成鵬 葉聯(lián)華

650118昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院（云南省腫瘤醫(yī)院）胸外一科

agrC對表皮葡萄球菌生物膜形成作用機制的研究進展

成鵬 葉聯(lián)華

650118昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院（云南省腫瘤醫(yī)院）胸外一科

表皮葡萄球菌在醫(yī)用生物材料表面形成的生物膜可有效抵御抗生素的治療，導致感染遷延不愈，已成為近年來的研究熱點。影響生物膜形成的眾多基因構成了復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，在生物膜形成的不同階段發(fā)揮不同的作用，其中表皮葡萄球菌附屬基因調(diào)節(jié)子（agr）系統(tǒng)是調(diào)節(jié)生物膜形成的最重要基因之一。就細菌生物膜的形成過程、agr系統(tǒng)及其相關基因?qū)ι锬ば纬烧{(diào)控機制的研究現(xiàn)狀進行綜述，為研究以agr為靶點治療表皮葡萄球菌生物膜引發(fā)的相關感染提供參考。

表皮葡萄球菌； 細菌生物膜； agr； 基因調(diào)控機制

Fund program:National Natural Science Foundation of China(81260228,81460278);Natural Science Foundation of Yunnan Province(2013FZ276,2014FA048);Yunnan Provincial High-level Personnel Training Fund (2012HB032,D-201222)

0 引 言

隨著生物材料在臨床上的廣泛應用，生物膜引發(fā)的相關感染因易耐藥、易播散、易復發(fā)等特點受到越來越廣泛的關注[1-2]。表皮葡萄球菌是定居于人體皮膚和黏膜表面最常見的正常菌群。作為凝固酶陰性葡萄球菌，表皮葡萄球菌僅產(chǎn)生有限的蛋白酶及胞外毒素，但近年來其在生物材料植入物中已有較高的分離率[3]。研究表明，表皮葡萄球菌以靜脈導管、乳腺假體、氣管插管、人工關節(jié)等植入物為載體，通過細菌定植、細菌間黏附、分泌胞外基質(zhì)等途徑形成結(jié)構復雜的生物膜；表皮葡萄球菌的生物膜一旦形成，可有效適應機體微環(huán)境，并抵御抗生素的浸透，引起難治性細菌生物膜相關感染，并導致感染遷延不愈，甚至危及生命[1-4]。文獻報道，對植入材料進行表面涂層改性可抑制細菌生物膜的形成，降低臨床感染率，并能增加抗生素治療的敏感性[5-7]。

近年來，關于表皮葡萄球菌生物膜形成的研究發(fā)展迅速，本文就生物膜的形成過程及生物膜形成的相關調(diào)控基因進行綜述。

1 生物膜的形成

細菌生物膜的形成可分為4個階段：起始黏附、細菌間的吸附與增殖、生物被膜成熟及成熟生物膜細菌脫落[8-9]。細菌在暴露于生物材料表面的1～2 h內(nèi)即進入起始黏附階段，生物材料植入物表面有多種蛋白質(zhì)組件的表達，增加了細菌在其表面的黏附力。細菌通過疏水作用和特異性的表面結(jié)構如自溶素相關基因（atlE/aae）等貼覆到生物材料表面形成直接黏附，或通過細胞壁表面的黏附因子SdrG、纖維蛋白原結(jié)合蛋白（fibrinogen-binding protein，F(xiàn)bp）、細胞外基質(zhì)結(jié)合蛋白（extracellular matrix binding protein，Embp）等與血清蛋白相互作用間接黏附于生物材料表面，形成初始附著[9-11]。

其后是一個過渡態(tài)，即“中間生物膜狀態(tài)”，細菌間形成一個個小的細菌群落或稱“微克隆”。有學者將生物膜形成過程中由50個以上的細菌相互黏連的結(jié)構定義為“微克隆”，以此作為生物膜的組成單位。在多糖胞間黏附素（polysaccharide intercellular adhesin，PIA）、Embp、聚集相關蛋白（accumulationassociated protein，Aap）、生物膜相關蛋白（biofilmassociated protein，Bap）及其同源蛋白Bhp、磷壁酸（teichoic acids，TA）和胞外DNA（extracellular DNA, eDNA）等多種細菌表面物質(zhì)的參與下，開始細菌增殖過程。此階段通常起始于細菌暴露后6 h左右，黏附于生物材料表面的細菌通過分裂、聚集增加生物膜厚度，并分泌細胞外基質(zhì)將細菌包裹在內(nèi)，同時形成通道與空隙供細菌進行物質(zhì)代謝與信息交流，細菌生物膜初步形成[9-14]。

關于如何界定成熟生物膜的建立尚無統(tǒng)一共識，有學者以抵御抗生素的能力來衡量，亦有根據(jù)生物膜厚度來衡量。隨著微克隆群體的增多，通過PIA、Aap、Bap/Bhp等的介導，細菌群落相互聚集，生物膜的厚度逐漸增加。其中，Aap可通過自身結(jié)構域的構象變化產(chǎn)生同源二聚化，促進細菌間的相互聚集；PIA是促進生物膜形成的主要成分之一，其主要依賴胞間黏附素（intercelluar adhesion,ica）操縱子icaADBC編碼的產(chǎn)物IcaA合成，該產(chǎn)物具有N-乙酰葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（N-acetylglucosamine transferase）活性。體外實驗中，24 h即可產(chǎn)生厚度較為穩(wěn)定的成熟生物膜[12-15]。

成熟生物膜由多層細胞組成，細胞層中有許多細胞團塊形成的中央較為密集、外周相對稀疏的結(jié)構。細胞團塊間有基質(zhì)，并被網(wǎng)狀管道所分隔。中央?yún)^(qū)代謝產(chǎn)物相對較多，而通過管道系統(tǒng)得到的營養(yǎng)較少，相對缺氧的局部環(huán)境勢必對內(nèi)層細菌的生長產(chǎn)生一定的影響。生長在不同層次的細菌因?qū)ρ趵玫牟町愋允沟么x方式也發(fā)生相應變化，如在缺氧環(huán)境下，內(nèi)層的細菌可通過下調(diào)DNA復制、減少蛋白表達等方式適應周圍環(huán)境。成熟的生物膜還可通過表型轉(zhuǎn)化PIA陰性形成邊緣規(guī)整、結(jié)構緊致的生物膜來增強適應性[13-16]。

成熟的細菌生物膜達到一定程度后，由于細菌代謝及營養(yǎng)物質(zhì)的消耗部分細胞會出現(xiàn)脫落，通過血流轉(zhuǎn)移到其他部位，造成感染的擴散。細菌通過產(chǎn)生蛋白酶以降解生物膜表面的多聚物，并產(chǎn)生小分子肽酚可溶性調(diào)控蛋白（phenol-soluble modulins, PSMs）促進細胞的脫離和播散。體外實驗中，48 h即可見部分生物膜開始固縮、崩解[8-10]。

以上4個階段并非相互獨立、界限分明，而是在整個過程中彼此重疊，成熟生物膜部分細菌脫落后在其他器官再次定植，重復上述過程，又形成新的細菌生物膜。

2 表皮葡萄球菌附屬基因調(diào)節(jié)子的調(diào)控

附屬基因調(diào)節(jié)子（accessorygeneregulator,agr）是雙組分信號傳導系統(tǒng)（two-component signal transduction systems,TCSs）的一員。TCSs包含組氨酸激酶（histidine kinase,HK）域和反應調(diào)節(jié)蛋白（response regulator,RR）結(jié)合域兩部分，其中 HK含有HATPase_c和HisKA兩個功能域。外界信號分子首先作用于HK的膜外配體結(jié)合區(qū)，激活激酶的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）結(jié)合部位，而HATPase_c功能域具有ATP酶活性，可水解ATP提供能量，并轉(zhuǎn)移磷酸基團至激酶HisKA功能域的組氨酸位點，使其發(fā)生自身磷酸化。隨后，RR調(diào)控區(qū)域與磷酸化的HK相互作用，磷酸基團又再次轉(zhuǎn)移至自身天冬氨酸位點上，發(fā)生自身磷酸化，并激活效應區(qū)，引起構像改變，使得DNA結(jié)合位點暴露，從而結(jié)合不同DNA序列產(chǎn)生一系列調(diào)控反應[17-18]。

agr系統(tǒng)由約3.5 kb的一段序列編碼，該序列包含RNAⅡ和RNAⅢ兩個相對獨立的轉(zhuǎn)錄單位，分別由啟動子P2和P3啟動。P2啟動RNAⅡ轉(zhuǎn)錄，RNAⅡ包括agrA、agrB、agrC和agrD 4個開放閱讀框。其中agrA含238個氨基酸殘基，是表皮葡萄球菌二元系統(tǒng)中的反應調(diào)節(jié)因子，編碼RR；agrB由4個疏水的跨膜區(qū)和2個富含正電荷氨基酸殘基的親水性跨膜區(qū)組成，具有蛋白酶活性；agrC含429個氨基酸殘基，具有6或7次跨膜區(qū)段和1個HK結(jié)構域，是表皮葡萄球菌二元系統(tǒng)中的信號轉(zhuǎn)導因子[19-20]；agrD是agr系統(tǒng)自誘導肽（autoinducing peptide,AIP）的前體物質(zhì)，其經(jīng)agrB特異性識別后，再經(jīng)2個蛋白酶裂解和1個硫內(nèi)酯形成的過程加工為成熟的自誘導信號分子AIP，并被運輸至胞外。AIP大多含5～17個氨基酸殘基，序列中的半胱氨酸和C末端氨基酸之間形成硫酯鍵，成為一個包含硫解內(nèi)酯的環(huán)狀結(jié)構[21]。當菌落密度較低時，AIP濃度也較低；當菌體到達一定的密度，胞外釋放的AIP積累達到閾值濃度，便能與跨膜蛋白agrC的疏水基相作用，從而激活agrC蛋白激酶胞內(nèi)域部分的活性，通過磷酸基轉(zhuǎn)移形成磷酸化agrA，后者可與位于P2、P3基因間隔區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白葡萄球菌輔助調(diào)節(jié)子A（Staphylococcal accessory regulator A,SarA）結(jié)合，激活P2、P3啟動子從而形成一個RNAⅡ的反饋循環(huán)和RNAⅢ的轉(zhuǎn)錄。因此，agrC和agrA構成了表皮葡萄球菌毒力信號的二元組分調(diào)節(jié)[20-24]。RNAⅢ包含514個核苷，其中含有1個小的開放讀碼框，具有14個發(fā)卡結(jié)構和3個螺旋結(jié)構。RNAⅢ可分為5'端結(jié)構域（1～31 nt）、中央結(jié)構域（32～382 nt）和3'端結(jié)構域（383～514 nt）。5'端的環(huán)狀結(jié)構能幫助維持RNAⅢ的穩(wěn)定性并具有正向調(diào)控δ-溶血素翻譯的作用；中央結(jié)構域通過構象變化幫助受體蛋白結(jié)合；3'端結(jié)構域可調(diào)控多種蛋白的分泌表達，已發(fā)現(xiàn)其可抑制蛋白A的合成。RNAⅢ是hld基因的調(diào)節(jié)RNA和信使RNA，能編碼δ-毒素等，并能調(diào)控多種胞外蛋白及菌體表面蛋白的表達，如腸毒素、溶血素等多種毒素的分泌[24-25]。RNAⅢ的轉(zhuǎn)錄是通過agrA或SarA結(jié)合到P3啟動子上而被誘導的[20-24]。

AIP通過被HK受體agrC識別來實現(xiàn)對表皮葡萄球菌毒力的調(diào)節(jié)。一些AIP可促進毒力基因的表達，而另一些卻有抑制作用。不同種屬的葡萄球菌分泌的AIP對agr系統(tǒng)存在交叉抑制現(xiàn)象，由一種葡萄球菌生成的AIP能抑制另一種葡萄球菌agr調(diào)節(jié)系統(tǒng)的表達[24-25]。目前仍未能明確AIP是如何調(diào)節(jié)agrC作用的，有研究表明，agrC功能的發(fā)揮需要一個富含陰離子脂質(zhì)的膜。HK受體agrC的激活或抑制是通過構象變化實現(xiàn)的，agrC激酶域和感應結(jié)構域由一個具有螺旋構象的結(jié)構相連接，該結(jié)構以類似變阻器的作用控制激酶活性。激動劑和拮抗劑在此螺旋結(jié)構上以相反的方向旋轉(zhuǎn)，產(chǎn)生不同的效應[24-27]。體外研究表明，agr基因可通過下調(diào)atlE、酪蛋白裂解酶P（caseinolytic protease P,clpP）的表達抑制生物膜的形成，并通過調(diào)節(jié)D-丙氨酸：D-丙氨酸連接酶（D-alanine:D-alanine ligase）來影響細菌細胞壁的合成。在生物膜成熟后，agrC又可促進PSMs的產(chǎn)生使細菌從成熟的生物被膜中分離開來，發(fā)生遠處播散，引起其他器官的感染或?qū)е赂腥具w延不愈[27-28]。

3 對agr系統(tǒng)有調(diào)控功能的基因

在對金黃色葡萄球菌的研究中發(fā)現(xiàn)，RNAⅢ激活蛋白的靶蛋白（target of RNAⅢ-activating protein, TRAP）是活化agr系統(tǒng)的一個重要通路蛋白。TRAP是葡萄球菌生物膜形成相關蛋白，包含167個氨基酸殘基，是一段高度保守的序列。磷酸化的TRAP可被RNAⅢ激活蛋白（RNAⅢ-activiating protein, RAP）識別，調(diào)節(jié)RNAⅢ的轉(zhuǎn)錄并分泌毒素。RAP是葡萄球菌分泌到細胞外的33 ku的自誘導因子，通過調(diào)節(jié)TRAP的3個保守組氨酸殘基的磷酸化從而激活agrC系統(tǒng)。TRAP蛋白與RAP蛋白的結(jié)合位點可能在TRAP蛋白氨基酸序列的Ser-75和Thr-76。當trap基因插入失活突變或磷酸化被抑制時，細菌不能形成生物膜，亦不能產(chǎn)生毒素，喪失了致病性，且相應毒力因子及其調(diào)節(jié)子的轉(zhuǎn)錄也有所下降。TRAP蛋白還可通過自身修復避免DNA的氧化損傷，利用細菌雙雜交系統(tǒng)研究蛋白間相互作用發(fā)現(xiàn)，OpuCA是TRAP的結(jié)合蛋白[28-29]。對trap基因和RNAⅢ轉(zhuǎn)錄水平的檢測結(jié)果表明，RNAⅢ的轉(zhuǎn)錄水平隨細菌生長變化而增加，而trap基因的轉(zhuǎn)錄水平則保持不變，提示trap基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯與細菌生物膜的形成不存在直接的調(diào)控相關性，TRAP蛋白可能不是表皮葡萄球菌agr系統(tǒng)活化所必需的細菌產(chǎn)物[30-31]。

SarA是一種全局轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，控制細胞中許多與毒性相關的基因表達，能直接調(diào)節(jié)多種毒力因子的產(chǎn)生[32]。SarA由124個氨基酸殘基組成，以形成二聚體的方式與靶點相結(jié)合，通過以下機制調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程：改變靶基因構象，幫助調(diào)節(jié)蛋白接觸；多個SarA二聚體間構成DNA的封閉狀態(tài)，不利于轉(zhuǎn)錄的發(fā)生；形成異源二聚體，干擾同源二聚體的功能；同源蛋白的競爭性替代。SarA可通過激活agr調(diào)控系統(tǒng)中P2和P3啟動子區(qū)域，增加RNAⅢ的轉(zhuǎn)錄水平而發(fā)揮效應，也可獨立于agr系統(tǒng)發(fā)揮作用。SarA與其上游一段富含AT的序列相結(jié)合從而在轉(zhuǎn)錄水平直接調(diào)控atlE、ica、脂肪酶基因（lipA）、膜相關鋅金屬蛋白酶基因（zinC）等基因的表達；或結(jié)合到agr、SarS、毒素阻抑基因（Rot）、纖粘連結(jié)合蛋白（FnBP）、葡萄球菌蛋白A（Spa）、Bap和IcaRA等調(diào)節(jié)基因和目標基因上影響其轉(zhuǎn)錄。SarA對atlE的表達起負調(diào)控作用，而對ica、lipA和zinC的表達則起正調(diào)控作用。SarA的表達可促進細菌生物膜的形成，SarA突變不僅能限制細菌生物膜的形成，還能在體內(nèi)外增加抗生素的敏感性。SarA突變能使胞外核酸酶（extracellular nuclease）表達上調(diào)，但對剝脫毒素A（exfoliativetoxin A，ETA）和剝脫毒素B（ETB）的表達卻有下調(diào)作用。通過SarA直接或間接控制表達的基因多達120余個[32-33]。

4 生物膜形成相關的其他基因

ica是編碼PIA的基因，該基因組中包括主要編碼細胞膜上尿苷二磷酸（UDP）-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶的icaA和icaD、形成細胞表面蛋白并運輸至胞外的icaC及編碼脫乙酰酶的icaB。icaDCBA在細菌生物膜的形成過程中起了重要作用，調(diào)節(jié)PIA相關的細菌黏附、增殖以及免疫逃逸；介導對中性粒細胞殺傷作用的逃逸，提高表皮葡萄球菌的耐藥性[34]。同時icaDCBA也受多方面的調(diào)節(jié)，SarA、SarZ、arlR/S等因子可以icaDCBA作為下游功能基因，通過直接調(diào)節(jié)icaDCBA的轉(zhuǎn)錄對生物膜的形成起正調(diào)控作用。icaR位于ica操縱子上游，可編碼對icaDCBA有負調(diào)控作用的IcaR蛋白。SarX可通過下調(diào)IcaR蛋白的表達間接激活icaDCBA從而促進表皮葡萄球菌生物膜的形成。icaA基因單獨表達僅能誘導N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶的低水平表達，而icaA與icaD基因的協(xié)同表達則可大大增強酶的活性，促進細菌生物膜的形成[34-36]。

eDNA是一種獨立于細胞外的DNA，廣泛存在于體液中。細菌生物膜可通過菌膜中菌體的裂解、釋放含有DNA的小囊泡和活細胞主動分泌等方式向胞外輸送DNA。eDNA能在細菌生物膜形成的起始黏附階段促進菌體間的黏附，在細菌培養(yǎng)液中加入DNA酶破壞eDNA，細菌的黏附顯著減少，而加入RNA酶并無類似作用。eDNA在生物膜形成后繼續(xù)維持其結(jié)構的穩(wěn)定性，促進單個菌體連接至細菌群落，并阻止細菌從菌落上被沖刷下來。生物膜基質(zhì)中的eDNA可被周圍活菌利用菌體表面非特異性的DNA結(jié)合受體攝入胞內(nèi)，其中一條鏈被核酸酶降解，另一條鏈通過DNA異位復合體進入胞質(zhì)。eDNA還可通過RecA介導的同源重組過程插入受體菌染色體DNA中，若攝取的eDNA與受體菌有同源性區(qū)域，eDNA便可整合入受體菌的染色體中；若攝取的eDNA為異源性，則可作為碳基與能量的來源，為生物膜形成提供營養(yǎng)[37-38]。eDNA受多個基因的調(diào)節(jié)，cid編碼一種能在細胞表面打孔的物質(zhì)，lrg則編碼一種具有抗打孔作用的物質(zhì)，兩者相互平衡，調(diào)節(jié)胞壁質(zhì)水解酶的活性，控制細菌的程序性死亡和溶解。cid高表達，lrg低表達則促進細胞死亡、溶解，釋放eDNA。體外研究表明，cid/lrg維持在一定水平的平衡有利于細菌生物膜的形成。Alt操縱子可通過編碼合成胞壁質(zhì)水解酶，降解菌體細胞壁，促進細胞自溶釋放eDNA。此外，SAERs雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)也通過影響DNA的釋放和Aap表達調(diào)節(jié)生物膜的形成過程[37，39]。

此外，細菌生物膜的形成還受arlR/S雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)調(diào)節(jié)。arlS基因可調(diào)控細菌生物被膜的形成、菌細胞自溶以及胞外細菌裂解酶的活性，也可通過降低RNAⅡ轉(zhuǎn)錄，在一定程度上降低RNAⅢ的轉(zhuǎn)錄。arlR/S可能主要依賴對icaDCBA基因的調(diào)控實現(xiàn)對表皮葡萄球菌生物膜的作用，這一點與金黃色葡萄球菌不同。凝膠遷移實驗結(jié)果證實，arlR可以結(jié)合到ica的啟動子區(qū)域[40]。

5 問題與展望

agr系統(tǒng)是近年來的研究熱點，agr系統(tǒng)激活后可通過抑制起始黏附、細菌增殖并促進細菌脫離的機制減少生物膜的形成。這樣的結(jié)果一方面增強了抗生素的治療效果，另一方面可能導致感染的遠處播散。通過特異性結(jié)合的多肽類物質(zhì)抑制agr群體感應系統(tǒng)的激活可有效減少毒力因子的分泌，但對某些應用體內(nèi)植入裝置的患者可能會促進生物膜的形成，增強耐藥性。

在細菌生物膜形成的早期，外源性的AIP類物質(zhì)可與表皮葡萄球菌的AI-2受體競爭性結(jié)合，激活或阻斷agr群體感應系統(tǒng)，從而影響細菌生物膜的形成并調(diào)控毒力因子的產(chǎn)生；而當成熟細菌生物膜形成以后，其高度組織化的多細胞群體結(jié)構使外源性agr信號分子難以滲透，無法被細菌表面的感應部位識別。因此，外源性的AIP類藥物的作用可能僅在感染早期有效。

生物膜形成及毒力因子的分泌機制十分復雜，在不同的環(huán)境下某些基因的作用可能完全不同，如icaR在氧分充足的情況下能上調(diào)生物膜形成，而在缺氧情況下卻起抑制作用；在不同菌株間也存在差異，如arlR/S可能主要依賴對icaDCBA基因的調(diào)控實現(xiàn)對表皮葡萄球菌生物膜的作用，而在金黃色葡萄球菌中則可能是通過Sigma B途徑來實現(xiàn)的[40]。

總之，表皮葡萄球菌生物膜的調(diào)節(jié)機制十分復雜，各調(diào)節(jié)系統(tǒng)間既相互聯(lián)系又彼此制約，如何利用各系統(tǒng)間的相互作用抑制生物膜的形成，治療生物材料植入感染仍需進一步研究。

利益沖突 無

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Research progress of forming mechanism of agrC on Staphylococcus epidermidis biofilm

Chen Peng,Ye Lianhua

Department of Thoracic Surgery,the 3rd Affiliated Hospital of Kunming Medical University(Tumor Hospital of Yunnan Province),Kunming 650118,China

Ye Lianhua,Email:lhye1204@aliyun.com

The formation of Staphylococcus epidermidis biofilm on the surface of medical biomaterials may resist the antibiotics treatment and cause chronic infection,which has become a research focus in recent years. Multiple genes constitute complex regulatory network which affect the biofilm formation,and play different roles in the different stages of biofilm formation.Accessory gene regulator(agr)is one of the most important genes in the process of biofilm formation.The process of bacterial biofilm formation,research status of regulation mechanism of agr system and its related genes in the formation of biofilm are reviewed,to provide reference of using agr as a target for the treatment of staphylococcus epidermidis biofilm related infections.

Staphylococcus epidermidis; Bacterial biofilm; Accessory gene regulator; Gene regulation mechanism

葉聯(lián)華，Email:lhye1204@aliyun.com

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．04．009

國家自然科學基金（81260228，81460278）；云南省自然科學基金（2013FZ276，2014FA048）；云南省高層次人才培養(yǎng)基金（2012HB032，D-201222）

2016-05-22）