黃紅瑩，劉英杰，衛(wèi)文強(qiáng)，婁　強(qiáng)，許國(guó)強(qiáng)

(河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室，河南 開(kāi)封475000)

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微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革初探*

黃紅瑩，劉英杰，衛(wèi)文強(qiáng)，婁強(qiáng)，許國(guó)強(qiáng)

(河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室，河南 開(kāi)封475000)

醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)與臨床結(jié)合緊密，是一門實(shí)踐性很強(qiáng)的基礎(chǔ)課。時(shí)代的發(fā)展要求教師對(duì)實(shí)驗(yàn)教學(xué)加快改革和創(chuàng)新。 通過(guò)查閱資料并結(jié)合該院的實(shí)驗(yàn)條件，筆者提出了實(shí)驗(yàn)教學(xué)的整改措施，使實(shí)驗(yàn)教學(xué)緊密聯(lián)系實(shí)際，關(guān)注時(shí)代發(fā)展，為提高學(xué)生的動(dòng)手能力、科研能力及綜合素質(zhì)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

微生物學(xué)；實(shí)驗(yàn)教學(xué)；內(nèi)容更新

人類社會(huì)的發(fā)展無(wú)時(shí)無(wú)刻不伴隨著微生物的感染與疾病的發(fā)生，當(dāng)今社會(huì)不斷出現(xiàn)新型微生物的感染，已對(duì)人類健康造成極大威脅[1]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)病原微生物的認(rèn)識(shí)不斷深入，特別是對(duì)重要病原微生物的基因結(jié)構(gòu)、功能和致病機(jī)制有了較深入的了解[2]。作為臨床醫(yī)學(xué)的一門基礎(chǔ)課程，醫(yī)學(xué)微生物學(xué)擔(dān)負(fù)著越來(lái)越重要的作用。醫(yī)學(xué)微生物學(xué)是一門實(shí)踐學(xué)科，其理論知識(shí)均來(lái)源于實(shí)驗(yàn)，所以實(shí)驗(yàn)課是其中重要的組成部分。近年來(lái)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)的發(fā)展突飛猛進(jìn),新的技術(shù)、成果不斷出現(xiàn)，傳統(tǒng)的教育模式也在隨之發(fā)生轉(zhuǎn)變[3],這對(duì)醫(yī)生和醫(yī)學(xué)生也提出了更高的要求。 時(shí)代的發(fā)展要求教師對(duì)實(shí)驗(yàn)教學(xué)加快改革和創(chuàng)新。因此，筆者積極申報(bào)儀器設(shè)備，結(jié)合河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院的實(shí)驗(yàn)條件提出了實(shí)驗(yàn)教學(xué)的整改措施，爭(zhēng)取為提高學(xué)生的動(dòng)手能力、創(chuàng)新能力及綜合素質(zhì)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1　設(shè)置原則

學(xué)生對(duì)基本技能實(shí)驗(yàn)的熟練程度將直接影響到微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)及學(xué)生創(chuàng)新能力的培養(yǎng)，且現(xiàn)代醫(yī)學(xué)人才培養(yǎng)需要掌握更先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。因此，筆者實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)置原則是：在保留基本技能實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行積極的更新；增加與生活密切相關(guān)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

2　設(shè)置方法

2.1理論聯(lián)系實(shí)際近年來(lái)，醫(yī)學(xué)微生物學(xué)發(fā)展迅速，其理論內(nèi)容及實(shí)驗(yàn)技術(shù)都在不斷更新。為了加深學(xué)生對(duì)理論知識(shí)的認(rèn)識(shí)，增加學(xué)習(xí)興趣，在微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，安排了與生活、生理密切相關(guān)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，將學(xué)生遇到的一些問(wèn)題同微生物學(xué)知識(shí)緊密結(jié)合起來(lái)。如：在進(jìn)行微生物的分布檢測(cè)技術(shù)中，選擇了自來(lái)水中微生物的檢測(cè)，既讓學(xué)生掌握了水中微生物檢測(cè)技術(shù)，也讓學(xué)生掌握了活菌計(jì)數(shù)技術(shù)；在進(jìn)行環(huán)境條件對(duì)微生物影響的項(xiàng)目中，選擇醫(yī)院中常用的酒精、碘酒、新潔爾滅等因素進(jìn)行檢測(cè)，學(xué)生既掌握了基本技術(shù)，也對(duì)消毒劑的殺菌作用有了實(shí)際了解；在微生物形態(tài)觀察中，選擇口腔中微生物形態(tài)的觀察，從而使學(xué)生更加直觀地認(rèn)識(shí)到人類與微生物之間的緊密關(guān)系。

2.2關(guān)注時(shí)代發(fā)展隨著時(shí)代發(fā)展，新的病原體及感染性疾病不斷出現(xiàn)，診斷病原體的常規(guī)方法主要有細(xì)菌培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、核酸雜交、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，特別是ELISA，由于其快速靈敏而在臨床上得到廣泛應(yīng)用。比如利用ELISA 測(cè)定乙肝病毒表達(dá)的蛋白質(zhì)( 多肽) 抗原或相應(yīng)的抗體，是輔助診斷乙肝的常規(guī)方法，特別對(duì)急性乙肝的發(fā)現(xiàn)有重要作用，但其對(duì)慢性乙肝的診斷越來(lái)越不靈敏，特別是在乙肝病毒發(fā)生了變異以后，需要進(jìn)行 HBV-DNA 檢測(cè)才能確診[4]。PCR技術(shù)具有較高的檢測(cè)敏感性，利用熒光定量PCR可定量檢測(cè) HBV-DNA，客觀地反映HBV感染、復(fù)制及病程變化，修正或補(bǔ)充了對(duì) ELISA測(cè)定結(jié)果的解釋。PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，特別是在感染性疾病中的應(yīng)用，使人們更深入了解了感染性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。目前，應(yīng)用多重 PCR方法對(duì)感染性疾病病原檢測(cè)主要有兩個(gè)方向: ①針對(duì)一種病原的單個(gè)特異基因進(jìn)行多重檢測(cè)，可同時(shí)檢測(cè)一種或幾種病原體的存在與否。②針對(duì)某一病原的多個(gè)基因進(jìn)行多重檢測(cè)，可減少假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在同一PCR反應(yīng)管中同時(shí)加入多種病原微生物的特異性引物，能夠同時(shí)檢測(cè)多種病原體或鑒定出是哪一型病原體感染。該教研室以前開(kāi)設(shè)的都是一些傳統(tǒng)的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如細(xì)菌培養(yǎng)，生化反應(yīng)等,關(guān)于分子生物學(xué)技術(shù)，學(xué)生只掌握了理論知識(shí)。為了培養(yǎng)符合時(shí)代要求的新型專業(yè)人才，本科生實(shí)驗(yàn)課所開(kāi)設(shè)的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目也應(yīng)與時(shí)俱進(jìn)，合理更新。為讓學(xué)生掌握PCR技術(shù)，結(jié)合實(shí)際情況，建立了大腸桿菌PCR快速檢測(cè)技術(shù)。

2.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在以前的實(shí)驗(yàn)中，學(xué)生已學(xué)習(xí)了大腸桿菌的形態(tài)、培養(yǎng)技術(shù)、生化反應(yīng)等，對(duì)大腸桿菌有了較全面的了解；另外，大腸桿菌無(wú)致病性，容易培養(yǎng)，因此，選用大腸桿菌PCR檢測(cè)讓學(xué)生進(jìn)一步學(xué)習(xí)PCR技術(shù)，比較容易理解。

大腸桿菌PCR快速檢測(cè)包含DNA提取技術(shù)、PCR反應(yīng)體系的建立及核酸擴(kuò)增技術(shù)和核酸電泳技術(shù)?？紤]到學(xué)生初次接觸分子生物學(xué)技術(shù)，操作步驟復(fù)雜，將此檢測(cè)技術(shù)分別放在三次實(shí)驗(yàn)中完成。在此之前，學(xué)生已掌握了顯微鏡技術(shù)及細(xì)菌染色，細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)及生化反應(yīng)，消毒滅菌技術(shù)，細(xì)菌在自然界的分布檢測(cè)技術(shù)等實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，對(duì)微生物學(xué)及其實(shí)驗(yàn)技術(shù)已經(jīng)有了較深入的了解。在此基礎(chǔ)上，引進(jìn)分子生物學(xué)技術(shù)，激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)微生物學(xué)的興趣，開(kāi)闊思路，增強(qiáng)學(xué)生的實(shí)際操作能力和科研創(chuàng)新能力。

2.2.2實(shí)驗(yàn)操作大腸桿菌PCR快速檢測(cè)技術(shù)的實(shí)驗(yàn)材料較多，包括多種緩沖液的配制、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和大腸桿菌PCR快速檢測(cè)試劑盒等。先讓學(xué)生了解這些基本內(nèi)容及實(shí)驗(yàn)原理，然后分組討論，充分熟悉實(shí)驗(yàn)步驟，分工合作，這樣才能保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性大大提高，實(shí)驗(yàn)操作認(rèn)真仔細(xì)。

首先是DNA提取技術(shù)。在充分熟悉實(shí)驗(yàn)步驟的情況下，讓學(xué)生明白注意事項(xiàng)，否則可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。如避免樣品反復(fù)凍融，洗脫時(shí)的注意事項(xiàng)及DNA如何存放等。實(shí)驗(yàn)的每一步驟直接關(guān)系到DNA的提取量及其純度，也是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。事實(shí)證明，充分熟悉實(shí)驗(yàn)步驟的學(xué)生成功率比較高。在PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中，首先建立擴(kuò)增反應(yīng)體系。每四位學(xué)生一組，等全部完成后收集放入PCR儀，按設(shè)定好的循環(huán)參數(shù)開(kāi)始擴(kuò)增。由于時(shí)間有限，DNA電泳不能馬上進(jìn)行，所以擴(kuò)增的DNA完成后應(yīng)收集放

入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｏ麓螌?shí)驗(yàn)做核酸電泳，電泳用緩沖液已提前配制，學(xué)生需配制瓊脂糖凝膠，待其凝固后放入電泳槽內(nèi)，加緩沖液及樣品，設(shè)置好電壓及時(shí)間。電泳完畢，關(guān)上電源，用紫外分析儀觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn) Marker 比較被擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。大腸桿菌PCR快速檢測(cè)技術(shù)比較復(fù)雜，它不但需要一定的知識(shí)儲(chǔ)備，還考驗(yàn)了學(xué)生們的操作技能及認(rèn)真細(xì)致的工作作風(fēng)。通過(guò)此實(shí)驗(yàn)，大家學(xué)到了相關(guān)的理論知識(shí)，也認(rèn)識(shí)到作為一個(gè)醫(yī)學(xué)生應(yīng)該具備的素質(zhì)，提高了學(xué)習(xí)興趣，使大家對(duì)臨床醫(yī)學(xué)的科學(xué)研究有了更深一步的了解。

2.2.3實(shí)驗(yàn)分析傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定主要是根據(jù)表型特征，通過(guò)分離培養(yǎng)、染色鏡檢、菌落形態(tài)觀察、生化反應(yīng)特征、抗原分型等一系列實(shí)驗(yàn)后綜合分析得到結(jié)果。此法雖然廣泛用于病原菌檢測(cè)，但存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力、靈敏度低等缺點(diǎn)。隨著PCR和核酸研究技術(shù)的不斷發(fā)展，數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善，其在快速、微量、準(zhǔn)確分類鑒定和檢測(cè)病原菌方面將發(fā)揮越來(lái)越大的作用。在本實(shí)驗(yàn)中，教師利用PCR快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè)大腸桿菌，快速準(zhǔn)確地對(duì)大腸桿菌進(jìn)行了鑒定，且實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，從傳統(tǒng)的分離純化和生化鑒定到現(xiàn)代分子生物學(xué)鑒定，讓學(xué)生既學(xué)習(xí)理解了傳統(tǒng)細(xì)菌分離鑒定方法，又對(duì)現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在細(xì)菌分類鑒定中的應(yīng)用有了更深刻的認(rèn)識(shí)。

3　討論

醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)能夠有效地提高學(xué)生對(duì)此課程的學(xué)習(xí)興趣與積極性,加強(qiáng)師生之間的交流與互動(dòng),擴(kuò)展學(xué)生思維,培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新精神與實(shí)踐能力。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)教學(xué)也要求教師具有先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)理念、科學(xué)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)教材、系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容、先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)方法，這些是實(shí)驗(yàn)教學(xué)迅速發(fā)展的關(guān)鍵。只有不斷學(xué)習(xí)，大膽嘗試，才能跟上科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，培養(yǎng)出適應(yīng)臨床需要的醫(yī)學(xué)人才。

[1]劉春艷,艾軍紅.甲型H7N9禽流感病毒的病毒學(xué)特征[J].中國(guó)當(dāng)代兒科雜志,2013,15(6):405-408.

[2]蔣梅.禽流感病毒血凝素基因研究進(jìn)展[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2013,29(8)：817-820.

[3]王放，徐廣宇，王國(guó)慶，等. 現(xiàn)代臨床微生物學(xué)教學(xué)改革探討[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教育，2012,14(6):401-402.

[4]林杓鋒，李校坤，吳帆，等． 實(shí)行定量 PCR 在乙型肝炎(HBV) 診斷中的應(yīng)用[J]．中國(guó)生物工程雜志，2012，22(3):68-70．

[責(zé)任編校：柯莉]

2015-10-20

黃紅瑩(1964-)，女，河南省開(kāi)封市人，碩士，教授，從事微生物學(xué)教學(xué)與科研工作。

河南大學(xué)教改項(xiàng)目。

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