杜　麗，王鳳陽(yáng)

(海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院/海南省熱帶動(dòng)物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/?？谑袆?dòng)物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?570228)

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專論與講座

水牛四種主要細(xì)菌性傳染病研究概況

杜麗，王鳳陽(yáng)*

(海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院/海南省熱帶動(dòng)物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/?？谑袆?dòng)物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?570228)

隨著國(guó)內(nèi)水牛養(yǎng)殖集約化程度的提高，對(duì)于水牛細(xì)菌性傳染病研究水平提升的需求日益迫切。乳房炎、布魯菌病、結(jié)核病和李氏桿菌病是水牛4種主要的細(xì)菌性傳染病，國(guó)內(nèi)相關(guān)研究報(bào)道較少。血清學(xué)調(diào)查可以為水牛細(xì)菌性傳染病的流行提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)；病原分型可以為水牛細(xì)菌性傳染病的診斷提供重要依據(jù)；診斷技術(shù)的準(zhǔn)確性和特異性研究可以提高水牛細(xì)菌性傳染病的診斷水平?；诖?，對(duì)國(guó)外關(guān)于乳房炎、布魯菌病、結(jié)核病和李氏桿菌病等水牛細(xì)菌病在血清學(xué)調(diào)查、病原分型、診斷技術(shù)等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，旨在為提高我國(guó)水牛細(xì)菌性傳染病的研究水平提供參考。

水牛；細(xì)菌性傳染?。辉\斷

作為聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)認(rèn)定的最具開(kāi)發(fā)潛力和開(kāi)發(fā)價(jià)值的家畜，水牛分為河流型水牛和沼澤型水牛，河流型水牛染色體核型為2n=50，沼澤型水牛染色體核型為2n=48。河流型水牛主要分布于印度、巴基斯坦、埃及和意大利等國(guó)。我國(guó)的水牛品種屬于沼澤型水牛[1]。近年來(lái)，水牛正由奶、肉、役3種用途的家畜向奶用家畜轉(zhuǎn)變。從水牛養(yǎng)殖的數(shù)量、規(guī)模及水牛奶的產(chǎn)量來(lái)看，印度和巴基斯坦分居世界第一和第二。在水牛奶的加工領(lǐng)域，意大利、英國(guó)等國(guó)家也開(kāi)展了卓有成效的工作。

我國(guó)現(xiàn)存欄水牛2 000多萬(wàn)頭， 但由于產(chǎn)業(yè)化程度低，技術(shù)支撐體系薄弱，在水牛奶的產(chǎn)量和高檔乳制品的研發(fā)方面，與印度、巴基斯坦及意大利等國(guó)還存在一定的差距。其中，對(duì)于水牛細(xì)菌性傳染病研究滯后影響奶水牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展這一問(wèn)題尤其需要引起重視。水牛的主要細(xì)菌性疫病包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)引起的乳房炎、布魯菌病、結(jié)核病和李氏桿菌病等。本文就水牛的幾種主要細(xì)菌性傳染病的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1　細(xì)菌性乳房炎

奶牛乳房炎癥狀為乳房實(shí)質(zhì)、間質(zhì)的炎癥。病因多由機(jī)械性刺激、金黃色葡萄球菌等病原微生物侵入及化學(xué)物理性損傷所致，包括臨床型和亞臨床型[2-3]。巴西的Marta Aires-de-Sousa M等從亞臨床型乳房炎的水牛分離到金黃色葡萄球菌(S.aureus)[4]。印度Sentitula Yadav B R等[5]應(yīng)用加利福尼亞乳腺炎試驗(yàn) (california mastitis test，CMT) 對(duì)82頭摩拉水牛進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，57頭為乳房炎陽(yáng)性，且分離到金黃色葡萄球菌。為了準(zhǔn)確診斷水牛亞臨床乳房炎，鑒定主要病原體，評(píng)價(jià)細(xì)菌的抗生素抗性，Preethirani P L 等[6]應(yīng)用體細(xì)胞計(jì)數(shù)、導(dǎo)電性、CMT、溴麝香草酚藍(lán)試驗(yàn)和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶試驗(yàn)對(duì)來(lái)自亞臨床乳房炎水牛的奶樣進(jìn)行了分析。與體細(xì)胞計(jì)數(shù)這一金標(biāo)準(zhǔn)相比，CMT 的檢測(cè)效果較好，如果將2種方法進(jìn)行結(jié)合，效果最好。生化分析和PCR分析結(jié)果表明，凝固酶陰性葡萄球菌(coagulase-negativeStaphylococcus，CNS)所占比例為64.8%,金黃色葡萄球菌所占比例為7.3%。大部分病原菌具有多種抗生素抗性，尤其是β內(nèi)酰胺類。

Oliveira A A 等[7]用加有5%去纖維蛋白羊血的哥倫比亞瓊脂對(duì)來(lái)自137頭水牛的奶樣進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，36頭(10.8%) 為葡萄球菌陽(yáng)性，其中83.3%為CNS，11.1%為凝固酶陽(yáng)性葡萄球菌(coagulase-positiveStaphylococcus，CPS)，5.6% 為CPS+CNS陽(yáng)性，1%的金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素和阿莫西林克拉維酸合劑敏感，對(duì)氨芐、青霉素、苯唑青霉素有抗性。應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法，El-Ashker M等對(duì)埃及代蓋赫利耶省臨床和亞臨床乳房炎的奶牛和水牛奶樣中的細(xì)菌進(jìn)行了初步鑒定。在對(duì)葡萄球菌進(jìn)行16 S rRNA 基因序列分析和微點(diǎn)陣的進(jìn)一步微點(diǎn)陣分析，結(jié)果5.6%的奶樣中發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌，其中24.5% (12/49) 為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantS.aureus,MRSA)[8]。

2　布魯菌病

2002年，印度Renukaradhya G J 等[9]利用研制的檢測(cè)血清和奶樣的ELISA 試劑盒，開(kāi)展了覆蓋幾個(gè)邦的布魯菌病流行病學(xué)調(diào)查?；讷@取的大樣本調(diào)查數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，3%的水牛為布魯菌病陽(yáng)性，造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。針對(duì)該狀況，Renukaradhya G J 等建議通過(guò)實(shí)施免疫接種幼犢的控制措施來(lái)彌補(bǔ)布魯菌病防控計(jì)劃的缺失，同時(shí)提出了旨在解決屠宰人員在發(fā)現(xiàn)布魯菌病陽(yáng)性后廉價(jià)拋售水牛禁令執(zhí)行過(guò)程中一些問(wèn)題的牛布魯菌病控制方案(bovine brucellosis progressive control programme，BBPCP)。巴基斯坦Ali S等設(shè)計(jì)了針對(duì)B.abortus、B.melitensis、B.ovis和B.suis的布魯菌種特異的引物，對(duì)來(lái)自血清學(xué)陽(yáng)性的水牛樣本，如流產(chǎn)胎兒、陰道拭子等，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，首次發(fā)現(xiàn)了水牛生物Ⅰ型B.abortus的流行[10]。Tittarelli M等[11]以平滑型脂多糖作為包被抗原，建立了間接 ELISA 方法，可以對(duì)來(lái)自水牛奶樣的布魯菌抗體進(jìn)行檢測(cè)，并且分離到了生物I 型B.abortus。

應(yīng)用常規(guī)的診斷技術(shù)不能檢測(cè)到RB51 疫苗株誘導(dǎo)的抗體，為了建立一種能夠區(qū)分感染動(dòng)物和免疫動(dòng)物的特異性診斷技術(shù)， Tittarelli M 等[12]將基于特異性RB51 抗原的補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)(complement fixation test，CFT)(RB51-CFT)與布魯菌素皮試相結(jié)合，應(yīng)用于水牛的RB51 疫苗免疫的檢測(cè)。應(yīng)用CFT檢測(cè)了來(lái)自意大利薩萊諾省全部為虎紅試驗(yàn)(rose bengal test，RBT) 陰性的127頭水牛的抗布魯菌的特異性抗體。在第1次檢測(cè)中，71頭水牛 (56%) 產(chǎn)生抗RB51 疫苗株的RB51 抗原特異性的CFT抗體;在RB51布魯菌素皮內(nèi)接種后11 d，進(jìn)行第2次血清樣本檢測(cè)，104頭水牛(82%) 為陽(yáng)性。 107頭水牛(84%)在至少1次樣本檢測(cè)中為RB51-CFT陽(yáng)性，111頭水牛(87%)為布魯菌素皮試陽(yáng)性。3次平行試驗(yàn)的分析結(jié)果表明，119頭水牛(94%) 在至少1次檢測(cè)中為陽(yáng)性。這些數(shù)據(jù)表明， RB51-CFT和RB51布魯菌素皮試的聯(lián)合使用，可能是一種檢測(cè)水牛RB51疫苗免疫的有效方法。

利用基于ELISA原理的IDEXX布魯菌病血清抗體試劑盒，Gorsich EE等對(duì)來(lái)自南非克魯格國(guó)家公園的 258頭水牛的571 份血清樣本進(jìn)行B.abortus的檢測(cè)， 并分析了其敏感性和特異性。首先，將RBT和CFT 2種測(cè)試均為陽(yáng)性或均為陰性的樣本定義為假定金標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用ROC分析，假定金標(biāo)準(zhǔn)，最大化敏感性和特異性的臨界值標(biāo)準(zhǔn)，確定了ELISA的臨界值， 利用貝葉斯推理與潛類分析估計(jì)了3種檢測(cè)方法的敏感性和特異性。結(jié)果表明，ELISA 的敏感性估計(jì)為0.928， 特異性估計(jì)為0.870;RBT的敏感性為0.986，RBT和CFT的特異性分別達(dá)到0.992和0.998，從而說(shuō)明，沒(méi)有單一的血清學(xué)測(cè)試方法能夠做到完美。在調(diào)整臨界值之后，IDEXX布魯菌病血清抗體檢測(cè)可能是克魯格國(guó)家公園非洲水牛布魯菌病檢測(cè)的另外一種有價(jià)值的方法[13]。

Martínez D 等[14]對(duì)來(lái)自水牛流產(chǎn)胎兒的布魯菌分離物進(jìn)行了基于表型和基因型的鑒定，表型鑒定包括二氧化碳需求，硫化氫試驗(yàn)， 硫堇與堿性品紅敏感性試驗(yàn)等，基因型鑒定包括擴(kuò)增bcsp31、OMP2ab和eri，以及進(jìn)行B.abortus、B.melitensis、B.ovis和B.suis種特異的IS711染色體定位，即AMOS-PCR。結(jié)果表明，分離物的表型與阿根廷牛最流行的生物Ⅰ型B.abortus和目前水牛的19疫苗株不同，基因型鑒定結(jié)果支持表型分析結(jié)果，OMP2ab 基因序列與生物5型B.abortus或B.melitensis相同，AMOS-PCR觀察到1條1 700 bp的條帶，與生物Ⅰ型B.abortus(498 bp) 和B.melitensis(731 bp)不同，從而證實(shí)了該分離物為生物5型B.abortus。 這也是從美洲水牛分離到生物5 型B.abortus的首次報(bào)道。

為了評(píng)估巴西帕拉州B.abortus引起的水牛布魯菌病的流行和可能的影響因子，da Silva J B等[15]對(duì)來(lái)自于3917份懷孕和非懷孕的母牛血清樣本進(jìn)行了檢測(cè)，其中2 809份來(lái)自于馬拉若島，1 108份來(lái)自于大陸。緩沖酸化平板抗原(BAPA)篩選試驗(yàn)結(jié)果表明，布魯菌病陽(yáng)性率為4.8% (188/3 917)， 2-巰基乙醇 (2-ME) 陽(yáng)性驗(yàn)證試驗(yàn)高達(dá)95.7% (180/188)。 大陸動(dòng)物的的布魯菌病流行為馬拉若島動(dòng)物流行率的4.17 倍。繁殖狀態(tài)顯著影響布魯菌病的血清學(xué)流行(P<0.05)，懷孕母牛更為易感。這些數(shù)據(jù)表明，在擁有最大水牛群體的巴西，布魯菌病感染非常普遍，并且該病對(duì)公共衛(wèi)生和水牛生產(chǎn)造成了嚴(yán)重威脅。

3　結(jié)核病

在亞洲，尼泊爾Jha V C 等[16]從單頸結(jié)核菌素皮內(nèi)注射試驗(yàn) (single intradermal cervical tuberculin，SICT) 陽(yáng)性水牛的奶樣和糞樣中分離到牛分支桿菌(Mycobacteriumbovis)；在1999 年到 2006年間，Le Roex N 等[17]應(yīng)用SCIT對(duì)南非的4 733 頭水牛進(jìn)行了結(jié)核病檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性率從2.3% 到 54.7%不等。2008年-2013年，Caron A 等[18]應(yīng)用衛(wèi)星全球定位系統(tǒng)(GPS)和無(wú)線電項(xiàng)圈等手段，對(duì)非洲跨界保護(hù)區(qū)接近成年的母水牛長(zhǎng)距離的遷徙進(jìn)行了跟蹤監(jiān)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)核病可以在不同的水牛群體間傳播。

Khattak I 等[19]應(yīng)用比較頸皮內(nèi)注射結(jié)核菌素試驗(yàn)(comparative cervical intradermal tuberculin test，CCIT) 方法對(duì)巴基斯坦白沙瓦地區(qū)556頭黃牛和水牛的牛結(jié)核病 (Bovine tuberculosis，bTB)進(jìn)行了檢測(cè)，5.75% (3.9%～8.0%) 為陽(yáng)性，老齡動(dòng)物的陽(yáng)性率高于青年動(dòng)物(P<0.01)，同時(shí)開(kāi)展的關(guān)于社會(huì)人口學(xué)狀態(tài)、動(dòng)物特性、管理等影響因素的畜主問(wèn)卷調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，畜主對(duì)于TB 由動(dòng)物傳播到人及TB的癥狀了解的非常少，只有3.6%的農(nóng)場(chǎng)主能夠比較準(zhǔn)確的描述主要的臨床癥狀。Albernaz T T等[20]對(duì)來(lái)自巴西帕拉州1 140頭水牛進(jìn)行了檢測(cè),4.65% (53/1 140)為CCT檢測(cè)陽(yáng)性,2.98% (34/1 140) 無(wú)結(jié)論,92.36% (1 053/1 140) 為CCT檢測(cè)陰性,在168頭被屠宰動(dòng)物中,33頭為CCT檢測(cè)陽(yáng)性,18頭為無(wú)結(jié)論,117頭為CCT檢測(cè)陰性,組織病理學(xué)加細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果表明，發(fā)病率為4.16%。這些結(jié)果說(shuō)明,CCT檢測(cè)能夠獲得滿意的檢測(cè)效果。

除了SICT，檢測(cè)γ干擾素(IFN-γ) 釋放的BOVIGAM(?) 1G也是一種常用的牛結(jié)核病診斷方法。為了獲得最高敏感度的測(cè)試方法，南非的van der Heijden EM 等對(duì)基于細(xì)胞介導(dǎo)的免疫測(cè)試(CMI-)和基于體液免疫的測(cè)試方法進(jìn)行了比較。2013年bTB SICTT測(cè)試結(jié)果表明，SICTT陽(yáng)性率為13/35，1頭無(wú)檢測(cè)結(jié)論。應(yīng)用基于CMI的免疫測(cè)試[BOVIGAM(?) 1G (B1G)和BOVIGAM(?) 2G (B2G)]及血清學(xué)檢測(cè) (IDEXX TB ELISA) 進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)，并對(duì)13 頭陽(yáng)性牛和1頭無(wú)檢測(cè)結(jié)論的牛進(jìn)行宰后檢測(cè)，以確定bTB。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在8/14(57.1%) 中存在bTB的損傷特征，并根據(jù)肉芽腫損傷SICTT陽(yáng)性動(dòng)物數(shù)量的比例計(jì)算陽(yáng)性率(相對(duì)陽(yáng)性率)。比較結(jié)果表明，B1G 測(cè)試方法的敏感性最高 (100%;8/8)，B2G assay次之 (75%;6/8) ，IDEXX TB ELISA最低 (37.5%;3/8)。在21頭 SICTT 陰性水牛中，7頭表現(xiàn)為B2G 或 IDEXX TB ELISA陽(yáng)性反應(yīng)。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，BOVIGAM(?) IFN-γ 檢測(cè)的效果最好[21]。

IFN-γ 釋放檢測(cè)基于病原起源的肽抗原，敏感性欠佳。Goosen W J 等[22]以抗原依賴的IFN-γ誘導(dǎo)蛋白-10 9(IFN-γ-induced protein 10，IP-10)釋放檢測(cè)替代IFN-γ的檢測(cè)。 應(yīng)用Bovigam PC-EC 和 Bovigam PC-HP 檢測(cè)和改進(jìn)的 QuantiFERON TB-Gold (mQFT) 方法測(cè)定了血漿中的IP-10，檢測(cè)了水牛結(jié)核病。Bovigam陽(yáng)性水牛的M.bovis抗原比例顯著高于Bovigam陰性的動(dòng)物，以Bovigam 結(jié)果為參照，應(yīng)用ROC曲線確定了診斷相關(guān)的IP-10臨界值， 比較了基于IP-10 和 IFN-γ mQFT 的測(cè)試結(jié)果。 以IP-10作為診斷標(biāo)記物，檢測(cè)到大量的Bovigam陽(yáng)性動(dòng)物。作為抗原識(shí)別的敏感標(biāo)記物，在抗原刺激的全血中測(cè)定IP-10能增加非洲水牛常規(guī) IGRAs的敏感性。

在巴基斯坦，結(jié)核菌素試驗(yàn)或結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)是檢測(cè)結(jié)核病的主要手段。為了分析結(jié)核桿菌的型，Akhtar F等[23]用PCR對(duì)奶牛和水牛的奶樣和鼻拭子進(jìn)行擴(kuò)增，24.7%的樣本呈結(jié)核菌素試驗(yàn)陽(yáng)性，92.5% 的奶樣和鼻拭子呈結(jié)核桿菌PCR陽(yáng)性,86.8%為結(jié)核桿菌復(fù)合群，77.4%為牛分支桿菌。

4　李氏桿菌病

印度Shakuntala I等[24]對(duì)來(lái)自135頭水牛的530份糞、鼻腔、陰道拭子及血樣進(jìn)行了李氏桿菌篩查。單核細(xì)胞增生李氏桿菌和其他李氏桿菌的患病率分別達(dá)到4.4和7.4%。 用PCR擴(kuò)增prfA、plcA、hlyA、actA和iap等毒力相關(guān)基因，用磷脂酰肌醇磷脂酶C(PI-PLC)和小鼠與雞胚接種試驗(yàn)檢測(cè)其致病性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，全部單核細(xì)胞增生李氏桿菌分離物呈現(xiàn)溶血和hlyA基因陽(yáng)性，其中1株分離物呈現(xiàn)5個(gè)毒力相關(guān)基因全部陽(yáng)性，且在PI-PLC試驗(yàn)和動(dòng)物毒力試驗(yàn)中呈陽(yáng)性，其余分離物具有hlyA基因，缺失plcA基因，PI-PLC和動(dòng)物毒力試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明無(wú)致病性。從而說(shuō)明多種毒力相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)合動(dòng)物致病性試驗(yàn)可以用于檢測(cè)病原性單核細(xì)胞增生李氏桿菌。

印度Barbuddhe S B等[25]發(fā)現(xiàn)，在284份水牛血清樣本中，基于李氏桿菌溶血素(listeriolysin O，LLO) 的間接ELISA 檢測(cè)結(jié)果表明，25.35%的樣本呈陽(yáng)性。單核細(xì)胞增生李氏桿菌的培養(yǎng)物陽(yáng)性結(jié)果和抗李氏桿菌溶血素(ALLO) 的檢測(cè)結(jié)果無(wú)一致性。 奶樣、肉樣中的病原性單核細(xì)胞增生李氏桿菌，以及血清中的抗李氏桿菌溶血素抗體在診斷中值得關(guān)注。Chaudhari S P等[26]用3×109個(gè)病原性單核細(xì)胞增生李氏桿菌口腔感染水牛牛犢，進(jìn)而分析了ALLO的動(dòng)力學(xué)和單核細(xì)胞增生李氏桿菌的回收方式。間接平板ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，在感染后7 d～10 d，出現(xiàn)ALLO；在感染后16 d～36 d，出現(xiàn)1個(gè)窄峰，之后，ALLO滴度緩慢降低，但仍可以檢測(cè)到，直至感染后70 d。Dot-ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，在感染后5 d～7 d，出現(xiàn)ALLO，滴度高于間接平板ELISA的檢測(cè)結(jié)果。在ALLO出現(xiàn)之初，可以回收低比例的病原，但當(dāng)ALLO達(dá)到峰值時(shí)，不能在糞、鼻腔、血樣中回收到病原菌。

5　展望

就水牛細(xì)菌性傳染病的種類而言，除了乳房炎、布魯菌病、結(jié)核病和李氏桿菌病之外，常見(jiàn)的還有鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等導(dǎo)致的疾??；就水牛細(xì)菌性傳染病研究的深度，尤其是我國(guó)對(duì)于水牛細(xì)菌性傳染病的研究而言，與豬、雞等動(dòng)物的細(xì)菌性傳染病研究相比，還有一定的差距。但毋庸質(zhì)疑，隨著水牛養(yǎng)殖集約化程度和產(chǎn)業(yè)化水平的提高，以及相應(yīng)的對(duì)于加強(qiáng)技術(shù)支撐體系的迫切需求，國(guó)內(nèi)外對(duì)水牛細(xì)菌性傳染病研究的水平一定會(huì)達(dá)到新的高度。

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Introduction to Four Kinds of Bacterial Infectious Diseases of Buffalo

DU Li,WANG Feng-yang

(Hainan Key Lab of Tropical Animal Reproduction & Breeding andEpidemicDiseaseResearch,AnimalGeneticEngineeringKeyLabofHaikou,CollegeofAgriculture,HainanUniversity,Haikou,Hainan,570228,China)

With the buffalo industry development,the research level improvement of the bacterial infectious diseases of buffalo is necessary.Serological survey can provide the basic data for the prevalence of the bacterial infectious diseases of buffaloes;pathogen typing can provide the important basis for the diagnosis of the bacterial infectious diseases of buffalo;the study on the accuracy and specificity of diagnosic can improve the diagnostis level for the bacterial infectious diseases of buffalo.So,the research progress on the serological survey,pathogen typing,and the study on the accuracy and specificity of diagnosis of mastitis,brucellosis,tuberculosis,and listeriosis of buffalo abroad were reviewed.

buffalo;bacterial infectious disease；diagnosis

2016-03-25

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (31460670)

杜麗(1973-)，女，山西陽(yáng)高人，教授，主要從事獸醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué)研究。*通訊作者

S855.1；S858.23

A

1007-5038(2016)08-0099-05