李 磊， 許國(guó)超， 韓瑞枝， 倪 曄*

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122）

產(chǎn)D-海因酶微生物的篩選及其催化特性

李 磊1，2， 許國(guó)超1，2， 韓瑞枝1，2， 倪 曄*1，2

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122）

為獲得高活性和立體選擇性海因酶生產(chǎn)菌株，首先采用氨基酸關(guān)環(huán)法合成了數(shù)種5'-單取代海因衍生物及N-氨甲酰-氨基酸，建立了相關(guān)液相色譜檢測(cè)方法。然后以實(shí)驗(yàn)室保藏的野生菌株出發(fā)，利用底物誘導(dǎo)的方法篩選到6株具有D-海因酶活性的野生菌，其中熒光假單胞菌產(chǎn)生的D-海因酶具有較好的底物譜，較高的活性和立體選擇性。經(jīng)優(yōu)化后，其最適產(chǎn)酶溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間為12 h，發(fā)酵活力達(dá)到92.1 U/L。該菌催化D-海因水解的最適反應(yīng)溫度為60℃，pH 8.5。在50 mL體系中，利用0.25 g菌體（干重）可對(duì)映選擇性水解20 mmol/L對(duì)羥基苯海因底物，反應(yīng)3 h轉(zhuǎn)化率達(dá)到98%。

D-海因酶；D-氨基酸；熒光假單胞菌；5'-單取代海因

D-氨基酸是一類(lèi)重要的非天然氨基酸，廣泛分布在自然界中，如細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖[1]，抗菌肽[2]。此外，動(dòng)物體內(nèi)也存在游離態(tài)D-氨基酸，且具有一定的生理功能，如老鼠大腦中含有D-絲氨酸[3]。D-氨基酸及其衍生物是醫(yī)藥、農(nóng)藥、和食品等精細(xì)化工中的重要原料，例如：D-對(duì)羥基苯甘氨酸是β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的重要手性中間體，D-纈氨酸可應(yīng)用于合成殺蟲(chóng)劑，而D-丙氨酸是生產(chǎn)人造甜味劑—阿斯巴甜的重要原料[4]。鑒于D-氨基酸的重要作用，目前已有報(bào)道采用化學(xué)法、發(fā)酵法以及海因酶/氨甲酰酶、己內(nèi)酰胺酶、酯酶、氨基轉(zhuǎn)移酶、酮酸脫氫酶等酶催化方法用于D-氨基酸的合成，而海因酶法也是用于制備光學(xué)純手性氨基酸最高效和廣泛應(yīng)用的方法之一。

D-海因酶（D-hydantoinase，EC3.5.2.2），又稱(chēng)乙內(nèi)酰脲酶，多數(shù)為金屬離子依賴(lài)酶，一般為同源二聚體或四聚體，廣泛分布在微生物、動(dòng)物和植物中[5-6]，見(jiàn)圖1。它可以催化海因及5′-單取代海因中內(nèi)酰胺鍵開(kāi)環(huán)生成N-氨甲酰氨基酸，再經(jīng)去氨甲酰作用得到相應(yīng)的D-氨基酸。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)對(duì)D-氨基酸，尤其是生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素所需的D-對(duì)羥基氨基苯甘氨酸和D-苯甘氨酸需求量很大，而目前主要依賴(lài)進(jìn)口。由于發(fā)酵法或微生物轉(zhuǎn)化法具有周期短、效率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注。通過(guò)篩選具有高對(duì)映選擇性和催化活性的D-海因酶產(chǎn)生菌株，構(gòu)建用于D-氨基酸生產(chǎn)的高效生物轉(zhuǎn)化體系意義深遠(yuǎn)。已有文獻(xiàn)報(bào)道農(nóng)桿菌、假單胞菌、節(jié)桿菌和芽孢桿菌等菌屬[7-8]的微生物可以產(chǎn)生D-海因酶。

化學(xué)法合成5′-單取代海因衍生物的方法有多種，常用的有Suzuki法、縮合加氫法和氨基酸關(guān)環(huán)法[9]。雖然氨基酸關(guān)環(huán)法以氨基酸為初始底物，生產(chǎn)成本較高，然而其具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)物無(wú)毒、產(chǎn)物易分離、收率高等優(yōu)點(diǎn)，目前仍然是高效合成5′-單取代海因衍生物方法之一。

圖1 微生物催化海因底物的對(duì)映選擇性水解Fig.1 Enantioselective resolution of D，L-hydantoin into N-carbamyl-D-amino acid catalyzed by microorganism

作者利用氨基酸關(guān)環(huán)法合成了數(shù)種海因衍生物及其中間物質(zhì)N-氨甲酰氨基酸，然后以對(duì)羥基苯海因和異丁基海因不對(duì)稱(chēng)拆分反應(yīng)為靶向反應(yīng)，對(duì)作者所在實(shí)驗(yàn)室保存的23株野生菌進(jìn)行酶活篩選，以期得到高對(duì)映選擇性和催化活性的D-海因酶生產(chǎn)菌。最終成功篩選到6株可水解5′-單取代海因底物的野生菌株，其中熒光假單胞菌表現(xiàn)出最高的催化活性和對(duì)映選擇性，并對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)酶及催化反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 作者所在實(shí)驗(yàn)室保存的23株野生菌。

1.1.2 培養(yǎng)基及溶液

1）Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH 7.2，固體培養(yǎng)基加入2 g/dL瓊脂。

2）營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉粉3 g/L，氯化鈉5 g/L，pH 7.2，固體培養(yǎng)基加入2 g/dL瓊脂。

3）底物誘導(dǎo)溶液：異丁基海因母液（100 mmol/L異丁基海因，溶于pH 8.5、100 mmol/L磷酸鹽緩沖液）；對(duì)羥基海因母液（100 mmol/L對(duì)羥基苯海因的乙醇懸濁液）。

4）底物轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系I：20 mmol/L異丁基海因，溶于pH 8.5、100 mmol/L磷酸鹽緩沖液。

5）底物轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系II：10 mmol/L對(duì)羥基苯海因，溶于pH 8.5、100 mmol/L磷酸鹽緩沖液。

1.1.3 主要儀器 日立Chromaster高效液相色譜儀；Waters sunfireTMC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；安捷倫1200高效液相色譜儀；Waters Xbridge C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；大賽璐CHARALCEL○ROD-H色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；Thermo-TSQ QUANTUM ULTRA質(zhì)譜儀；Thermo SCIENTIFIC Hypersil GOLD column（250mm×4.6 mm，5 μm）；AVANCE III 400 MHz全數(shù)字化核磁共振譜儀。

1.1.4 5’-單取代海因底物 對(duì)羥基苯海因（≥98%）：上海嵐克醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；異丁基海因，異丙基海因，苯甲基海因，吲哚甲基海因，鄰氯苯海因：均為作者所在實(shí)驗(yàn)室合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氨基酸關(guān)環(huán)法合成5’-單取代海因[10-11]按摩爾比1.5～1.75∶1稱(chēng)取NaCNO及氨基酸（D/L-Val，D/L-Ile，D/L-Phe，D/L-Trp，D/L-鄰氯苯甘氨酸，LVal，L-Trp）至250 mL圓底燒瓶，按每克氨基酸添加15～20 mL去離子水溶解以上化合物，于80℃油浴中攪拌反應(yīng)2 h。待冷卻至60℃后，加入濃鹽酸調(diào)pH至2～3，此時(shí)溶液由澄清立即變?yōu)閼覞嵋?。等懸濁液冷卻至室溫，抽濾，并用去離子水洗滌，將固體在50℃恒溫箱中烘干，此時(shí)獲得的物質(zhì)為N-氨甲酰氨基酸。同時(shí)將濾液和洗滌液的N-氨甲酰氨基酸收集，于60℃減壓蒸餾將液體蒸發(fā)至有固體析出，冷卻、抽濾、洗滌、烘干。

取N-氨甲酰氨基酸加入到250 mL燒瓶中，按每克N-氨甲酰氨基酸加入15～20 mL蒸餾水，每摩爾反應(yīng)物加入2 mol濃硫酸，于105℃油浴條件下攪拌反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后于4℃冷卻結(jié)晶，將固體抽濾并用去離子水洗滌。為進(jìn)一步獲得純度較高的5′-單取代海因，將所得固體再加入適量去離子水加熱溶解后抽濾，濾液于4℃結(jié)晶，再經(jīng)抽濾、烘干即為5′-單取代海因。因?yàn)V液中仍有少量產(chǎn)物，將每次抽濾后的液體旋轉(zhuǎn)減壓蒸餾再次結(jié)晶。

取10 mg左右的合成產(chǎn)物加入到干凈的離心管中，加入1mL氘帶二甲基亞砜振蕩溶解，取適量轉(zhuǎn)移至核磁管中。用AVANCE III 400MHz全數(shù)字化核磁共振譜儀分析鑒定。

1.2.2 5’-單取代海因、N-氨甲酰氨基酸及D-氨基酸的分析方法

1）D-海因酶活性檢測(cè)：取100 μL反應(yīng)液加入等體積顯色劑（10%對(duì)二甲氨基苯甲醛（PDAB），溶于6 mol/L鹽酸）進(jìn)行顏色反應(yīng)，出現(xiàn)黃色的菌株為陽(yáng)性菌株。

2）反相HPLC：采用配有Waters SunfireTMC18色譜柱的Chromaster高效液相色譜儀分析海因及N-氨甲酰氨基酸，流動(dòng)相中甲醇比例如表1所示。流速為1 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，保留時(shí)間見(jiàn)表2。

3）正相手性HPLC：采用OD-H色譜柱分析外消旋的N-氨甲酰氨基酸，流動(dòng)相為異丙醇∶正己烷∶三氟乙酸=15∶85∶0.1，流速0.8 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)UV210 nm。

4）氨基酸檢測(cè)：準(zhǔn)確稱(chēng)取50 mg鄰苯二甲醛（OPA），溶解于4.5 mL甲醇中，加入50 μL β-巰基乙醇，500 μL 0.1 mmol/L四硼酸鈉，混勻后即得OPA衍生化試劑，于-4℃保存?zhèn)溆?。? μL樣品、5 μL 0.1 mmol/L四硼酸鈉，3 μL OPA衍生化試劑的比例進(jìn)行柱前衍生化，采用Xbridge C18色譜柱進(jìn)行分析，柱溫為30℃，流速1 mL/min，檢測(cè)器波長(zhǎng)為UV338 nm。

5）LC-MS：采用 Hypersil GOLD column（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為20%~35%甲醇梯度洗脫10 min，流速0.2 mL/min，進(jìn)入Thermo-TSQ QUANTUM ULTRA質(zhì)譜儀，在負(fù)離子模式檢測(cè)。

1.2.3 酶活測(cè)定 取5 mL菌液離心獲得菌體，向菌體中加入1 mL底物轉(zhuǎn)化溶液，在90 r/min、37℃下反應(yīng)10 min后加入1 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)，12 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后，用反相HPLC法檢測(cè)。酶活力定義：1 min內(nèi)催化底物生成1 μmol N-氨甲酰氨基酸所需的菌體量為一個(gè)活力單位（U）。

1.2.4 立體選擇性分析 取等體積10%三氯乙酸溶液加入到菌體轉(zhuǎn)化液中，靜置30 min，12 000 r/min離心10 min除去細(xì)胞，取出上清液加入到50 mL圓底燒瓶中，低壓狀態(tài)下經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)裝置去除液體，固體于50℃干燥除去殘留水分，加入異丙醇溶解，于12 000 r/min離心10 min，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后，取10 μL樣品采用正相手性HPLC法進(jìn)行立體選擇性分析。

1.2.5 N-氨甲酰氨基酸酰胺水解酶活性驗(yàn)證 以分析反應(yīng)體系中是否有D-氨基酸的生成為指標(biāo)，檢測(cè)菌株是否含有N-氨甲酰氨基酸酰胺水解酶的活性。從反應(yīng)體系中取樣，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后，按上述氨基酸檢測(cè)方法分析是否有氨基酸生成。

2 結(jié)果與分析

2.1 5’-單取代海因的合成

氨基酸關(guān)環(huán)法合成5′-單取代海因共分兩步，首先α-氨基酸與氰酸鈉于80℃反應(yīng)生成N-氨甲酰氨基酸，第二步N-氨甲酰氨基酸在酸性條件下于105℃分子內(nèi)失去一分子水縮合生成5′-單取代海因。另外在合成過(guò)程中，具有還原性的氨基酸很容易被氧化，曾嘗試通過(guò)對(duì)羥基苯甘氨酸合成相應(yīng)的海因物質(zhì)，最終檢測(cè)發(fā)現(xiàn)合成的物質(zhì)不是目標(biāo)物質(zhì)，經(jīng)分析鑒定發(fā)現(xiàn)與苯環(huán)相連的羥基被氧化。所有產(chǎn)物經(jīng)1H-NMR驗(yàn)證，與目標(biāo)物質(zhì)相符。

反應(yīng)過(guò)程中，為提高氨基酸的轉(zhuǎn)化率，將氨基酸與氰酸鈉的摩爾比控制為1∶1.5～1.7。反應(yīng)2 h，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到97%以上。由于中間物N-氨甲酰氨基酸在酸性環(huán)境下的溶解度很低，加入濃鹽酸調(diào)pH至2～3后即產(chǎn)生白色沉淀N-氨甲酰氨基酸。而此時(shí)氰酸鉀的溶解度很高，通過(guò)簡(jiǎn)單的抽濾分離可獲得純度較高的N-氨甲酰氨基酸。最終N-氨甲酰氨基酸純度大于98%，摩爾回收率可達(dá)97%。

提純后的N-氨甲酰氨基酸在高溫條件下經(jīng)硫酸的催化作用，分子內(nèi)縮合失去一分子水得到最終產(chǎn)物5′-單取代海因。為提高產(chǎn)物收率和后期分離效率，將反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)到3 h，中間物的轉(zhuǎn)化率大大提高，最終產(chǎn)物的摩爾收率均為94%以上。海因衍生物在高溫下溶解度較高，而溫度降低時(shí)物質(zhì)在中性環(huán)境下的溶解度下降顯著。在分離純化過(guò)程中，采用了固體加熱溶解再結(jié)晶的方法。反應(yīng)結(jié)束后液體冷卻，將固體經(jīng)抽濾分離后，加入一定量的去離子水，經(jīng)加熱溶解過(guò)濾后濾液在4℃重結(jié)晶即得純品。經(jīng)純化后產(chǎn)物的純度能夠達(dá)到98%以上。不同5′-單取代海因的合成效率見(jiàn)表1。

表1 不同5’-單取代海因的合成效率Table 1 Synthetic yield of various 5’-monosubstituted hydantoins

2.2 底物及中間物質(zhì)的液相色譜檢測(cè)條件

由于5'-單取代海及相應(yīng)的N-氨甲酰氨基酸均為水溶性且具有紫外吸收，因此采用反相HPLC進(jìn)行分析。選用Waters SunfireTMC18色譜柱，流動(dòng)相組成見(jiàn)表2。以確保海因衍生物與其對(duì)應(yīng)的N-氨甲酰氨基酸的分離度R＞1.5，各物質(zhì)的保留時(shí)間見(jiàn)表2。

表2 5’-單取代海因及其水解產(chǎn)物N-氨甲酰氨基酸的色譜分析條件Table 2 HPLC analysis of 5’-monosubstituted-hydantoins and corresponding N-carbomyl-amino acids

2.3 D-海因酶活性菌株的篩選

常用的海因酶產(chǎn)生菌篩選方法有3種[12-13]：一是利用海因衍生物為惟一氮源或碳源法，二是雙層平板法，三是微孔板篩選法。但是此3種方法均具有一定的局限性，第一種策略由于營(yíng)養(yǎng)苛刻，因而易漏篩，第二、三種方法易受菌株本身產(chǎn)生的顏色和副產(chǎn)物影響。作者選擇了搖瓶培養(yǎng)法，即：培養(yǎng)基中加入適量的酵母膏和胰蛋白胨等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為菌體的生長(zhǎng)提供保障；同時(shí)在培養(yǎng)過(guò)程中加入底物對(duì)其誘導(dǎo)產(chǎn)酶，培養(yǎng)結(jié)束后將離心洗滌后的菌體用于底物轉(zhuǎn)化。由于產(chǎn)物N-氨甲酰氨基酸可以與顯色劑4-二甲氨基苯甲醛（Ehrlich’s reagent）在酸性條件下反應(yīng)生成黃色物質(zhì)，可用于檢測(cè)陽(yáng)性菌株，反應(yīng)原理見(jiàn)圖2。

在選擇誘導(dǎo)劑時(shí)，考慮到不同菌株來(lái)源的海因酶底物譜范圍和最適底物不同，因而選擇了烴鏈衍生族的異丁基海因和芳香族的對(duì)羥基苯海因分別作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)海因酶。經(jīng)過(guò)活性檢測(cè)得到6株陽(yáng)性菌株分別為：熒光假單胞菌CGMCC1.1802，洋蔥伯克霍爾德CGMCC1.1813，惡臭假單胞菌901，惡臭假單胞菌KT2440，銅綠假單胞菌1-3，土壤農(nóng)桿菌F1。

圖2 D-海因酶活性篩選的顏色反應(yīng)原理Fig.2 Mechanism of chromogenic reaction in screening of D-hydantoinase activity

為了考察6株活性菌株是否具有進(jìn)一步將N-氨甲酰氨基酸水解為氨基酸的N-氨甲酰水解酶活性，利用液相柱前鄰苯二甲醛（OPA）衍生法測(cè)定是否有氨基酸生成。樣品經(jīng)HPLC分析后得到的色譜圖與標(biāo)樣比較，所有樣品在相應(yīng)的保留時(shí)間處沒(méi)有產(chǎn)生特征峰，即所篩選的菌株中不含有N-氨甲酰氨基酸酰胺水解酶。

利用LC-MS對(duì)陽(yáng)性菌株的催化產(chǎn)物進(jìn)行分析，以驗(yàn)證其催化海因水解后產(chǎn)物為N-氨甲酰氨基酸。首先，用菌體催化異丁基海因，轉(zhuǎn)化液經(jīng)離心過(guò)濾后，進(jìn)入超高效液相分離后經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)，在負(fù)離子狀態(tài)下測(cè)定分子及其碎片大小，因?yàn)闊o(wú)機(jī)鹽對(duì)質(zhì)譜儀的損害較大，所以從第2分鐘開(kāi)始檢測(cè)。6株菌的測(cè)定結(jié)果顯示，產(chǎn)物均為相應(yīng)的N-氨甲酰氨基酸。圖3為熒光假單胞菌CGMCC1.1802轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的LC-MS圖譜。異丁基海因經(jīng)D-海因酶轉(zhuǎn)化為N-氨甲?；?異亮氨酸，相對(duì)分子質(zhì)量由156變?yōu)?74.1?？梢钥吹较鄬?duì)分子質(zhì)量175.10為帶一個(gè)H＋的N-氨甲酰基-異亮氨酸，而196.87的峰為產(chǎn)物帶一個(gè)Na＋，均可以證明產(chǎn)物為N-氨甲酰異亮氨酸。

圖3 熒光假單胞菌轉(zhuǎn)化液的LC-MS圖Fig.3 LC-MS result of Pseudomonas fluorescens CGMCC1.1802 catalyzed reaction

對(duì)篩選到的海因酶陽(yáng)性菌株進(jìn)一步誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別測(cè)定利用所得菌體對(duì)烴基海因 （20 mmol/L異丁基海因）和芳香族海因（10 mmol/L對(duì)羥基海因）的初速度及選擇性，見(jiàn)表3。結(jié)果顯示：惡臭假單胞菌KT2440對(duì)對(duì)羥基苯海因和異丁基海因的酶活分別為8.43 U/L和53.9 U/L，且催化產(chǎn)生D-型產(chǎn)物，產(chǎn)物的ee值分別為98.2%和97.9%；土壤農(nóng)桿菌F1對(duì)異丁基海因的酶活力為23.5 U/L，對(duì)羥基苯海因的酶活力僅為8.00 U/L，產(chǎn)物的立體選擇性均低于96%；而熒光假單胞菌CGMCC1.1802對(duì)異丁基海因和對(duì)羥基苯海因的酶活分別為23.4 U/L和20.4 U/ L，立體選擇性均大于98%，對(duì)兩種類(lèi)型底物均表現(xiàn)出很好的催化性能，尤其是對(duì)于芳香族海因類(lèi)底物。因此，對(duì)熒光假單胞菌產(chǎn)D-海因酶的條件及反應(yīng)體系進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化。

2.4 熒光假單胞菌產(chǎn)D-海因酶發(fā)酵條件優(yōu)化

為獲得更高的酶產(chǎn)量以滿(mǎn)足催化反應(yīng)的需要，對(duì)熒光假單胞菌的誘導(dǎo)產(chǎn)酶條件進(jìn)行了研究。首先考察了誘導(dǎo)時(shí)間的影響，將種子液以2%的接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接于新鮮的LB培養(yǎng)基中，加入終濃度為2 mmol/L異丁基海因，于30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)，間隔一定時(shí)間取樣測(cè)定酶活力及OD600。發(fā)現(xiàn)在12 h時(shí)酶活達(dá)到最大值，約為92.1 U/L。由圖4可知，在培養(yǎng)前期，酶產(chǎn)量與菌濃平行增長(zhǎng)；當(dāng)菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后，OD600不再繼續(xù)增加，而酶活力下降嚴(yán)重。此海因酶為胞內(nèi)組成型表達(dá)酶，隨菌體的增多而增加，當(dāng)菌體進(jìn)入穩(wěn)定期后，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)消耗殆盡，細(xì)胞老化，胞內(nèi)的氧化性自由基增多，使海因酶氧化失活。

表3 陽(yáng)性菌株對(duì)海因底物的催化活力及立體選擇性Table 3 Enzymatic activity and enantioselectivity of hydantoin resolution catalyzed by selected strains

圖4 熒光假單胞菌菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶曲線(xiàn)Fig.4 Time course of cell growth and D-hydantoinase production of P.fluorescens

對(duì)菌株誘導(dǎo)產(chǎn)酶的溫度進(jìn)行了考察，同樣按2%的接種體積分?jǐn)?shù)將種子液轉(zhuǎn)接于新鮮的LB培養(yǎng)基中，分別于25、30、35、37℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h后測(cè)定菌體酶活。在30℃下培養(yǎng)的菌體具有最高的酶活，對(duì)異丁基海因底物的活力為92.1 U/L，見(jiàn)圖5。該溫度與菌體生長(zhǎng)的最適溫度一致，在最適生長(zhǎng)溫度下有利于細(xì)胞增殖和蛋白質(zhì)的正常合成，因此在此溫度下表現(xiàn)出最高酶活力。

基于以上對(duì)熒光假單胞菌產(chǎn)酶和催化條件的優(yōu)化，將該菌株于30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h（OD600約為7.5），測(cè)得其對(duì)20 mmol/L的不同海因底物（包括：異丁基海因、異丙基海因和對(duì)羥基苯海因）的單位發(fā)酵液酶活力分別為92.1、82.4、85.3 U/L。

圖5 溫度對(duì)熒光假單胞菌產(chǎn)D-海因酶的影響Fig.5 Influence of induction temperature on D-hydantoinase production of P.fluorescens

2.5 熒光假單胞菌D-海因酶的性質(zhì)研究

利用上述發(fā)酵制備的D-海因酶產(chǎn)生菌體，對(duì)羥基苯海因作為模型底物，對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究?？疾炝怂鼈?cè)诓煌琾H下海因酶酶活力高低的變化。數(shù)據(jù)顯示，酶活隨pH的升高先增加后降低，最適pH偏堿性，為8.5左右（圖6a）。同時(shí)研究了在不同溫度下保溫30 min后酶活的變化，結(jié)果顯示該酶催化反應(yīng)的最適溫度為60℃（圖6b）。海因衍生物在堿性和高溫條件下，溶解度升高，外消旋速率加快，有利于加速反應(yīng)進(jìn)程，達(dá)到更高的轉(zhuǎn)化率和收率[14]。然而當(dāng)溫度超過(guò)50℃時(shí)，底物易分解變質(zhì)。因此在接下來(lái)的選擇性水解海因制備D-氨甲酰氨基酸的反應(yīng)中采用pH 8.5和50℃的最適催化條件。

為了更好探究該D-海因酶產(chǎn)生菌的催化潛力以有助于指導(dǎo)在D-氨甲酰氨基酸合成中的應(yīng)用，對(duì)其底物特異性進(jìn)行了進(jìn)一步考察。分別測(cè)定了熒光假單胞菌菌體對(duì)不同5′-單取代海因底物（10 mmol/L，溶于磷酸鈉緩沖液（pH 8.5，100 mmol/L））水解反應(yīng)的初速度，結(jié)果見(jiàn)表4?？梢钥闯觯撕Ｒ蛎笇?duì)異丙基海因、異丁基海因和對(duì)羥基苯海因具有很高的催化活力，而對(duì)疏水性較強(qiáng)和側(cè)鏈較大的芐基海因、鄰氯苯海因和吲哚甲基海因催化活性較低，相對(duì)酶活＜10%，由于這些底物的側(cè)鏈具有較大的苯基、芐基等，空間位阻較大，不利于底物進(jìn)入活性口袋。對(duì)映選擇性分析發(fā)現(xiàn)，與側(cè)鏈較小的異丙基海因相比，該酶對(duì)側(cè)鏈較大的對(duì)羥基苯海因和異丁基海因具有更好的立體選擇性，原因可能是D-海因酶的催化口袋與異丙基海因的側(cè)鏈不完全匹配[15]。

圖6 不同pH和溫度對(duì)熒光假單胞菌海因酶酶活的影響Fig.6 Effect of pH and temperature on enzymatic activity of D-hydantoinase produced by Pseudomonas fluorescens

100 mL菌液離心可得約0.25 g細(xì)胞（干重），以其為催化劑考察在海因衍生物水解反應(yīng)中的效果。分別加入50 mL、100 mmol/L異丁基海因和50 mL、20 mmol/L對(duì)羥基苯海因，于50°C轉(zhuǎn)化，定時(shí)取樣，向樣品中加入等體積的10%三氯乙酸以終止反應(yīng)，利用反相HPLC測(cè)定產(chǎn)物含量并計(jì)算轉(zhuǎn)化率。菌體在催化異丁基海因時(shí)，反應(yīng)4 h后轉(zhuǎn)化率為36%，6 h后轉(zhuǎn)化率達(dá)到49.3%，并保持不變。這是由于異丁基海因在溶液中自身的消旋能力非常弱，外消旋異丁基海因底物不能被完全轉(zhuǎn)化，只有D-異丁基海因被水解，因此最大轉(zhuǎn)化率僅為50%。在催化對(duì)羥基苯海因時(shí)，由于其溶解度較低，所以選擇了20 mmol/L底物濃度，反應(yīng)1 h轉(zhuǎn)化率達(dá)到40%，3 h時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)到98%。這是由于對(duì)羥基苯海因可以通過(guò)烯醇互變異構(gòu)體由L-構(gòu)型轉(zhuǎn)變?yōu)镈-構(gòu)型[14]，從而實(shí)現(xiàn)自發(fā)消旋，因此外消旋對(duì)羥基苯海因的最大轉(zhuǎn)化率可達(dá)到100%。

表4 D-海因酶對(duì)不同5′-單取代海因底物的催化活性Table 4 Substrate specificity of D-hydantoinase from Pseudomonas fluorescens

3 結(jié)語(yǔ)

D-海因酶是生產(chǎn)D-氨基酸的重要酶制劑，已被應(yīng)用于生產(chǎn)D-對(duì)羥基苯甘氨酸和D-苯甘氨酸。從作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏的微生物出發(fā)，篩選到6株具有D-海因酶活性的菌株。其中，熒光假單胞菌來(lái)源的D-海因酶具有較寬的底物譜，該D-海因酶對(duì)短側(cè)鏈的異丁基海因和異丙基海因以及芳香基團(tuán)的對(duì)羥基苯海因的催化活力較高，單位發(fā)酵液酶活分別為92.1、82.4、85.3 U/L，對(duì)映選擇性（ee）分別為98.7%，97.5%和98.8%。該菌株催化反應(yīng)的最適pH為8.5，最適溫度為60℃。在該反應(yīng)條件有利于提高底物的溶解度和外消旋速率，進(jìn)而增加酶的催化速率和產(chǎn)物收率。與同類(lèi)文獻(xiàn)報(bào)道相比[16]，本研究的D-海因產(chǎn)生菌熒光假單胞菌具有優(yōu)越的催化性能，對(duì)其中的D-海因酶進(jìn)行異源高表達(dá)后在不對(duì)稱(chēng)水解海因制備D-氨基酸方面將會(huì)具有更大的潛力。

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Screening of D-Hydantoinase-Producing Microorganism and Its Catalytic Properties

LI Lei1，2， XU Guochao1，2， HAN Ruizhi1，2， NI Ye*1，2
（1.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Hydantoinases are important enzymes with industrial potential in producing D-amino acids.In this study，6 strains with hydantoinase activity were selected from 23 wildtype microbial strains using 5'-monosubstituted hydantoin derivatives as induce substrates.Four 5'-monosubstituted hydantoins were chemically synthesized and verified with 1H-NMR.From 6 hydantoinase-producing strains，strain Pseudomonas fluorescenswas successfully identified with the highest enantioselectivity，desired substrate specificity and high activity in the hydrolysis of 5'-monosubstituted hydantoins andwas selected for further study.After induction with hydantoin substrates at 30℃for 12 h，the D-hydantoinase activity could reach 92.1 U/L.The reaction condition was optimized to be 60℃and pH 8.5，which was in favor of the spontaneous racemization of substrate.In a 50 mL whole-cell biocatalytic system，20 mmol/L D，L-p-hydroxyphenyl hydantoin was enantioselectively hydrolyzed by 0.25 g dry cells with a conversion ratioof 98%within 3 hours.

D-hydantoinase，D-amino acid，Pseudomonas fluorescens，5'-monosubstituted hydantoin

Q 93

A

1673—1689（2016）12—1292—08

2014-11-22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21276112）；國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目（2011CB710800）；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才計(jì)劃項(xiàng)目（NCET-11-0658）。

*通信作者：倪 曄（1975—），女，江蘇無(wú)錫人，理學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事生物催化和酶工程方面的研究。E-mail：yni@jiangnan.edu.cn