趙元增,單長卷,楊靖,孫海燕

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

MS培養(yǎng)基成分調(diào)整對太行菊不定芽增殖與生長的影響

趙元增,單長卷,楊靖,孫海燕

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

以太行菊不定芽為材料,通過調(diào)整MS基本培養(yǎng)基中的無機鹽、有機物質(zhì)與蔗糖的用量,研究MS培養(yǎng)基成分的變化對太行菊不定芽增殖和生長的影響.結(jié)果表明：與單獨加倍KNO3或KH2PO4用量相比,同時加倍MS培養(yǎng)基中KNO3與KH2PO4用量更有利于太行菊不定芽的增殖與生長,不定芽分化數(shù)量多,增殖系數(shù)高；培養(yǎng)基中NH4NO3用量加倍,對太行菊不定芽增殖與生長并無明顯的促進作用,不定芽生長較差,葉片扁平且小.去除MS培養(yǎng)基中的微量元素或用N6的微量元素代替MS培養(yǎng)基中的微量元素,致使太行菊不定芽分化數(shù)量減少.培養(yǎng)基中蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)過小或過大對太行菊不定芽的增殖與生長均不利,不定芽分化數(shù)量減少,增殖效率降低.綜合而言,適宜太行菊不定芽增殖與生長的培養(yǎng)基是改良MS（KNO3與KH2PO4用量加倍）+6-BA（0.4 mg/L）+NAA（0.1 mg/L）+蔗糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%）.

太行菊；不定芽；離體培養(yǎng)；增殖系數(shù)

太行菊[Opisthopappus taihangensis（Ling）Shih]為菊科太行菊屬多年生宿根草本植物,為我國太行山區(qū)獨有珍稀物種,僅分布于豫、晉、冀三省交界的太行山區(qū).由于分布區(qū)域狹窄,生境獨特,繁殖能力差,太行菊現(xiàn)處于瀕危狀態(tài),已被列為國家珍稀瀕危保護植物及河南省重點保護植物[1-2].與傳統(tǒng)藥用野菊相比,太行菊具有更好的保健或藥用功效,其整株的開發(fā)利用潛力巨大[3-4].另外,作為菊花的野生近緣種,太行菊也是菊花雜交育種理想的遺傳材料[5].近年來,出于對太行菊資源保護與綜合開發(fā)的需要,對太行菊的遺傳多樣性[6-7]、生殖生理[8-11]、遠(yuǎn)緣雜交[12-16]等的研究和報道逐漸增多.在太行菊的組培研究中,研究者多采用MS培養(yǎng)基作為離體培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基[17-20].由于太行菊多生長于海拔1 000 m左右的懸崖峭壁、裸露巖石的縫隙中,所處生境土壤稀少,有機質(zhì)、全氮含量較低,鈣含量較高[21],其生長發(fā)育對培養(yǎng)基基本成分的需求可能存在特殊性,組培中常用的MS培養(yǎng)基,其基本組成不一定完全適應(yīng)太行菊的生長發(fā)育.為此,本文對MS基本培養(yǎng)基的無機鹽、有機物、蔗糖用量進行了調(diào)整,探討MS基本成分的組成變化對太行菊不定芽增殖與生長的影響,以便建立有效的太行菊離體繁育技術(shù)體系,為太行菊種質(zhì)資源的保護和開發(fā)利用奠定基礎(chǔ),同時對太行菊的引種馴化與栽培也有指導(dǎo)意義.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

太行菊植株采自新鄉(xiāng)市關(guān)山國家地質(zhì)公園,接種材料為太行菊無菌不定芽.

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 大量元素用量調(diào)整保持MS基本培養(yǎng)基的其他成分不變,對NH4NO3、KNO3、KH2PO4用量做單獨或組合加倍處理,配制Ⅰ-1（基本MS）、Ⅰ-2（NH4NO3加倍）、Ⅰ-3（KNO3加倍）、Ⅰ-4（KH2PO4加倍）、Ⅰ-5（KNO3與KH2PO4加倍）5種培養(yǎng)基.

1.2.2 微量元素與有機成分調(diào)整在改良MS培養(yǎng)基（僅KNO3與KH2PO4用量加倍,其他成分保持不變）的基礎(chǔ)上,對培養(yǎng)基中的微量元素與有機成分作如下調(diào)整：Ⅱ-1（改良MS,CK）、Ⅱ-2（去掉全部微量元素）、Ⅱ-3（N6微量元素取代MS微量元素）、Ⅱ-4（去除MS有機成分,即維生素和氨基酸類）.

1.2.3 蔗糖用量調(diào)整在改良MS培養(yǎng)基（僅KNO3與KH2PO4用量加倍,其他成分保持不變）的基礎(chǔ)上,配制Ⅲ-1～Ⅲ-6不同蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0、1%、1.5%、2%、3%、5%）的培養(yǎng)基.

以上所有培養(yǎng)基均添加6-BA、NAA和瓊脂粉,添加后，3種成分的質(zhì)量濃度分別為0.4 mg/L、0.1 mg/L和4.6 g/L.pH調(diào)整為5.8.除Ⅲ-1～Ⅲ-6培養(yǎng)基外,其他各培養(yǎng)基均添加蔗糖,添加后的蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%.所有試劑均由上海晶純生化科技股份有限公司（阿拉丁）提供,其中外源激素類試劑為細(xì)胞培養(yǎng)級,其他試劑均為分析純（AR）.

1.3 試驗方法

1.3.1 接種與培養(yǎng)選取長勢、大小一致的太行菊不定芽塊,將其切成1 cm3大小,然后將芽塊分別接種于以上各培養(yǎng)基,每種培養(yǎng)基接種20瓶,每瓶接種3塊.接種時不定芽塊基部嵌入培養(yǎng)基,不定芽生長點外露.置于（25±1）℃,光周期12 h/d,1 500～2 000 lx光照強度下培養(yǎng).

1.3.2 調(diào)查項目與方法接種后7 d定期觀察、記錄不定芽的增殖與生長狀況.培養(yǎng)40 d時,記錄每個處理的接種不定芽塊總數(shù)、芽塊大小、不定芽長勢（不定芽的葉色、葉片長度、葉片枯死情況等）等結(jié)果.然后將增殖后的不定芽塊切割成與接種時的一致大小（1 cm3）,統(tǒng)計各處理增殖后芽塊的分割總塊數(shù),并計算各處理的增殖系數(shù)：不定芽增殖系數(shù)=增殖后芽塊的分割總塊數(shù)/接種芽塊總數(shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基中MS大量元素用量調(diào)整對太行菊不定芽增殖與生長的影響

將MS基本培養(yǎng)基中的NH4NO3、KNO3、KH2PO4用量做單獨或組合加倍調(diào)整后,太行菊不定芽在各培養(yǎng)基上的增殖與生長狀況結(jié)果見表1.

由表1可知,與CK（Ⅰ-1）相比,在NH4NO3用量加倍（Ⅰ-2）和KH2PO4用量加倍（Ⅰ-3）的培養(yǎng)基上,雖然也有不定芽的分化,但不定芽增殖系數(shù)都低于CK,不定芽塊偏小.從不定芽生長狀況看,KH2PO4用量加倍的處理與CK相似,不定芽生長基本正常,只是稍大的葉片（葉片長度≥8 mm）微微泛黃,葉尖、葉緣呈水浸狀,芽塊中夾雜少量黃褐色至褐色的枯葉.但在NH4NO3用量加倍的培養(yǎng)基上,不定芽形態(tài)與CK存在明顯差異：葉片扁平,葉面寬但縱軸短,其長度一般在7 mm以下,葉片卷曲相互層疊,使整個芽塊外觀扁平密實.

在KNO3用量加倍的培養(yǎng)基（Ⅰ-3與Ⅰ-5）上,不定芽增殖系數(shù)均高于CK,特別是在KNO3與KH2PO4用量同時加倍的培養(yǎng)基（Ⅰ-5）上,接種芽塊分化產(chǎn)生大量的不定芽,無論是芽塊大小還是不定芽增殖系數(shù)均達(dá)到最大.并且該培養(yǎng)基上的不定芽生長茁壯,葉色鮮綠,芽塊中幾乎沒有黃化或枯死的葉片.

由此可知,培養(yǎng)基中的MS大量元素用量對太行菊不定芽的增殖與生長狀況影響較大.與基本MS培養(yǎng)基相比,增大培養(yǎng)基中的KNO3用量,可促進太行菊不定芽的分化與生長,特別是KNO3與KH2PO4用量同時加倍時,對不定芽的增殖與生長的促進作用更為明顯,離體培養(yǎng)的效果更好.但單獨加倍培養(yǎng)基中的KH2PO4用量,并不能促進太行菊不定芽的增殖與生長.

2.2 培養(yǎng)基中微量元素與有機成分的改變對太行菊不定芽增殖與生長的影響

將培養(yǎng)基中的MS微量元素全部去除或用N6的微量元素替代,或?qū)⑴囵B(yǎng)基中的MS有機成分全部去掉,經(jīng)過這樣簡化處理的培養(yǎng)基,對太行菊不定芽增殖與生長的影響結(jié)果見表2.

由表2可知,與CK（Ⅱ-1）相比,若將培養(yǎng)基中的MS微量元素全部去除（Ⅱ-2）,將導(dǎo)致太行菊不定芽分化數(shù)量減少,芽塊變小,不定芽增殖系數(shù)大大降低.并且該培養(yǎng)基上的不定芽長勢變差,小的不定芽葉片卷曲,水浸透明,而較大的不定芽多數(shù)葉片黃化,芽塊中出現(xiàn)大量黃褐色至褐色的枯死的葉片.當(dāng)用N6微量元素代替MS微量元素（Ⅱ-3）后,與CK相比,不定芽分化數(shù)量減少,增殖系數(shù)降低.除存在少量黃褐色枯葉外,不定芽生長基本正常,且與CK相比,該培養(yǎng)基上的不定芽普遍較大,葉片狹長平展,較多的葉片長度可達(dá)15～20 mm.在有機成分全部去除的培養(yǎng)基（Ⅱ-4）上,芽塊大小與不定芽生長狀況與CK（Ⅱ-1）極為相似,只是在該培養(yǎng)基上,不定芽增殖系數(shù)有所降低,芽塊中存在少量黃褐色的枯葉.

由此可知,在太行菊不定芽的增殖培養(yǎng)中,除去培養(yǎng)基中的MS微量元素既不利于不定芽的增殖,也不利于不定芽的生長.若以N6微量元素取代MS微量元素,雖然不定芽分化數(shù)量減少,但不定芽生長茁壯,芽體普遍較大.相對而言,去除培養(yǎng)基中的MS有機成分,對太行菊不定芽的增殖與生長影響相對較小.

2.3 培養(yǎng)基中不同蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對太行菊不定芽增殖與生長的影響

培養(yǎng)基中蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不同對太行菊不定芽的增殖與生長影響較大,太行菊不定芽在各培養(yǎng)基上的增殖與生長狀況見表3.

由表3可知,在不含蔗糖的培養(yǎng)基上,接種后的不定芽既未黃化、枯死,也無明顯的增殖與生長,整個不定芽塊基本為接種時的大?。ㄖ睆?0 mm左右）.當(dāng)蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于2%時,隨著培養(yǎng)基中蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高,太行菊不定芽分化數(shù)量逐漸增多,增殖系數(shù)增大.當(dāng)蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%（Ⅱ-4培養(yǎng)基）時,芽塊上分化產(chǎn)生大量的不定芽,不定芽的增殖系數(shù)達(dá)到最大（6.36）,并且在該培養(yǎng)基上,不定芽的生長狀況也表現(xiàn)良好：不定芽葉片淡綠,葉片較大,葉片伸展正常,芽塊中幾乎無枯死葉片.當(dāng)培養(yǎng)基中的蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過2%后,不定芽分化數(shù)量減少,增殖系數(shù)降低.特別是當(dāng)蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到5%時,不定芽的分化與生長嚴(yán)重受阻,整個芽塊呈淡黃色,芽塊表面布滿大量淡黃色的顆粒狀小芽或點狀突起,較大的不定芽數(shù)量稀少,并且葉片水浸狀,黃色至黃褐色,葉片長度也僅有3～5 mm.

因此,在太行菊不定芽的離體培養(yǎng)中,培養(yǎng)基中過低或過高的蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對不定芽的增殖與生長均不利.綜合太行菊不定芽的增殖與生長狀況,培養(yǎng)基中蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)以2%為宜.

3 小結(jié)與討論

在植物的離體繁殖中,培養(yǎng)基中無機鹽的種類和含量是影響培養(yǎng)物增殖與分化的重要因素之一.針對不同植物對無機鹽的需求差異,研究者設(shè)計了不同類型的基本培養(yǎng)基,其中MS培養(yǎng)基是應(yīng)用最廣泛的一種基本培養(yǎng)基[22].從理論上講,MS培養(yǎng)基中的無機鹽濃度較高,微量元素及有機成分齊全而豐富,對多數(shù)植物的增殖培養(yǎng)而言,是較為理想的一種基本培養(yǎng)基[22].在對某種植物的無機鹽需求未知的情況下,常常選擇MS培養(yǎng)基作為離體繁殖的基本培養(yǎng)基.我們在前期試驗中通過對比不同類型的基本培養(yǎng)基對太行菊不定芽增殖與生長的影響發(fā)現(xiàn),對于太行菊的離體培養(yǎng)而言,MS培養(yǎng)基較其他培養(yǎng)基表現(xiàn)更好.但是,太行菊所處生境土壤稀少,有機質(zhì)和全氮的含量較低,鈣含量較高[21],其生長發(fā)育對無機鹽的需求可能存在特殊性,組培中常用的MS培養(yǎng)基,其基本組成不一定完全適合太行菊的生長發(fā)育.緣于此,本文對MS培養(yǎng)基中的無機鹽含量進行了調(diào)整,以探究培養(yǎng)基中不同的無機鹽水平對太行菊不定芽增殖與生長的影響.試驗結(jié)果表明,在MS培養(yǎng)基中其他成分含量保持不變的情況下,將培養(yǎng)基中KNO3和KH2PO4含量加倍,有利于太行菊不定芽的增殖與生長,并且KNO3與KH2PO4同時加倍的培養(yǎng)效果要比KNO3或KH2PO4單獨加倍時的效果好.在本文的試驗范圍內(nèi),將MS培養(yǎng)基中KNO3與KH2PO4用量同時加倍處理,對太行菊不定芽的增殖與生長是最適宜的.

在一般的離體繁殖中,培養(yǎng)基中使用的糖類多為蔗糖,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般為3%[22].由于蔗糖是培養(yǎng)基中使用量最大的試劑,從降低離體繁殖的成本考慮,在不影響離體培養(yǎng)效果的前提下,蔗糖使用量越低越好.在前期的預(yù)備試驗中,當(dāng)培養(yǎng)基中的蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于3%時,太行菊不定芽的增殖與生長狀況變差,本文的研究結(jié)果也證實,當(dāng)蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到5%,太行菊不定芽的分化和生長受到嚴(yán)重抑制.為此,本文主要探討了蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于3%時的情況.研究表明,培養(yǎng)基中蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)過低（2%以下）,不利于太行菊不定芽的增殖與生長,芽分化數(shù)量較少.當(dāng)蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%和3%時,不定芽的增殖與生長狀況差別不大.但從節(jié)省培養(yǎng)基成本考慮,使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的蔗糖進行太行菊的增殖培養(yǎng)更適宜.

對已分化成芽的培養(yǎng)物而言,有機物質(zhì)有時也并非是必需的.N6基本培養(yǎng)基中的微量元素種類和含量較MS培養(yǎng)基少,從生產(chǎn)實際考慮,若能以N6微量元素取代MS的微量元素,或去掉MS培養(yǎng)基中的有機物質(zhì),無論是從節(jié)省生產(chǎn)成本還是從簡化試驗操作復(fù)雜性而言,都具有重要意義.本文研究結(jié)果表明,去除MS培養(yǎng)基中的微量元素,或以N6微量元素取代MS的微量元素均不利于太行菊不定芽的增殖；不過,就單個不定芽的生長而言,N6基本培養(yǎng)基的微量元素更適合太行菊不定芽的生長.去掉MS培養(yǎng)基中的全部有機物質(zhì),從不定芽增殖與生長的綜合狀況看,都是不利的.

綜合而言,適合太行菊不定芽增殖和生長的培養(yǎng)基為：改良MS（KNO3與KH2PO4用量加倍）+6-BA 0.4 mg/L+NAA0.1 mg/L+蔗糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%）.

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（責(zé)任編輯：鄧天福）

Effect of composition adjustment of MS medium on adventitious buds propagation and growth of Opisthopappus taihangensis in vitro

ZHAO Yuanzeng,SHAN Changjuan,YANG Jing,SUN Haiyan
（Henan Institute ofScience and Technology,Xinxiang453003,China）

The effect of basic composition of MS medium under different content level based on the MS basic medium,including inorganic salts,organic substances and sucrose on Opisthopappus taihangensis adventitious buds proliferation and growth were investigated by using adventitious buds of O.taihangensis as test materials.The results showed that：The medium with double content of KNO3and KH2PO4based on the MS basic medium was more beneficial to the proliferation and growth of O.taihangensis adventitious buds compared with media doubling the content of KNO3or KH2PO4respectively.The number of O.taihangensis adventitious buds increased,and propagation coefficient improved on the adjusted medium with doubled content of KNO3and KH2PO4.The adjusted MS medium with the double content of NH4NO3had no positive effect on adventitious buds proliferation and growth,and the growth of O.taihangensis adventitious buds was inhibited in this medium.The number of adventitious buds decreased on media which micro-elements of MS basic medium were removed or substituted by micro-elements of N6 basic medium.It was not conductive to the proliferation and growth of adventitious buds at too high or low concentration of sucrose on a series of media.The number of O.taihangensis adventitious buds decreased,and propagation coefficient reduced on these medium.In conclusion,the adjusted medium with double content of KNO3and KH2PO4based on MS basic medium,added with 0.4 mg/L 6-BA,0.1 mg/L NAA and 2%sucrose was suitable for proliferation and growth of O.taihangensis adventitious buds.

Opisthopappus taihangensis；adventitious buds；culture in vitro；propagation coefficient

S567.23+9

A

1008-7516（2016）05-0007-05

10.3969/j.issn.1008-7516.2016.05.002

2016-05-22

河南省教育廳項目（14B210005）；河南科技學(xué)院博士科研啟動基金項目（201010612002）

趙元增（1974―）,男,山東蒙陰人,博士,副教授.主要從事植物細(xì)胞工程與遺傳育種研究.