O 李 陽(yáng)

（遼寧石油化工大學(xué) 遼寧 113000）

宏基因組技術(shù)在環(huán)境保護(hù)及污染改善中的應(yīng)用

O 李 陽(yáng)

（遼寧石油化工大學(xué) 遼寧 113000）

宏基因組學(xué)是現(xiàn)代微生物生態(tài)學(xué)研究中分子生物學(xué)技術(shù)的一個(gè)新理論，它以環(huán)境中沒(méi)有培養(yǎng)的微生物為研究媒介，通過(guò)獲取環(huán)境中全部微生物的DNA，形成宏基因組的庫(kù)，利用基因組學(xué)的研究方法分析環(huán)境中全部微生物的遺傳分組和他們各自群落的功能。自1999年以來(lái)，這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)在很多領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，如，工業(yè)、醫(yī)療、農(nóng)業(yè)等。本文將從宏基因組的基本理論，現(xiàn)階段的研究方法，以及潛在的問(wèn)題這幾個(gè)方面為基礎(chǔ)并提出解決問(wèn)題的方法，解析它在環(huán)境保護(hù)及污染改善中的應(yīng)用。該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用對(duì)于環(huán)境中微生物的變化有很大的幫助，而且為環(huán)境中的各項(xiàng)指標(biāo)和改善提供理論依據(jù)。

宏基因組技術(shù)；環(huán)境保護(hù)；污染改善

由于微生物學(xué)和現(xiàn)代生命科學(xué)都在不停的進(jìn)步與發(fā)展，所以衍生出一門(mén)新型的科學(xué)技術(shù)，即宏基因組學(xué)，它的出現(xiàn)也越來(lái)越受到研究者的重視。因?yàn)楹昊蚪M技術(shù)可以利用環(huán)境中現(xiàn)成的樣品資源而無(wú)需預(yù)先培養(yǎng)就可以獲得新的活的物質(zhì)基因，從而避免了各種細(xì)菌的干擾。它的這種能直接從自然環(huán)境中提取所需要的信息的能力，大大的提高了微生物資源的利用率，所以成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的重點(diǎn)，并且已經(jīng)應(yīng)用在各個(gè)生態(tài)環(huán)境中?；蛟S該項(xiàng)技術(shù)還可以發(fā)現(xiàn)新基因和物種，為環(huán)境保護(hù)和治理環(huán)境污染帶來(lái)更大的突破。本文將從宏基因組技術(shù)的本質(zhì)，核心技術(shù)以及環(huán)境保護(hù)和污染改善幾個(gè)方面來(lái)展開(kāi)討論。

一、宏基因技術(shù)的本質(zhì)

宏基因組的基本概念是有美國(guó)威斯康星大學(xué)的Handdelsman教授于1998年提出的，它的最初意愿是用來(lái)定義土壤細(xì)菌的混合基因組，后來(lái)發(fā)展成為環(huán)境中所有的微小生物的遺傳物質(zhì)的總和，而且特指環(huán)境中的真菌和細(xì)菌的基因組的全部組合。它的研究方法是不需要通過(guò)其他途徑而是直接從環(huán)境中獲取環(huán)境中的DNA，經(jīng)過(guò)一定的處理，將它分配到合適的載體上，轉(zhuǎn)化成我們需要的一種菌，進(jìn)而形成一個(gè)全新的DNA庫(kù)。通過(guò)各種分析、檢測(cè)基因的方法提取目的基因。所以宏基因組技術(shù)包含環(huán)境中的樣品DNA的篩選，提煉，載體和基因組文庫(kù)的挑選等多方面的影響因素，這些步驟的成功與否對(duì)宏基因組技術(shù)的成敗都起著決定性的作用。

1.環(huán)境樣本中DNA的提煉

在環(huán)境樣品中混雜著各種基因，從中獲取高質(zhì)量的樣本DNA是宏基因組技術(shù)的一個(gè)重要的步驟。在自然的大環(huán)境中存在著各種各樣的物質(zhì)，包括顆粒、粉塵、微生物等，其實(shí)微生物在其中的比率是很小的，而且細(xì)胞是附著在顆?；蚍蹓m的表面上的，所以要想完整地提煉出樣品中的DNA是很困難的。

但是為了充分利用宏基因組技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，研究者們還是迎難而上，最終還是發(fā)現(xiàn)了兩種比較有用的提煉方法。一種是原位裂解法，即將樣品經(jīng)過(guò)聲波處理或是機(jī)器處理粉碎后，然后放在裂解緩沖液中，最后再進(jìn)行提煉。這種方法的操作不復(fù)雜，樣品的提煉效率也比較高，但是人為的處理后，DNA的片段就會(huì)變得不緊簇，影響文庫(kù)的建立。另一種是異位裂解法，即先將微生物從環(huán)境中分離開(kāi)來(lái)，再用比較柔和的方法提取樣品DNA。該方法主要應(yīng)用于提煉片段比較大的DNA，但是這樣方法的操作比較復(fù)雜，提煉的成本也相比前者高，而且在微生物的分離過(guò)程中還會(huì)損失一部分微生物細(xì)胞，柔和提煉DNA的方法會(huì)使一部分微生物的DNA提取不到，這樣會(huì)造成DNA的大量浪費(fèi)。

2.載體的挑選

載體在宏基因組技術(shù)中起著一種媒介的作用，它的地位自然是不言而喻了，因?yàn)榛蚪M進(jìn)入宿主細(xì)胞需要載體的傳送，合適的載體直接影響基因組的傳送效率。質(zhì)粒、福斯黏粒、細(xì)菌人工染色體等都是比較常用的載體。挑選載體時(shí)需要考慮目的基因的長(zhǎng)度，是否有利于目的基因的增長(zhǎng)，以及在挑選過(guò)程中的細(xì)胞量的控制等。如，對(duì)于小于10kb的基因選擇質(zhì)粒載體比較合適，而對(duì)于DNA片段比較大的基因則采用Cosmid、BAC、PI等載體。但是這兩種載體各有利弊，所以在研究中需要視具體而定，并且試著尋找新的更適合的載體。

3.宿主菌的挑選

宿主菌是目的基因承接上載體后的產(chǎn)物，宿主菌的挑選決定著重組基因克隆或表達(dá)的效率，在挑選宿主菌時(shí)需要將重組后的細(xì)胞的表達(dá)效果以及轉(zhuǎn)化率作為參考因素。

目前，大腸桿菌作為宿主菌是比較常見(jiàn)的，因?yàn)樗倪z傳特性比較明顯，生命周期特性健康，而且處理它所需的器材也比較成熟，但是有些真菌細(xì)胞不能在其中很好的表達(dá)，還有可能新生出有毒有害的物質(zhì)，抑制微生物的正常生長(zhǎng)。于是又發(fā)現(xiàn)了比較理想的宿主菌—鏈霉菌，已經(jīng)有好幾個(gè)國(guó)家取得了成功，同時(shí)也提高了宿主菌的生命周期。

4.宏基因組文庫(kù)的挑選

宏基因組文庫(kù)是各種基因的組合，從中可以發(fā)現(xiàn)新生的物質(zhì)基因。自然環(huán)境中的微生物的種類比較復(fù)雜，數(shù)量和種類也比較多，所以挑選基因組文庫(kù)是一個(gè)重工程。

目前比較常用的挑選方法有：功能推動(dòng)挑選：根據(jù)重組基因的某一個(gè)或某些特定功能，獲取與之對(duì)應(yīng)的克隆基因。如，根據(jù)裂解酶、淀粉酶、抗生素等基因的變現(xiàn)形狀不同來(lái)挑選。但是由于檢測(cè)的方法有限且和宿主菌的表達(dá)有關(guān)，因此挑選的效率低下。序列推動(dòng)挑選：根據(jù)序列相似性的特點(diǎn)，利用PCR增加基因序列或通過(guò)雜交來(lái)挑選所需要的克隆基因，Sargasso海域的宏基因組技術(shù)的研究比較成熟，已經(jīng)在10億對(duì)序列中有很大的突破。這種方法相比功能挑選的優(yōu)勢(shì)是對(duì)宿主菌的依賴稍小，挑選效率也相對(duì)提高，但是必須對(duì)序列的特性非常了解，也很難發(fā)現(xiàn)新的序列。化合物結(jié)構(gòu)挑選：依據(jù)的是物質(zhì)結(jié)構(gòu)的不同所呈現(xiàn)的色譜峰值也不同，根據(jù)比較轉(zhuǎn)入前后宿主細(xì)胞提取物的色譜圖，挑選出所需要的克隆基因，這種方法可以很容易的挑選出新生的物質(zhì)，但是不一定是有生命力的，而且消費(fèi)很高，需要大量的挑選。底物驅(qū)使基因表達(dá)挑選：該方法用于挑選基因接受底物觸發(fā)或者酶觸發(fā)的目標(biāo)基因。該方法比較靈活，節(jié)省時(shí)間，但是對(duì)器材的要求很高，并且出現(xiàn)被誤檢測(cè)的錯(cuò)誤幾率也相對(duì)較高。

上面這幾種挑選方法各有利弊，在宏基因組文庫(kù)的挑選時(shí)應(yīng)當(dāng)分析應(yīng)用場(chǎng)合和各種挑選方法的特點(diǎn)，選擇合適的挑選方法來(lái)達(dá)到最優(yōu)的挑選結(jié)果。

二、宏基因組技術(shù)在環(huán)境污染改善中的應(yīng)用

生物修復(fù)是最近發(fā)展起來(lái)的一個(gè)熱詞，它是利用各種微生物或者是植物以及自由酶的新陳代謝過(guò)程，來(lái)改善環(huán)境中的污染，不要消費(fèi)額外的資源，只需要給這些微生物或是植物創(chuàng)造一些有利的條件，如，保證充足的空氣和空氣的流通，供給所需的養(yǎng)分，加入一些菌種來(lái)促進(jìn)生物自身分解有毒有害物質(zhì)的能力，去除環(huán)境的污染物，從而達(dá)到保護(hù)環(huán)境的目的。

1.發(fā)現(xiàn)降解基因

研究者發(fā)現(xiàn)，自然環(huán)境中的微生物的數(shù)量是相當(dāng)有限的，如果單純的依賴這些微量的微生物是很難有重大突破的。因?yàn)楹昊蚪M學(xué)可以從環(huán)境中提取所需的克隆基因而且可以合成我們想要的基因，這對(duì)創(chuàng)造新的基因是一個(gè)很好的突破。我們可以利用宏基因組技術(shù)大量的挑選出能夠降解污染物的基因并大量培養(yǎng)，來(lái)降低環(huán)境污染改善的成本。

如今，自然界已經(jīng)嚴(yán)重污染，森林的濫砍亂伐，水土流失，湖泊干涸，水質(zhì)污染，空氣質(zhì)量變差，空氣中的有毒有害物質(zhì)增多，嚴(yán)重的影響了人們的身體健康。因此治理環(huán)境污染迫在眉睫，但是這些地方的環(huán)境溫度和微生物的生存溫度存在很大的差異，起不到降解的作用，因此需要利用宏基因組技術(shù)挑選出能在較低溫度下生存的微生物，目前研究者已經(jīng)利用宏基因組技術(shù)挑選出的所需的基因并合成了其他可降解污染物的基因簇，并已經(jīng)應(yīng)用在工業(yè)廢水的處理中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以降解塑料，有毒農(nóng)藥，石油等的微生物。今后將會(huì)利用紅基因組技術(shù)發(fā)現(xiàn)更多的可降解菌，應(yīng)用于更多的環(huán)境污染治理中，讓環(huán)境保護(hù)提升一大步。

2.剖析微生物種群多樣性

微生物的種群多樣性是受環(huán)境影響的，環(huán)境的變化會(huì)使微生物產(chǎn)生相應(yīng)的變化，以此來(lái)適應(yīng)環(huán)境，因此剖析微生物種群的多樣性對(duì)治理環(huán)境污染也是很有幫助的。所謂適者生存，大自然的改變必然帶來(lái)自然界所有生物的改變，只有順應(yīng)自然發(fā)展才能長(zhǎng)久生存。所以環(huán)境會(huì)迫使微生物的群落發(fā)生改變，因此只有清楚的了解微生物種群和自然環(huán)境的關(guān)系，才能更準(zhǔn)確的分析影響環(huán)境的各種指標(biāo)，為保護(hù)環(huán)境提出更有效的防護(hù)措施，對(duì)污染改善的治理提供針對(duì)性的方法。

三、展望

Whitman等研究人員通過(guò)對(duì)土壤、海洋、地表等地方的微生物檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，自然環(huán)境中所包含的不同物種的基因的總量是非常大的，足以滿足宏基因組技術(shù)的要求，有了這個(gè)前提條件，宏基因組技術(shù)自然會(huì)不斷發(fā)展與進(jìn)步的。通過(guò)該項(xiàng)技術(shù)挑選可降解的基因，并合成適合其他環(huán)境的新型的菌落，這些菌落可以應(yīng)用于處于各種污染，通過(guò)這些菌落的自然降解方法能夠節(jié)省大量的人力物力，并能夠提高環(huán)境的恢復(fù)能力，給自然帶來(lái)更小的損害。雖然應(yīng)用前景可觀，但是任然存在一些需要克服的困難，如挑選緊簇的、高質(zhì)量的DNA和宿主菌直接影響整個(gè)技術(shù)的進(jìn)展程度，還有基因組文庫(kù)的建立也是一個(gè)重大的工程，因?yàn)楹昊蚪M技術(shù)需要大量提取環(huán)境中的DAN，不僅僅需要大量的人力物力，也需要一個(gè)良好的工作環(huán)境，并且需要結(jié)合其他技術(shù)來(lái)更好的管理宏基因組文庫(kù)。將生物學(xué)，計(jì)算機(jī)信息學(xué)，環(huán)境學(xué)等學(xué)科聯(lián)系起來(lái)，讓宏基因組技術(shù)在環(huán)境保護(hù)和污染改善中發(fā)揮更有效的作用。

四、總結(jié)

大自然是人類賴以生存的環(huán)境，人類的生存、健康依賴于良好的自然環(huán)境，社會(huì)的發(fā)展與進(jìn)步也依賴于良好的自然環(huán)境，因此保護(hù)環(huán)境是每個(gè)人的職責(zé)，加強(qiáng)污染治理更是迫在眉睫的問(wèn)題。雖然人們一直在為改善環(huán)境不斷努力，但是一直沒(méi)有突破，如今宏基因組技術(shù)的出現(xiàn)以及不斷成熟必將改善環(huán)境污染的治理問(wèn)題，為環(huán)境保護(hù)帶來(lái)新一層的突破。

Application of Metagenome Technology in Environment Protection and Pollution Improvement

Li Yang
(Liaoning University of Petroleum and Chemical Technology, Liaoning, 113000)

Metagenomics is a new theory of molecular biological technique in modern microbial ecology research, and it takes the microorganism which does not exist in environment as the study media, and by access to the DNA of all microorganisms in the environment to form the metagenomic library, besides,using the research methods of genomics to analyze the genetic group and the function of their respective communities of all microorganisms in the environment.Since 1999, the technology already has wide application in many fields, such as, industry, medical treatment, agriculture, etc. This article will put forward the measures on the basis of the basic theory of metagenomics, the present stage of research methods, as well as the potential problem such several aspects, and analyze its application in environment protection and pollution improvement.The application of the technology has a lot of help for changes of microorganism in environment, further more it provids theoretical basis for various indicators and improvement of environment.

metagenome technology；environment protection；pollution improvement

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李陽(yáng)（1989～），女，遼寧石油化工大學(xué)，研究方向：環(huán)境工程專業(yè)。