何紫琪，李從榮

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430060）

結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)對(duì)結(jié)核病治療效果的監(jiān)測(cè)價(jià)值

何紫琪，李從榮

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430060）

目的 探討結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)對(duì)結(jié)核病治療療效的監(jiān)測(cè)意義。方法本研究采用T-SPOT.TB試劑盒，檢測(cè)T細(xì)胞中γ-干擾素對(duì)結(jié)核分支桿菌特異性多肽類早期分泌性抗原靶標(biāo)6-kD(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白(CFP-10)的應(yīng)答，對(duì)比113例結(jié)核感染者治療前與治療后T-SPOT.TB結(jié)果的變化，其結(jié)果根據(jù)對(duì)該試驗(yàn)中兩種抗原的聯(lián)合與各自應(yīng)答來(lái)分析。結(jié)果113例感染者在治療后T-SPOT.TB結(jié)果轉(zhuǎn)陰者有42例(37.2%)。其中，CFP-10轉(zhuǎn)陰率占48.9%(P＜0.001)，ESAT-6轉(zhuǎn)陰率占20.0%(P=0.238)。ESAT-6的斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFCs)/2.5×105外周血單核細(xì)胞(PBMCs)的平均數(shù)在治療前和治療后分別為18.47和16.29(P=0.16)，而CFP-10的SFCs/PBMCs的平均數(shù)在治療前和治療后分別為22.83和15.31(P＜0.01)。結(jié)論結(jié)核病治療對(duì)于T細(xì)胞中γ-干擾素引起的ESAT-6和CFP-10抗原應(yīng)答影響不同，CFP-10的定量應(yīng)答才是結(jié)核病治療的更有效監(jiān)測(cè)手段。

結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)；早期分泌性抗原靶標(biāo)6-kD蛋白；培養(yǎng)濾液蛋白CFP-10；結(jié)核病治療

在有沉重結(jié)核病負(fù)擔(dān)的國(guó)家，對(duì)結(jié)核感染者進(jìn)行及時(shí)的鑒別診斷和治療是一種重要的結(jié)核病控制和消除手段[1-2]。目前除了觀察接受治療患者的疾病進(jìn)展，尚無(wú)試驗(yàn)來(lái)確定結(jié)核病治療效果。

近來(lái)，市售的商品化T-SPOT.TB試劑盒通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)可將單個(gè)被激活的結(jié)核分支桿菌特異性T細(xì)胞顯現(xiàn)出來(lái)。試驗(yàn)過(guò)程中過(guò)夜孵育使經(jīng)結(jié)核分支桿菌抗原刺激的效應(yīng)T細(xì)胞激活，若效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量隨治療過(guò)程中分支桿菌抗原量下降而下降，那么測(cè)量分支桿菌特異性抗原應(yīng)答的T細(xì)胞數(shù)即對(duì)于判定治療的有效性有重要意義[3]。本研究即通過(guò)T-SPOT.TB試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)其在結(jié)核病治療中的監(jiān)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年1月至2015年12月來(lái)我院行T-SPOT.TB檢查的患者909例，其中325例患者T-SPOT.TB試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。325例患者中238例為我院住院患者并最終確診為結(jié)核菌感染，其中肺結(jié)核212例，骨結(jié)核18例，結(jié)核性腦膜炎3例，腸結(jié)核5例，其余患者為隱匿性結(jié)核菌感染者。剔除經(jīng)≥6個(gè)月治療后未回我院進(jìn)行復(fù)診并再次行T-SPOT.TB試驗(yàn)的患者，剩余113例患者納入本次研究。

1.2 T-SPOT.TB試驗(yàn) 采用上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司提供的試劑盒，嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。結(jié)果判讀：空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5個(gè)時(shí)且(抗原A或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù))-(空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù))≥6，判斷為陽(yáng)性；空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為6～10個(gè)時(shí)且(抗原A或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù))≥2×(空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù))，判斷為陽(yáng)性；上述標(biāo)準(zhǔn)不符合且陽(yáng)性質(zhì)控對(duì)照孔正常時(shí)檢測(cè)結(jié)果為“無(wú)反應(yīng)性”。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0軟件，散點(diǎn)圖作圖采用GraphPad Prism 5軟件。組間比例差異的比較采用χ2檢驗(yàn)，配對(duì)比例差異的比較采用McNemar檢驗(yàn)，配對(duì)資料平均數(shù)的比較采用Man-Whitney U檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 113例患者治療前與治療后的T-SPOT.TB結(jié)果 治療前，113例T-SPOT.TB陽(yáng)性患者中ESAT-6陽(yáng)性者60例(53.1%)；CFP-10陽(yáng)性者90例(79.6%)。其中，僅ESAT-6陽(yáng)性者23例(20.1%)，僅CFP-10陽(yáng)性者53例(46.9%)，二者均陽(yáng)性者37例(32.7%)。治療后，T-SPOT.TB轉(zhuǎn)陰者42例(37.2%)。剩余71例治療后仍為陽(yáng)性的患者中有22例(30.9%)僅為ESAT-6陽(yáng)性，有17例(23.9%)僅CFP-10陽(yáng)性，有32例(45.1%)二者均陽(yáng)性(如圖1)。治療前，患者ESAT-6的SFCs/2.5×105PBMCs計(jì)數(shù)為0～84，平均值為18.47；治療后，患者ESAT-6的SFCs/PBMCs計(jì)數(shù)為0～120，平均值為16.29。治療前與治療后均值經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)比較，P=0.158 9。治療前，患者CFP-10的SFCs/2.5×105PBMCs計(jì)數(shù)為0～192，平均值為22.83；治療后，患者CFP-10的SFCs/PBMCs計(jì)數(shù)為0～158，平均值為15.31。治療前與治療后均值經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.01(如圖2)。

圖1 治療前與治療后ESAT-6、CFP-10陽(yáng)性例數(shù)示意圖

圖2 治療前與治療后ESAT-6、CFP-10的SFCs/PBMCs數(shù)比較

2.2 113例患者治療前與治療后ESAT-6、CFP-10計(jì)數(shù) 在23例治療前僅ESAT-6陽(yáng)性的患者中有6例(26.09%)治療后轉(zhuǎn)陰；在53例治療前僅CFP-10陽(yáng)性的患者中有35例(66.04%)治療后轉(zhuǎn)陰；在37例治療前二者均為陽(yáng)性的患者中有4例(10.8%)治療后均轉(zhuǎn)陰，2例(5.4%)僅ESAT-6轉(zhuǎn)陰，5例(13.5%)僅CFP-10轉(zhuǎn)陰，見(jiàn)表1、表2。治療前，ESAT-6陽(yáng)性與陰性患者所占比例分別為53.1%與46.9%；CFP-10陽(yáng)性與陰性患者所占比例分別為79.65%與20.35%。治療后，ESAT-6陽(yáng)性與陰性患者所占比例分別為47.79%與52.2%；CFP-10陽(yáng)性與陰性患者所占比例分別為43.36%與56.64%。經(jīng)配對(duì)比例差異McNemar檢驗(yàn)，治療前與治療后患者對(duì)ESAT-6應(yīng)答比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.238)，而對(duì)CFP-10應(yīng)答比例差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 治療前與治療后患者對(duì)ESAT-6應(yīng)答數(shù)(例)

表2 治療前與治療后患者對(duì)CFP-10應(yīng)答數(shù)(例)

2.3 113例患者治療前與治療后對(duì)ESAT-6和CFP-10應(yīng)答的變化趨勢(shì) 由于此斑點(diǎn)計(jì)數(shù)是人工判讀，結(jié)果無(wú)法精確的再現(xiàn)，因此將計(jì)數(shù)±5SFCs/ PBMCs內(nèi)的斑點(diǎn)數(shù)劃分為“不變”。在治療前與治療后患者對(duì)ESAT-6應(yīng)答的降低、不變、上升的比例分別為48.67%、12.39%和38.94%；對(duì)CFP-10應(yīng)答的降低、不變、上升的比例分別為67.26%、6.19%和26.55%，見(jiàn)表3。二者經(jīng)組間比例差異比較的χ2檢驗(yàn)，得出P= 0.008，表明ESAT-6和CFP-10的應(yīng)答數(shù)在經(jīng)治療后降低、不變與上升的比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中患者對(duì)ESAT-6應(yīng)答下降的比例低于CFP-10，而不變與上升的比例均高于CFP-10。

表3 治療前與治療后對(duì)ESAT-6和CFP-10應(yīng)答變化(例)

3 討論

結(jié)核分支桿菌抗原特異性γ干擾素釋放試驗(yàn)(IGRAs)是近來(lái)結(jié)核分支桿菌感染診斷領(lǐng)域的一項(xiàng)重要進(jìn)展[4-5]，它所檢測(cè)的是T細(xì)胞中γ-干擾素對(duì)結(jié)核分支桿菌特異性多肽的應(yīng)答而產(chǎn)生的早期分泌性抗原ESAT-6和培養(yǎng)濾液蛋白CFP-10。這些抗原是由存在于所有結(jié)核分支桿菌的1號(hào)基因組差異區(qū)域編碼，而非結(jié)核分支桿菌和BCG疫苗菌株不含該區(qū)域，因此該抗原具有結(jié)核分支桿菌高度特異性。我們認(rèn)為，效應(yīng)T細(xì)胞的數(shù)量隨著治療過(guò)程中分支桿菌抗原量(即細(xì)菌載量)的降低而下降，那么抗原計(jì)數(shù)的變化即能反映治療的情況[6]。

本研究我們采用T-SPOT.TB試劑盒，對(duì)比113例感染者在治療前與經(jīng)治療好轉(zhuǎn)后其ESAT-6和CFP-10抗原應(yīng)答數(shù)量上的差異。對(duì)于ESAT-6抗原而言，治療前患者陽(yáng)性率為53.10%，治療后陽(yáng)性率為47.79%，該下降率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；但對(duì)于CFP-10抗原而言，治療前患者陽(yáng)性率為80.1%，治療后陽(yáng)性率下降為43.36%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。從抗原應(yīng)答顯示的斑點(diǎn)數(shù)來(lái)看，治療前ESAT-6的平均值為18.47，治療后下降至16.29，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；而CFP-10治療前平均斑點(diǎn)數(shù)為22.83，治療后下降至15.31，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。因考慮到斑點(diǎn)計(jì)數(shù)較為主觀，斑點(diǎn)結(jié)果無(wú)法準(zhǔn)確再現(xiàn)，研究中將斑點(diǎn)變化在5以內(nèi)劃分為“不變”，使用此方法，我們發(fā)現(xiàn)，67.26%的患者在治療后CFP-10斑點(diǎn)數(shù)下降，而51.3%的患者在治療后斑點(diǎn)數(shù)仍不變甚至上升(P＜0.05)。這些數(shù)據(jù)表明，結(jié)核治療使CFP-10抗原應(yīng)答有顯著的下降和轉(zhuǎn)化，但對(duì)ESAT-6抗原卻無(wú)此效應(yīng)。

目前已發(fā)表的關(guān)于結(jié)核治療對(duì)T細(xì)胞對(duì)結(jié)核分支桿菌特異性抗原應(yīng)答影響的縱向研究不多，研究對(duì)象也較少。Nicol等[7]研究團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)關(guān)于兒童的報(bào)道顯示：T細(xì)胞對(duì)于ESAT-6的應(yīng)答早期升高，在3個(gè)月后下降。一項(xiàng)由Aiken等[8]完成的89例患者研究中顯示：ESAT-6和CFP-10的計(jì)數(shù)在治療12個(gè)月后下降。Ewer等[9]報(bào)道：在接受3個(gè)月的異煙肼和利福平治療后，38例患者在6個(gè)月后對(duì)ESAT-6和CFP-10的應(yīng)答增加。這些學(xué)者所持的觀點(diǎn)與我們的研究不盡相同，可能與研究對(duì)象數(shù)量和治療時(shí)間長(zhǎng)短等因素有關(guān)。且我們的研究存在一定的局限性：患者服藥是自主執(zhí)行，因此服藥的依從性無(wú)法完全保證；此外，我們對(duì)于未經(jīng)治療的患者也無(wú)法跟蹤作T細(xì)胞應(yīng)答監(jiān)測(cè)。但有來(lái)源于其他調(diào)查的數(shù)據(jù)顯示：在無(wú)任何治療干預(yù)的情況下，陽(yáng)性T-SPOT.TB應(yīng)答仍保持不變[9]。

T-SPOT.TB這項(xiàng)新興的外周血檢測(cè)試驗(yàn)有望最終取代沿用百年的結(jié)核菌素試驗(yàn)(TST)[10-11]，目前國(guó)內(nèi)外已有許多關(guān)于該檢測(cè)方法的報(bào)道，肯定了其在結(jié)核病診斷中的價(jià)值，在英美等發(fā)達(dá)國(guó)家，IGRAs已被列入了結(jié)核病的診斷指南，其主要用于輔助篩查兒童中的無(wú)癥狀感染者，HIV感染者合并結(jié)核感染的診斷以及結(jié)核潛伏感染的流行病學(xué)調(diào)查[12-13]。本研究則從治療監(jiān)測(cè)的角度，探討了它在反映結(jié)核治療中的應(yīng)用價(jià)值，結(jié)果表明，該試驗(yàn)的兩種抗原中CFP-10的數(shù)量變化是結(jié)核治療更好的一項(xiàng)監(jiān)測(cè)手段。更多關(guān)于此試驗(yàn)在結(jié)核治療過(guò)程中的作用研究還在持續(xù)進(jìn)行，一項(xiàng)結(jié)核病治愈的替代標(biāo)志物或疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)因素有望產(chǎn)生。

[1]Zhang L,Zhang Y,Shi X,et al.Utility of T-cell interferon-gamma release assays for diagnosing tuberculous serositis:a prospective study in Beijing,China[J].PLoS One,2014,9(1):85030.

[2]Bathoorn E,Limburg A,Bouvman JJ,et al.Diagnostic potential of an enzyme-linked immunospot assay in tuberculous pericarditis[J].Clin Vaccine Immunol,2011,18(5):874-877.

[3]Chiappini E,Fossi F,Bonsignori F,et al.Utility of interferon-gamma release assay results to monitor anti-tubercular treatment in adults and children[J].Clin Ther,2012,34(5):1041-1048.

[4]Denkinger CM,Dheda K,Pai M.Guidelines on interferon-γ release assays for tuberculosis infection:concordance,discordance or confusion[J].Clin Microbiol Infect,2011,17(6):806-814.

[5]Ahmad S.New approaches in the diagnosis and treatment of latent tuberculosis infection[J].Respir Res,2010,11:169.

[6]Chee CB,KhinMar KW,Gan SH,et al.Tuberculosis treatment effect on T-cell interferon-gamma responses to mycobacterium tuberculosis-specific antigens[J].Eur Respir J,2010,36(2):355-361.

[7]Nicol M,Pienaar D,Wood K,et al.Enzyme-linked immunospot assay responses to ESAT-6,CFP-10 and purified protein derivative among children with tuberculosis:implications for diagnosis and monitoring of therapy[J].Clin Infect Dis,2005,40(9):1301-1308.

[8]Aiken A,Hill P,Fox A,et al.Reversion of the ELISPOT test after treatment in Gambian tuberculosis cases[J].BMC Infect Dis,2006, 6:66.

[9] Ewer K,Millington K,Deeks JJ,et al.Dynamic antigen-specific T-cell responses after point-source exposure to Mycobacterium tuberculosis[J].Am Respir Crit Care Med,2006,174(7):831-839.

[10]Leung CC,Yan WC,Ho PL,et al.T-SPOT.TB outperforms tuberculin skin test in predicting development of active tuberculosis among household contacts[J].Resirology,2015,20(3):496-503.

[11]Jung YJ,Woo HI,Jeon K,et al.The significance of sensitive interferon gamma release assays for diagnosis of latent tuberculosis infection in patients receiving tumor necrosis factor-alpha antagonist therapy[J].PLoS One,2015,10(10):e0141033.

[12]Hu XM,Liu J,Lei L,et al.Clinical usefulness of T-SPOT.TB in the diagnosis tuberculosis in emergency patients[J].Emergency Medicine,2012,12(suppl1):A7.

[13]Jose M,Catalina R,Mar M et al.Contribution of interferon gamma release assays testing to the diagnosis of latent tuberculosis infection in HIV-infected patients:A comparison of QuantiFERON-TB Gold in tube,T-SPOT.TB and tuberculin skin test[J].BMC Infectious Diseases,2012,12(169):2-10.

Value of T-SPOT.TB assay on monitoring the tuberculosis treatment efficacy.

HE Zi-qi,LI Cong-rong.Department of Clinical Laboratory,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo explore the value of T-SPOT.TB assay on monitoring the tuberculosis treatment efficacy.MethodsWe used the T-SPOT.TB assay to measure T-cell interferon-γ responses to Mycobacterium tuberculosis-specific peptides early secretory antigenic target 6-kD protein(ESAT-6)and culture filtrate protein 10 (CFP-10)in 113 patients with tuberculosis before and after the treatment.The results of changes in T-SPOT.TB before and after the treatment were analyzed according to the combined and separate responses to ESAT-6 and CFP-10 antigens.ResultsWhen the treatment was completed,42(37.2%)of 113 patients with tuberculosis reverted to negative according to the T-SPOT.TB results,of which CFP-10 reversion rate was 48.9%(P＜0.001),and the ESAT-6 reversion rate was 20.0%(P=0.238).The mean number of spot-forming cells(SFCs)/2.5×105peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)pre-and post-treatment were respectively 18.47 versus 16.29 for ESAT-6(P=0.16)and 22.83 versus 15.31 for CFP-10(P＜0.01).ConclusionTuberculosis treatment has a differential effect on T-cell responses to ESAT-6 and CFP-10 as measured by T-SPOT.TB.The quantitative response to CFP-10 may be a more useful monitoring tool for treatment efficacy.

T-SPOT.TB assay;Early secretory antigenic target 6-kD protein(ESAT-6);Culture filtrate protein 10(CFP-10);Tuberculosis treatment

R52

A

1003—6350（2016）12—1923—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.12.009

2015-12-28)

李從榮。E-mail：congrongli33@hotmail.com