徐高麗 吳立立 吳枝武 谷志遠

浙江中醫(yī)藥大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，杭州 310053

缺氧誘導(dǎo)因子-1α信號通路在髁突軟骨生長和改建中的作用機制

徐高麗 吳立立 吳枝武 谷志遠

浙江中醫(yī)藥大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，杭州 310053

髁突軟骨在正常機體內(nèi)處于一個低氧環(huán)境中，軟骨細胞卻對此表現(xiàn)出較好地適應(yīng)能力，然而在體外細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，髁突軟骨細胞在傳代培養(yǎng)中很難保持穩(wěn)定性，這為髁突軟骨的研究帶來了較大困難。同時也考慮培養(yǎng)髁突軟骨細胞時是否應(yīng)盡可能模擬體內(nèi)低氧環(huán)境。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）是細胞對低氧環(huán)境適應(yīng)性反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，對維持軟骨細胞的穩(wěn)態(tài)和功能具有重要意義。本文就HIF-1α的生物活性結(jié)構(gòu)、相關(guān)信號通路及在髁突軟骨修復(fù)中的作用作一綜述。

缺氧誘導(dǎo)因子-1α； 髁突軟骨； 低氧； 靜壓力

顳下頜關(guān)節(jié)（temporomandibular joint，TMJ）是具有適應(yīng)性改建能力的滑膜關(guān)節(jié)，由顳骨關(guān)節(jié)窩、關(guān)節(jié)盤和下頜骨的髁突等組成。髁突表面的軟骨與普通滑膜關(guān)節(jié)軟骨不同，它是纖維軟骨，是一種特殊形式的結(jié)締組織，不含神經(jīng)纖維、血管及淋巴管，其營養(yǎng)代謝主要通過滑液擴散實現(xiàn)[1]。對髁突軟骨的研究依然是個巨大的挑戰(zhàn)，一方面人髁突軟骨很難獲得；另一方面由于軟骨細胞很難在體外培養(yǎng)時保持穩(wěn)定性，它會隨著增殖而發(fā)生去分化，由卵圓形逐漸變成成纖維樣細胞的長條狀，同時也會失去軟骨特異性標(biāo)記物，如2型膠原、蛋白多糖、SOX-9（Sry related HMG box-9）等。在正常機體內(nèi)，髁突軟骨處于低氧微環(huán)境，大量研究表明，越靠近關(guān)節(jié)深層，氧含量越低，達到1%?？梢娷浌羌毎钤谝粋€持續(xù)的低氧環(huán)境中，而對此表現(xiàn)出較大的適應(yīng)能力。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）是細胞對缺氧或低氧環(huán)境適應(yīng)性反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子[2]，髁突軟骨細胞是低氧感應(yīng)細胞，已有研究[3]證實HIF-1α對維持軟骨內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，保持軟骨細胞活力，促進軟骨細胞在低氧條件下能量和軟骨基質(zhì)產(chǎn)生方面起重要作用。正常機體內(nèi)軟骨細胞所處的低氧環(huán)境是否也為體外培養(yǎng)細胞時帶來新的思考，在培養(yǎng)細胞時是否應(yīng)該盡可能模擬體內(nèi)低氧環(huán)境，從而保持軟骨細胞的形態(tài)和功能，為髁突軟骨的修復(fù)和改建研究奠定基石。

1 HIF-1α的生物學(xué)特性

缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）是由Semenza等[4]發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)，由一個α亞單位（HIF-1α）和一個β亞單位（HIF-1β）構(gòu)成，α亞基和β亞基屬于基本螺旋-環(huán)-螺旋-PAS（basic-helixloop-helix-per-ant-sim，bHLH-PAS）家族蛋白[5]。HIF-1α由以下部分組成：1）位于氮末端的堿性螺旋環(huán)螺旋（basic/helix-loop-helix，bHLH）結(jié)構(gòu)域，主要參與HIF-1α與靶基因DNA結(jié)合以及與HIF-1β的二聚化；2）中部是氧依賴性降解域（oxygen dependent degradation domain，ODDD），常氧環(huán)境下，ODDD可被脯氨酸羥化酶（proline hydroxylase，PH）羥化，使HIF-1α被泛素連接酶所識別與結(jié)合，在翻譯后即被泛素一蛋白酶水解復(fù)合體降解[6]；3）碳末端有2個轉(zhuǎn)錄激活域，氮末端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（N-transcriptional activation domain，N-TAD）和碳末端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（C-transcriptional activation domain，C-TAD）[7]。

HIF-1α為氧依賴性調(diào)節(jié)蛋白，能感受細胞周圍的氧氣濃度，高氧環(huán)境下其半衰期非常短（<5 min），可被特殊的蛋白酶體降解。當(dāng)細胞內(nèi)氧濃度低于6%時HIF-1α保持穩(wěn)定并聚集，轉(zhuǎn)移進入細胞核，與核內(nèi)HIF-1β形成二聚體，與缺氧反應(yīng)元件（hypoxia reaction element，HRE）的5’-TACGTG-3’序列結(jié)合，形成HIF-1、p300/CBP環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB），以及其他轉(zhuǎn)錄因子的起始復(fù)合物，進而激活HIF-1靶基因的轉(zhuǎn)錄，引起組織細胞一系列的缺氧適應(yīng)性反應(yīng)，如血管新生與重塑、能量代謝、紅細胞生成、細胞增殖、凋亡等[8]。

2 HIF-1α的信號通路

2.1 氧感應(yīng)信號通路

氧對于一個生命體來說具有重要意義，氧濃度的改變往往會導(dǎo)致細胞和器官功能失調(diào)。為確保足夠氧氣的傳輸，機體已經(jīng)建立了復(fù)雜而又精細的系統(tǒng)去應(yīng)對缺氧，而細胞內(nèi)主要通過HIF-1α來調(diào)節(jié)。

髁突表層軟骨中含氧量為7%～10%，深層可降至1%，可見髁突軟骨處于生理性的無氧微環(huán)境中。Schipani等[9]發(fā)現(xiàn)從軟骨表層至深層，隨著氧濃度的降低，HIF-1α從細胞漿轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)；去除表層軟骨后，中下層軟骨氧濃度升高，HIF-1α從核內(nèi)轉(zhuǎn)出。特異性敲除HIF-1α基因后，軟骨中低氧區(qū)域細胞死亡增多，說明HIF-1α對軟骨細胞在低氧環(huán)境中存活有重要作用。

髁突軟骨主要有軟骨細胞和軟骨基質(zhì)組成，其中軟骨基質(zhì)成分決定著其生物學(xué)特性。2型膠原和蛋白多糖是軟骨基質(zhì)的主要成分，成熟軟骨中基質(zhì)合成和降解處于動態(tài)的平衡。Pfander等[10]發(fā)現(xiàn)HIF-1α基因敲除后的軟骨細胞在低氧培養(yǎng)下合成蛋白多糖和2型膠原平均低于正常的軟骨細胞，且正常軟骨細胞在低氧培養(yǎng)48 h后，其2型膠原表達大大增加，同時正常軟骨細胞比HIF-1α基因敲除后的軟骨細胞表現(xiàn)出較高的增殖活性。膠原蛋白脯氨酰4-羥化酶（collagen prolyl 4-hydroxylase，C-P4H）是膠原維持螺旋穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，是膠原合成的關(guān)鍵步驟。HIF-1α能激活C-P4H的表達，促進膠原生成，從而維持軟骨細胞外基質(zhì)的穩(wěn)定。在無HIF-1α存在時軟骨細胞低氧下分泌糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）的量是常氧時的35%，而有HIF-1α存在時細胞低氧下產(chǎn)生GAG的量大大高于常氧[11]。由此可見HIF-1α對保持軟骨細胞的增殖活性及細胞外基質(zhì)的合成具有重要意義。

2.2 生物刺激相關(guān)通路

機械負荷及缺氧被認為是影響關(guān)節(jié)軟骨最持久的兩個因素。過度持久的機械壓力可直接損害關(guān)節(jié)軟骨的合成功能[12]，影響細胞間滑液交換，可誘發(fā)自由基產(chǎn)生。關(guān)節(jié)囊內(nèi)靜壓力可超過局部組織終末毛細血管的灌流壓，因而導(dǎo)致局部組織暫時性缺氧，反復(fù)持久的缺氧，則會引起代謝障礙。在低氧環(huán)境中，軟骨細胞通過腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）依賴途徑，降低組織的需氧量。啟動HIF-1α信號激活SOX-9上調(diào)細胞外基質(zhì)相關(guān)基因從而來提高組織功能[13]。在體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)過大機械刺激會使軟骨細胞中HIF-1α表達增高[14]。然而壓力負荷如何通過HIF-1α信號通路來調(diào)節(jié)的機制還未明了。可能是壓力負荷先造成細胞間氧分壓下降，HIF-1α降解被抑制，與HIF-1β結(jié)合成二聚體形成有活性的HIF-1，HIF-1與缺氧反應(yīng)元件結(jié)合，從而啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達，調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF)、SOX-9等的表達，進而參與髁突軟骨細胞的生存、增殖和能量代謝，細胞外基質(zhì)的分泌等活動。

在過去的幾年里，破譯軟骨內(nèi)缺氧信號通路的研究已取得較大進步，且也證實缺氧信號對軟骨細胞生理方面有重要影響，近年來發(fā)現(xiàn)HIF-1α在常氧環(huán)境下對軟骨細胞也有重要意義。軟骨細胞生長、分化和代謝受生長因子和細胞因子的調(diào)節(jié)。關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)的各種信號之間的平衡有利于保持軟骨的穩(wěn)定性，而當(dāng)該平衡被打破時，關(guān)節(jié)中的一些細胞如巨噬細胞、成纖維細胞及軟骨細胞等的分泌活性將發(fā)生變化。缺氧及IGF-1均能通過磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B （protein kinase B，Akt）/ 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（the mammalian target of Rapamycin，mTOR）和絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路來調(diào)節(jié)HIF-1α和VEGF的表達[15]。有研究[16]證實HIF-1α和Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（Notch ICD）之間可以發(fā)生直接作用，HIF-1α被募集到Notch ICD的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上，結(jié)合Notch相應(yīng)的啟動子來激活Notch靶基因，從而調(diào)控軟骨細胞增殖、分化，促進前肥大軟骨細胞向肥大軟骨細胞轉(zhuǎn)變，維持軟骨細胞表型，以及軟骨基質(zhì)代謝平衡[17]。

3 HIF-1α在髁突軟骨修復(fù)中的作用

由于軟骨組織缺乏血管，所以能量物質(zhì)只能通過組織滲透獲得，然而遠遠不能滿足軟骨組織發(fā)育和缺損修復(fù)所需，而血管侵入可為軟骨組織輸送大量的能量物質(zhì)，以滿足發(fā)育以及改建的需要。低氧是血管新生的刺激信號，在低氧條件下，生長板軟骨細胞HIF-1α基因被激活，從而可以誘導(dǎo)VEGF的表達，促進軟骨內(nèi)血管生成，調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)骨化。軟骨損傷導(dǎo)致組織水腫、缺氧，誘導(dǎo)HIF-1α生成，促進肥大層軟骨細胞表達VEGF，誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）降解胞外基質(zhì)，從而參與關(guān)節(jié)改建，且HIF-1α可在1 min內(nèi)上調(diào)VEGF到30倍以上。由此可見HIF-1α可能是通過上調(diào)VEGF等基因的轉(zhuǎn)錄表達來促進軟骨內(nèi)血管生成，從而調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)骨化和軟骨的改建。

有研究[18]顯示，在骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)，白細胞介素1、腫瘤壞死因子-α等致炎因子表達均異常增高，刺激MMP-13、前列腺素E2等炎性因子或酶類的表達，從而對軟骨及軟骨基質(zhì)造成嚴重損傷，而這些致炎因子和炎性因子均能直接或間接刺激HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性增強。HIF-1α激活后，可通過蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶（protein-serine-threonine kinase，AKT）途徑增強SOX-9等軟骨特異性基因表達[19]；同時可減少活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生、抑制c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）的活化及上調(diào)X連鎖凋亡抑制蛋白-2（X-linked inhibitor of apoptosis protein-2，X1AP-2）和B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）等抗凋亡蛋白表達的水平等途徑抑制軟骨細胞的凋亡，促進軟骨細胞存活[20]。雌激素受體β（estrogen receptor β，ERβ）可通過HIF-1α通路來抑制核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）的活化，從而減輕炎癥反應(yīng)[21]。

HIF-1α可影響Wnt信號活性再影響下游的骨保護素（osteoprotegerin，OPG）/骨保護素配體（osteoprotegerin ligand，OPGL）/ NF-κB 受體激活劑（receptor of activator of NF-κB，RANK）信號系統(tǒng)或Eph/ephrin來影響骨的形成與代謝[22]。TMJ盤前移位后，OPGL升高，髁突軟骨中破骨細胞有活躍的趨勢，機體通過自身反饋機制刺激OPG表達增高，競爭性結(jié)合或阻斷OPGL與RANK結(jié)合，抑制破骨細胞引起的軟骨吸收[23]。另一方面，HIF-1α可促進成骨和礦化[24]。

HIF-1α的表達被認為是內(nèi)源性保護機制的始動因子和共同途徑，大量研究表明應(yīng)力刺激、炎癥等狀態(tài)下時，HIF-1α能在缺氧的髁突軟骨組織內(nèi)聚集并被激活，通過誘導(dǎo)血管生成和調(diào)節(jié)能量代謝等途徑，增強軟骨細胞抵抗缺氧缺血損傷的能力，促進軟骨細胞增殖分化，進一步促進細胞基質(zhì)的合成，其蛋白多糖和2型膠原表達恢復(fù)，髁突的適應(yīng)性改建得以適應(yīng)新的功能需要。

4 展望

髁突軟骨是頜面部重要的生發(fā)中心，只有在協(xié)調(diào)有序的調(diào)控下，髁突軟骨細胞才能正常的增殖、分化和成熟。機械負荷及缺氧是影響關(guān)節(jié)軟骨最持久的因素。低氧微環(huán)境、機械應(yīng)力等的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在時空上形成調(diào)節(jié)系統(tǒng)控制軟骨組織的發(fā)生、改建、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及創(chuàng)傷修復(fù)等病理生理過程。對于體外研究髁突軟骨細胞，細胞從活體中取出時由原來的低氧環(huán)境到常氧環(huán)境，HIF-1α被降解，隨之HIF-1α信號通路被抑制，軟骨細胞的表型、增殖活性及基質(zhì)合成均受到影響，為后續(xù)軟骨細胞的研究帶來了極大困難。相信在未來的研究中，模擬體內(nèi)低氧環(huán)境是研究髁突軟骨細胞的趨勢。HIF-1α信號通路在髁突軟骨改建中具有重要意義，這為修復(fù)軟骨缺損維持組織完整性提供新的思路和治療靶點。

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（本文編輯 杜冰）

Research progress of mechanism of hypoxia-inducible factor-1α signaling pathway in condylar cartilage growth and remodeling

Xu Gaoli, Wu Lili, Wu Zhiwu, Gu Zhiyuan. (School of Stomatology, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81170979); Zhejiang Medical Science and Technology Plan Projects (2015KYB146). Correspondence: Gu Zhiyuan, E-mail: gzy@zju.edu.cn.

The condylar cartilage was adapted to hypoxic conditions in vivo. However, condylar cartilage cells exposed in normoxia in vitro affect the chondrocyte phenotype and cartilage matrix formation. This condition also resulted in great difficulty in chondrocyte research. Culturing chondrocyte should be simulated in in vivo hypoxia environment as much as possible. The hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) demonstrates an important transcription factor of adaptive response to hypoxic conditions. HIF-1α also plays an active role in maintaining homeostasis and function of chondrocytes. This review summarized current knowledge of the HIF-1α structure, signaling pathway, and mechanism of HIF-1α in the condylar cartilage repair.

hypoxia-inducible factor-1α; condylar cartilage; hypoxic; static pressure

Q 257

A

10.7518/hxkq.2016.06.017

2015-11-21；

2016-09-13

國家自然科學(xué)基金（81170979）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2015KYB146）

徐高麗，碩士，E-mail：852819264@qq.com

谷志遠，教授，博士，E-mail：gzy@zju.edu.cn