馮俊杰 戴陽麗 王秀敏

·綜述·

MIN6細胞系的細胞學特性及其應用

馮俊杰 戴陽麗 王秀敏

MIN6細胞系是從表達類人猿病毒40大T抗原(受胰島毒啟動子控制)的轉基因非肥胖糖尿病小鼠胰島瘤中建立的，其內分泌功能與胰腺組織非常接近，是研究胰島細胞功能的理想模型。MIN6細胞系可用于胰腺分泌的研究，β細胞的適宜刺激信號的探索；1型糖尿病發(fā)病機制的研究；氧化應激、自噬、游離脂肪酸對2型糖尿病發(fā)病的影響；在胰腺移植后發(fā)生排斥的機制研究。

MIN6；糖尿??；細胞學特性；自噬

由于人原代胰島細胞獲取困難，且不能連續(xù)傳代，所以多選用體外培養(yǎng)胰島β細胞的細胞株作為替代，常用的有大鼠胰島β細胞瘤細胞株(RINm5F)及倉鼠胰島β細胞(HIT-T15)。其在胰島素基因的研究中廣泛應用，缺點是胰島素分泌遠低于正常胰島細胞，且葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)也與β細胞有所不同，故不能完全替代正常β細胞。小鼠胰島素瘤細胞(MIN6細胞系)是從小鼠胰島β細胞瘤或胰島細胞瘤中分離得到的永久細胞系，它保留了胰島細胞的GSIS，對腦型葡萄糖轉運蛋白(GLUT)不敏感，而特異地對肝型GLUT敏感，可以反映胰島β細胞的功能變化，是研究胰島細胞功能的理想模型。以下就MIN6細胞系的細胞學特性及其在研究中的作用作一綜述。

1 MIN細胞系的制備和功能

MIN6細胞系是從胰島素啟動子控制下的表達類人猿病毒40大T抗原的轉基因非肥胖糖尿病小鼠胰島瘤中建立的[1]。將這些小鼠喂養(yǎng)至13周處死，切除腫瘤后獲得腫瘤細胞，經過單獨洗滌，加入DMEM培養(yǎng)基后在培養(yǎng)箱內傳代培養(yǎng)。2周后，得到緊密排列、密集生長的細胞克隆，用胰蛋白酶常規(guī)消化后進行細胞傳代。最終得到兩個細胞系：從IT6模型小鼠的腫瘤細胞中得到單一細胞克隆即是MIN6細胞系，而從IT7模型中獲得的是MIN7細胞系。MIN6細胞系經孵育12 h后，取上清液，離心去除細胞碎片，儲存于-20℃。MIN6細胞系的GSIS與胰島細胞基本相似，是一種被廣泛使用的β細胞系。Nakashima等[2]發(fā)現(xiàn)，MIN6細胞還可分泌胰高血糖素、生長抑素和ghrelin，提示其是體外代替胰島組織培養(yǎng)的較好的細胞系。

2 MIN6細胞系的細胞學特性

MIN6和MIN7細胞系都是由類人猿病毒40大T抗原啟動子所激發(fā)而得到的，兩者都呈均勻形態(tài)、集落生長，有一定的神經內分泌功能，包含較高水平的胰島素mRNA和類人猿病毒40T抗原mRNA。免疫組化分析也提示它們是由同一種胰島β細胞分化演變而來。但兩者的GSIS不同，MIN6細胞系分泌胰島素的量隨血糖升高而顯著升高，這與體外培養(yǎng)的正常胰島細胞基本相似。它們都能產生較高水平的肝型GLUT mRNA，MIN6細胞系只能產生少量的腦型GLUT mRNA。故MIN6細胞系在功能上更接近于胰島β細胞。

MIN6細胞系保留了β細胞特性，可以在血糖和其他促分泌因素刺激下分泌胰島素。但是MIN6細胞在多次傳代后會發(fā)生基因改變，從而失去分泌胰島素的能力，這些基因的改變包括下調某些基因如磷脂酶D1和膽囊收縮素。多次傳代的細胞對某些蛋白也會出現(xiàn)低表達，包括參與內質網應激和活性氧簇生成的抗氧化酶。GLUT是葡萄糖通過細胞膜的重要受體，其中GLUT9和GLUT2也參與了GSIS[3]。既往研究發(fā)現(xiàn)，傳代次數不多的MIN6細胞系GLUT2的表達幾乎沒有差異，與多次傳代的MIN6細胞系相比較，在基因和蛋白水平的表達均有改變，但是不影響代謝結果[4]。近年來Yamato等[5]發(fā)現(xiàn)，MIN6亞群C4更好的保留了GSIS能力，更適用于體外胰島β細胞系研究。

MIN6細胞系不僅可以分泌胰高血糖素樣肽-1，其信號可以通過一種自分泌方式被放大，從而維持其胰島素分泌的功能[6]。這是MIN6細胞系生存和分泌胰島素的基礎。

3 MIN6細胞系的臨床應用

3.1 測定胰腺分泌的激素 胰腺組織有5種內分泌細胞：分泌胰高血糖素的α細胞，分泌胰島素的β細胞，分泌生長抑素的δ細胞，分泌胰多肽的γ細胞，分泌ghrelin的ε細胞。它們共同維持血糖的穩(wěn)定。MIN6細胞系可分泌以上5種激素[2]。Nakashima等[2]發(fā)現(xiàn)MIN6細胞系可以表達Pdx1，NeuroD，Nkx6.1，Nkx2.2，Pax6，Ngn3，Pax4，Bran4和CckBr等基因，而這些基因同樣也在胰島中表達。

3.2 在氨基酸研究中的應用 某些氨基酸，如L-谷氨酸和L-精氨酸，是胰島β細胞的適宜刺激信號。研究發(fā)現(xiàn)，在接受L-谷氨酸和L-精氨酸刺激后，MIN6細胞內三磷酸肌醇和Ca2+濃度均顯著上升，這有助于了解Tas1R家族的表達情況[7]。所以，可以利用MIN6細胞系表達氨基酸受體作相關研究。

AMP活化蛋白激酶(AMPK)是反映細胞狀態(tài)的傳感器，其活化影響了胰島β細胞的GSIS。哺乳動物的AMPK是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其功能是滅活葡萄糖。MIN6細胞系中，蛋白激酶A使AMPKα1 Ser173、Ser485和Ser497位點磷酸化，通過上游激酶活化而阻礙了Thr172磷酸化[8]。蛋白激酶B則使AMPKαS485位點活化，并抑制肝激酶B1(LKB1)的Thr172磷酸化，從而減少AMPK的活化。但使用INS-1β細胞系在研究過程中得到不同結果，蛋白激酶B引起AMPKαSer485位點發(fā)生磷酸化，阻止了LKB1Thr172的磷酸化，由于AMPK-LKB1間的級聯(lián)反應而降低了AMPK的活性。出現(xiàn)這種矛盾的結果可能與使用不同的細胞系有關[9]。王威等[10]發(fā)現(xiàn)，MIN6細胞系對血糖的調節(jié)能力優(yōu)于INS-1細胞系。

3.3 在糖尿病發(fā)病機制研究中的應用

3.3.1 1型糖尿病 1型糖尿病是一種具有嚴重炎性反應的慢性自身免疫性疾病，由于胰島β細胞大量破壞引起胰島素分泌不足，導致機體糖代謝紊亂[11]。通過對MIN6細胞系的進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-146、miR-21、miR-34a在白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α等誘導的β細胞功能衰竭中有重要作用，而miR-34、miR-146a能保護MIN6細胞免受細胞因子誘發(fā)的死亡，提示微小RNA異?？赡芤鹱陨砻庖叻磻?，從而導致1型糖尿病[12]。曹朝暉等[13]的研究認為，caspase-3激活與MIN6細胞凋亡有關，炎性反應因子可能通過激活凋亡相關蛋白誘導細胞的凋亡，這其中可能涉及細胞凋亡的線粒體途徑和死亡受體途徑的信號轉導。以MIN6細胞系為例，對1型糖尿病的發(fā)生有一定的意義。

3.3.2 2型糖尿病 代謝綜合征是2型糖尿病的高危因素之一，Ding等[14]通過對MIN6細胞系的研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素可以通過核因子-κB-誘導型一氧化氮合酶-一氧化氮途徑調節(jié)轉錄因子MafA的表達，而該途徑是高尿酸作用于胰島β細胞的關鍵，由此降低高尿酸相關性代謝綜合征的發(fā)生幾率，進而降低高尿酸相關性糖尿病的風險。硫化殼寡糖可以對抗過氧化氫對MIN6細胞系的損害，其機制可能是增強了抗氧化酶的活性，并抑制胞內活性氧簇產生[15]。生理條件下，自噬主要受外源性營養(yǎng)物質的調節(jié)，當機體處于饑餓狀態(tài)時，自噬活性增加。同時，自噬也是機體消除錯誤折疊的大分子、衰老及失能的細胞器的一種途徑。自噬與2型糖尿病有潛在的關系，作為機體防御機制可清除失能細胞器導致的氧化應激和內質網應激[16]。胰島素能抑制自噬，通過激活mTOR依賴性信號通路，與靶細胞表面胰島素受體結合誘導自身磷酸化，最終使ULK1-Atg13-FIP200復合體失去活性，從而抑制自噬[17-18]。而2型糖尿病患者由于胰島素抵抗，相關作用減弱，最終導致細胞自噬增強。杜世春等[19]發(fā)現(xiàn)，晚期糖基化終末產物可以抑制MIN6細胞活力，并使細胞內活性氧簇的生成增加，誘導MIN6細胞氧化應激，從而影響胰島素分泌。

RIP140是代謝性核受體輔助因子家族中的一員，主要作為抑制因子調控肝臟、肌肉及脂肪中的糖、脂代謝。2型糖尿病患者外周血單核細胞中RIP140的表達較正常明顯升高。敲除小鼠RIP140基因能改善高脂飲食條件下的胰島素抵抗、增加胰島素刺激時的糖攝取，同時還可以抑制年齡和飲食誘導的糖耐量異常的發(fā)生。下調RIP140表達能夠通過上調能量消耗相關基因來改善細胞內氧化應激水平。薛君力等[20]通過利用H2O2建立了MIN6細胞的氧化應激損傷模型，并利用RNA干擾下調MIN6細胞中的RIP140表達，觀察到以RIP140為靶點可以調控β細胞損傷。

3.3.2.1 β細胞胰島素分泌 β細胞分泌胰島素是一個雙相的過程。第一時相發(fā)生較快，在血糖變化后10 min之內，分泌高峰在1～2 min。第二時相出現(xiàn)較晚，但持續(xù)時間較長，峰值在25～30 min。2型糖尿病患者最初第一時相受損，但保留了第二時相的功能。故是否存在第一時相的損害是預測1型和2型糖尿病風險的因素之一。通過對MIN6細胞的觀察，多次傳代的MIN6細胞形態(tài)不均勻，失去了第一時相功能，GSIS完全受損，胞內ATP明顯減少，葡萄糖吸收、氧化和脂質氧化也減少，糖酵解基因和脂質處理基因包括Srebp1c表達降低，導致Sirt3和Nampt基因表達降低，乳酸含量減少，一些脂類合成基因也出現(xiàn)了低表達，包括重要的轉錄因子Srebp1c。這也使得GLUT1明顯下降，GLUT2也有下降的趨勢。已知ATP/ADP比值上調是β細胞釋放胰島素所必須的，其可能會通過提高吸收葡萄糖并氧化來提高ATP[4]。

3.3.2.2 游離脂肪酸(FFA)的毒性作用 FFA對β細胞有細胞毒性作用。高水平FFA可以導致內質網的鈣離子耗盡，而β細胞需要鈣離子的儲備。故β細胞對內質網應激非常敏感，鈣離子缺乏會誘導其凋亡。棕櫚酸誘導的MIN6細胞凋亡與尿酸相關性代謝綜合征內質網應激有關。脂肪酸可以激活G蛋白耦聯(lián)受體40(GPR40)，提高胞內游離鈣離子，并可以促進GSIS。持續(xù)高水平的FFA使β細胞受到破壞，并可能通過GPR40導致胞內鈣離子功能紊亂。GPR40基因敲除小鼠在高脂飲食條件下對肝脂肪變性、高甘油三酯血癥和其他一些糖尿病相關性疾病有抵抗，GPR40過度表達可以導致小鼠出現(xiàn)糖尿病表型。實驗證明飽和脂肪酸如棕櫚酸可導致β細胞凋亡，而GPR40拮抗劑DC260126在48 h內可以呈劑量依賴方式保護MIN6細胞避免被誘導凋亡。提示GPR40參與了棕櫚酸誘導的MIN6細胞凋亡[21]。人類白血病相關基因16可以調節(jié)MIN6細胞系的胰島素分泌和GSIS，其過表達還可以加強MIN6細胞系對脂毒性的抗凋亡作用，而ghrelin則可以通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B途徑對MIN6細胞系起到相同的作用[22-23]。

3.4 胰腺移植后排斥 雷帕霉素(西羅莫司)是一種胰腺移植術后常用的免疫抑制劑，但是長期使用這種藥物的患者胰島細胞功能和活力會受損。對胰腺移植失敗的患者進行尸檢，沒有發(fā)現(xiàn)移植的胰腺發(fā)生了自身免疫或同種免疫性損害，提示移植失敗是由非免疫性因素所導致的，如藥物毒性。對MIN6細胞的實驗結果表明，雷帕霉素的藥理作用是通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)完成的，mTOR存在兩個配體，mTORC1和mTORC2。mTORC1對雷帕霉素高度敏感，而mTORC2則不敏感。研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素對MIN6細胞系的功能及壽命均有有害影響。鏈唑霉素可以誘導β細胞出現(xiàn)細胞凋亡，蛋白激酶B通過介導胰島素的抗凋亡因子如胰島素樣生長因子-1和胰高血糖素樣肽-1，保護了β細胞。蛋白激酶Bα基因敲除的小鼠出現(xiàn)β細胞數量下降，而蛋白激酶Bβ基因敲除小鼠出現(xiàn)β細胞質量下降，兩者都可導致凋亡增加[24]。提示雷帕霉素引起的損害是由mTOR2抑制介導的。

綜上所述，MIN6細胞系是從小鼠胰腺腫瘤細胞得到的一個細胞系，其來源于胰島β細胞，與胰腺組織功能上較為相近，是研究胰腺功能的較好的一種細胞系，在糖尿病研究等領域有著較為廣泛的應用。

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CytologicalcharacteristicsandapplicationofMIN6cellline

FengJunjie,DaiYangli,WangXiumin.

DepartmentofEndocrinology,TheChildren′sHospitalofZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Hangzhou310003,CHina

Correspondingauthor:WangXiumin,Email:wangxiumin1019@126.com

MIN6 cell line is established from insulinomas obtained by targeted expression of the simian virus 40 T antigen in transgenic non-obese diabetic mice. The endocrine function of MIN6 cells is similar to pancreatic tissue, which makes it an ideal model in researching the function of islet cells . The MIN6 cell line is used in pancreatic secretion in recent years, and also in finding stimulus signal to β cells. MIN6 cell line is used to study the pathogenesis of type 1 diabetes as well as the effects of oxidative stress, autophagy and free fatty acids on the pathogenesis of type 2 diabetes. At the same time, it can be used to discuss the mechanism in reject reaction after pancreas transplantation.

MIN6；Diabetes mellitus；Cytological characteristics; Autophagy

國家自然科學基金資助項目(30971125，81370930)

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.02.014

310003 杭州，浙江大學附屬兒童醫(yī)院內分泌科(馮俊杰，戴陽麗，王秀敏)；314001 浙江省嘉興市第一醫(yī)院兒科(馮俊杰)；200127 上海兒童醫(yī)學中心(王秀敏)

王秀敏，Email：wangxiumin1019@126.com

FundProgramThe National Natural Science Foundation of China(30971125, 81370930)

2015-05-27)