的繁育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在天水市果樹研究所植物組培室進(jìn)行。供試材料為組培室現(xiàn)有蘋果砧木試管苗珠美海棠、L-6，蘋果品種試管苗天汪1號(hào)、王林、首紅、金矮生及各品種和砧木田間生長(zhǎng)旺梢。試管苗的繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+ NAA 0.5 mg/L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單純莖尖培養(yǎng) 在新梢生長(zhǎng)最快時(shí)期(5月中下旬), 選擇大田生長(zhǎng)健壯的母樹，采集生長(zhǎng)旺盛、長(zhǎng)約2～3 cm頂梢，去葉后作為外植體，用洗滌劑水浸3 min 后, 流水沖洗60～90 min；移入超凈工作臺(tái)上操作，倒入75% 的乙醇浸泡30 s，蒸餾水沖洗后放入0.1%升汞(HgCl2)中消毒10 min，無菌水沖洗3～5次，用滅菌濾紙吸干表面水分，在解剖鏡下迅速剝?nèi)?.5 mm莖尖進(jìn)行分離培養(yǎng)。所用培養(yǎng)基為MS +6-BA 1.0 mg / L +NAA0.1 mg / L。

1.2.2 高溫?zé)崽幚斫Y(jié)合莖尖培養(yǎng)方法 將莖尖培養(yǎng)誘導(dǎo)形成的分化芽轉(zhuǎn)入MS+6-BA0.5 mg/L+ NAA 0.5 mg/L的繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)40 d左右時(shí)，剪取2～3 cm的芽轉(zhuǎn)接，每品種接10瓶，每瓶4株。先在室溫(24～26 ℃)條件下培養(yǎng)10 d，然后轉(zhuǎn)移到人工氣候箱中，白天14 h，晚上10 h，從25 ℃開始每天升高1 ℃，逐漸升溫至32 ℃。從32 ℃開始每天升1 ℃，繼續(xù)升溫至38 ℃時(shí)，控制溫度白天38 ℃、光照14 h，夜間32 ℃、10 h，處理30 d。熱處理結(jié)束后在無菌條件下對(duì)存活的組培苗切取未褐變、壞死的莖尖約0.5 mm接種于再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d。

1.2.3 病毒檢測(cè) 對(duì)熱處理后的瓶苗剪取0.5 mm莖尖繼續(xù)轉(zhuǎn)接在再生培養(yǎng)基中，以單株系進(jìn)行擴(kuò)繁，苗數(shù)達(dá)150～200株時(shí)，以1個(gè)培養(yǎng)瓶為1個(gè)樣本，隨機(jī)抽取3～4個(gè)樣本，每個(gè)樣本10～15株，將所選材料送至中國農(nóng)科院果樹研究所中國落葉果樹脫毒中心，利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)方法，檢測(cè)蘋果莖痘病毒(ASPV)、蘋果莖溝病毒(ASGV)、蘋果褪綠葉斑病毒(ACLSV)。對(duì)于單純莖尖培養(yǎng)脫毒的組培苗采用酶聯(lián)免疫分析法進(jìn)行脫毒檢測(cè)。

1.2.4 數(shù)據(jù)調(diào)查與結(jié)果統(tǒng)計(jì) 熱處理28 d后統(tǒng)計(jì)莖尖成活率、增殖系數(shù)，觀察記錄植株老葉與新梢的表現(xiàn)癥狀。熱處理后試管苗莖尖成活率統(tǒng)計(jì)：增殖系數(shù)=1 cm 以上的新梢數(shù)量/存活株數(shù)；莖尖成活率=(轉(zhuǎn)接的成活莖尖數(shù)/轉(zhuǎn)接莖尖總數(shù))×100%。病毒檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行脫毒率統(tǒng)計(jì)：脫毒率=(檢測(cè)呈陰性樣本數(shù)/檢測(cè)樣本總數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 單純莖尖培養(yǎng)脫毒效果

從田間采集6個(gè)樣品共135個(gè)莖尖進(jìn)行分離培養(yǎng)，成活35個(gè)，成活率為25.9%。采用酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)結(jié)果顯示，直接莖尖培養(yǎng)法脫毒效果很低，檢測(cè)35個(gè)蘋果莖尖，有2個(gè)莖尖脫除了蘋果褪綠葉斑病毒，有1個(gè)莖尖脫除了蘋果莖痘病毒，莖溝病毒則未能脫除。脫除率僅為8.57%(表1)。

2.2 熱處理+莖尖培養(yǎng)脫毒效果

表1 單純莖尖培養(yǎng)脫毒結(jié)果的比較

2.2.1 高溫?zé)崽幚韺?duì)莖尖成活率及植株生長(zhǎng)的影響 試管苗的最初培養(yǎng)溫度為25 ℃,逐步升溫至38 ℃,熱處理過程中組培苗長(zhǎng)期處于高溫高濕的微環(huán)境中,莖尖特別容易受害褐變死亡，而且死亡程度也各不相同。從表2可看出，不同試材的耐熱性存在差異。王林、珠美海棠試材耐熱性最強(qiáng)，莖尖成活率較高，老葉小部分枯死，新梢生長(zhǎng)良好；L-6、金矮生的耐熱性居中，植株老葉受害嚴(yán)重，但莖尖沒有受害；首紅、天汪1號(hào)耐熱性最差，莖尖成活率低，老葉基本全部枯死，較短新梢莖尖死亡，部分較長(zhǎng)新梢生長(zhǎng)良好。另外，4個(gè)蘋果品種和2種砧木增殖系數(shù)也存在明顯差異。珠美海棠增殖系數(shù)顯著高于其余品種或砧木，天汪1號(hào)、首紅則顯著低于其余品種或砧木，且二者之間也存在顯著性差異。

2.2.2 不同品種和砧木脫毒率的比較 由表3可以看出，3種病毒脫除的難易程度不同，ACLSV最易脫除，6個(gè)待檢樣品其脫除率達(dá)到100%；ASPV居中，王林和金矮生脫除率達(dá)到100%，其他4個(gè)脫除率在80%～95%；ASGV最難脫除，只有王林達(dá)到100%的脫除率，其他4個(gè)脫除率在65.8%～80.5%。單純莖尖培養(yǎng)脫除病毒也表現(xiàn)了這種趨勢(shì)。另外，不同的蘋果基因型脫毒效果存在差別，其中王林脫毒效率最高，3種病毒的同時(shí)脫除率達(dá)到100%。金矮生ACLSV和ASPV兩種病毒的同時(shí)脫除率達(dá)到100%，ASGV的脫除率也在80%以上。株美海棠、L-6、天汪1號(hào)、首紅的脫除率較低。

表2 試管苗熱處理對(duì)不同蘋果品種和砧木生長(zhǎng)的影響

表3 蘋果不同品種和砧木脫毒率的比較

3 討論

在莖尖脫毒技術(shù)中，因外植體大小不同，成活率和脫毒率相互制約，從脫毒這一目標(biāo)來看，要求莖尖越小越好，但是莖尖太小，自身營養(yǎng)就不足，越難分化，加之切分時(shí)機(jī)械損傷，所以污染率和死亡率也就越高。因此，應(yīng)該綜合考慮成活率和脫毒率兩個(gè)指標(biāo)來確定莖尖的大小，本試驗(yàn)采用的是0.5 mm的長(zhǎng)度。目前常用的脫毒方法有兩種：方法1單純莖尖培養(yǎng)和方法2熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)。綜合來說，方法2的脫毒率顯著高于方法1 ,這說明單獨(dú)使用小莖尖培養(yǎng)很難脫除果樹潛隱性病毒,而熱處理與小莖尖結(jié)合則可以較好地解決這個(gè)問題。這與變溫?zé)崽幚斫Y(jié)合莖尖培養(yǎng)獲得的苗子脫毒效果較好[11-13]研究結(jié)果一致，晏娜等[14]研究報(bào)道，采用38 ℃/32 ℃變溫?zé)崽幚磉m合大多數(shù)品種和砧木脫除蘋果潛隱性病毒。因此，該試驗(yàn)采用38 ℃/32 ℃變溫?zé)崽幚韺?duì)6種試材進(jìn)行脫毒，發(fā)現(xiàn)在相同熱處理?xiàng)l件下，蘋果基因型不同，病毒脫除效率不同。這與程玉琴等[11]的觀點(diǎn)一致。

該研究中，3種病毒各自的脫除率存在顯著差異?？傮w表現(xiàn)為ASGV最難脫， ACLSV最容易脫除，ASPV居中。不同病毒類型脫除率不同的原因，除與熱處理?xiàng)l件和寄主有關(guān)外，還可能與病毒本身的特性和結(jié)構(gòu)有直接關(guān)系。由3種病毒的病原學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[15-17]三者在形態(tài)長(zhǎng)度、體外鈍化溫度和體外保存時(shí)間均存在明顯差異，且表現(xiàn)出一定的規(guī)律性。如在體外鈍化溫度上，由高到低為ASGV>ASPV>ACLSV；那么這些特性是否與病毒脫除相關(guān)，還需要進(jìn)一步研究。另外研究也表明凡是脫除了ASGV的試材，其他兩種病毒也都是脫除了的，而脫除了ACLSV 和ASPV 的試材，ASGV未必脫除。因此，對(duì)攜帶有ASGV 的試材進(jìn)行脫毒處理后，可首先通過檢測(cè)ASGV進(jìn)行初選，再對(duì)ASGV檢測(cè)呈陰性的材料進(jìn)行其他病毒的檢測(cè)。這樣就可以大大減少病毒檢測(cè)的成本，提高檢測(cè)效率。

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書 訊

由煙臺(tái)市農(nóng)科院果樹所部分業(yè)內(nèi)專家合作編寫的《現(xiàn)代大櫻桃栽培》一書已由中國農(nóng)業(yè)出版社出版發(fā)行，該書是30多年來我國大櫻桃產(chǎn)業(yè)在品種選擇、栽培技術(shù)、產(chǎn)后處理及市場(chǎng)經(jīng)營模式等方面的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)。該書重點(diǎn)介紹了適宜我國大櫻桃栽培的地區(qū)氣候特點(diǎn)和區(qū)劃分布；對(duì)近年廣泛栽培的品種和砧木的生產(chǎn)表現(xiàn)進(jìn)行了總結(jié)和評(píng)價(jià)；從果園園址的選擇、定植時(shí)斜栽的好處，到紡錘形整枝和主要病蟲害防治都有論述，特別對(duì)大櫻桃根系生長(zhǎng)環(huán)境和規(guī)律的介紹說明了果園生草、覆草及穴貯肥水的良好效用，并對(duì)櫻桃園肥水一體化新技術(shù)做了概述；本書也系統(tǒng)全面地介紹了當(dāng)前我國櫻桃種植中的流膠病、裂果、根瘤病以及春霜凍的成因和防治最新進(jìn)展，以使讀者對(duì)這些問題有一個(gè)全面而準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)。希望本書的出版對(duì)我國櫻桃種植者、技術(shù)推廣及專業(yè)研究人員有所借鑒。

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(甘肅省天水市果樹研究所，甘肅 天水 741000)

Study the Effect of Thermotherapy Virus Eliminationment on Six Apple Cultivars and Rootstocks

Kang Xiaoyu, Li Guoyin, Zhao Xinhong

(Tianshui Institute of Forestry Sciences, Gansu Tianshui 741000)

s：Virus eliminationment for six apple cultivars and rootstocks was studied by heat treatment combined with shoot tip culture.The results showed that the heat resistance was different among these 6 apple cultivars and rootstocks.OrinandZumi showed the highest heat resistance. L-6andGoldengrowthshowedthe lower heat resistance than Orin and Zumi.Shouhong and Tianwang No．1 showed the lowest heat resistance. The virus elimination rates of different apple genotypes under the same treatment were different.The virus elimination rate ofACLSV、ASPV and ASGV on Orinwas the highest with the 100% at the same time. The virus elimination rate of ACLSV、ASPV on Goldengrowth were 100% and the virus elimination rate of ASGV also could reach more than 80%.The virus elimination rate of ACLSV、ASPV and ASGV on Zumi、L-6、Tianwang No．1 and Shouhong were lower. Different virus showed the different elimination rates, which ACLSV could be elimatedfasterly than ASGV and ASPV.

apple cultivars; rootstock; heat treatment; virus eliminationment rate

2016-03-30

康曉育(1987-)，女，甘肅天水人，碩士，主要從事果樹逆境生理與栽培技術(shù)研究。E-mail：kangxiaoyu8@163.com

1005-345X(2016)04-0001-04

S661.1

A