劉 娟， 王 剛*， 張明磊， 姜興林， 郭明珠， 陳 光

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,吉林 長春 130118；2.長春職業(yè)技術(shù)學(xué)院 信息分院，吉林 長春 130118)

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D-乳酸產(chǎn)生菌的研究進(jìn)展

劉 娟1， 王 剛1*， 張明磊1， 姜興林1， 郭明珠2， 陳 光1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,吉林 長春 130118；2.長春職業(yè)技術(shù)學(xué)院 信息分院，吉林 長春 130118)

D-乳酸作為一種重要的工業(yè)有機(jī)酸，是許多手性物質(zhì)的中間體，特別是高光學(xué)純度D-乳酸因其可以提高聚乳酸材料的性能而廣泛應(yīng)用。微生物發(fā)酵法是目前D-乳酸的主要生產(chǎn)方法，而菌種在發(fā)酵生產(chǎn)中占有非常重要的地位，是決定整個(gè)生產(chǎn)過程的關(guān)鍵。就近幾十年來產(chǎn)D-乳酸常用菌株、菌種進(jìn)化、研究方法、存在問題及前景做一綜述。

D-乳酸; 乳酸菌; 乳酸脫氫酶

乳酸又名α-羥基丙酸、2-羥基丙酸、丙醇酸，分為L-乳酸、D-乳酸，在食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、醫(yī)藥、飼料、日用品、化工等領(lǐng)域具有廣泛的用途。近年來，D-乳酸作為許多手性物質(zhì)的中間體被廣泛應(yīng)用，特別是高光學(xué)純度的D-乳酸，因其可以提高聚乳酸材料的性能而得到越來越多的關(guān)注。D-乳酸的合成方法可以分為化學(xué)合成法、酶法和發(fā)酵法?；瘜W(xué)合成法合成效率高，但成本高且毒性大，不適合廣泛和可持續(xù)生產(chǎn)；酶法可以得到單一旋光乳酸但工藝復(fù)雜，成本較高，尚未大規(guī)模應(yīng)用于工業(yè)；發(fā)酵法生產(chǎn)條件溫和，對環(huán)境污染小，幾乎無毒副作用，是合成D-乳酸的理想方法。我國的D-乳酸生產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)的需要，生產(chǎn)技術(shù)相對落后，尤其是對D-乳酸生產(chǎn)菌研究相對落后，因此，高光學(xué)純度D-乳酸生產(chǎn)菌株的選育及開發(fā)是非常重要的。D-乳酸的發(fā)酵菌種種類繁多，其中以芽胞乳桿菌、乳桿菌和基因工程大腸埃希菌為主，本文就D-乳酸發(fā)酵細(xì)菌菌種近幾十年的研究進(jìn)展進(jìn)行回顧分析，并展望了菌種選育的發(fā)展方向。

1 芽胞乳桿菌

芽胞乳桿菌是兼性厭氧菌，通過同型發(fā)酵葡萄糖、果糖和甘露糖等產(chǎn)D-乳酸，在產(chǎn)D-乳酸方面應(yīng)用廣泛。丁子建等[1]在國內(nèi)首次提出利用發(fā)酵法生產(chǎn)D-乳酸，研究了溫度、含氧量、pH、碳氮源、維生素和金屬離子等對芽胞乳桿菌產(chǎn)D-乳酸的影響，D-乳酸光學(xué)純度為96.04%，產(chǎn)量為40.7 g/L。Zhao等[2]應(yīng)用菊糖芽胞乳桿菌 Y2-8在纖維素固定床生物反應(yīng)器中以玉米粉水解液進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，分批發(fā)酵產(chǎn)率可達(dá)1.62 g/(L·h)，高于游離細(xì)胞發(fā)酵，D-乳酸光學(xué)純度在99%以上。Nguyen等[3]開展了乳桿菌、棒桿菌以鮮薯同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸和L-乳酸的研究。

1.1 芽胞乳桿菌的物理、化學(xué)誘變育種

微生物菌種的物理、化學(xué)誘變應(yīng)用范圍廣，操作方法簡單，但突變范圍大、不定向，需從大量的突變體中篩選出目的菌株，工作量較大。Zheng等[4]利用原生質(zhì)體融合技術(shù)提高菊糖芽胞乳桿菌ATCC 15538的D-乳酸產(chǎn)量，對起始菌株進(jìn)行紫外誘變、硫酸二乙酯誘變和pH梯度篩選，經(jīng)過3輪的基因組重排得到重組菌株F3-4，其在5 L發(fā)酵罐中D-乳酸產(chǎn)量達(dá)到93.4 g/L，比起始菌株增加了39.8%。于培星等[5-6]以凝結(jié)芽胞桿菌JD-063D為出發(fā)菌株，利用紫外線、鈷60γ-射線輻照、硫酸二乙酯、微波進(jìn)行復(fù)合誘變，使凝結(jié)芽胞桿菌產(chǎn)酸量由61 g/L提高到145 g/L，D-乳酸純度由97.5%增加到98.7%以上。李銀鏑[7]利用濃度為0.015%的溴甲酚紫作為篩選劑，以菊糖芽胞乳桿菌SP-BME 126為出發(fā)菌株，經(jīng)過3輪紫外誘變，篩選出D-乳酸高產(chǎn)菌株SP-MD1，與出發(fā)菌株相比D-乳酸的產(chǎn)量提高了7.1%，而且穩(wěn)定性良好。劉聯(lián)杰等[8]對菊糖芽胞乳桿菌DO進(jìn)行20 s的紫外及硫酸二乙酯(DES)誘變，得到突變株的D-乳酸產(chǎn)量為61.35 g/L，比出發(fā)菌株的42.57 g/L提高了44.1%，而且遺傳性狀穩(wěn)定。鄭璐等[9]以芽胞乳桿菌Y2-8為出發(fā)菌株，采用常壓室溫等離子體(ARTP)技術(shù)對其進(jìn)行誘變,誘變過程中采用高純氦氣作為工作氣體，通氣量10 L/min，功率100 W，照射距離2 mm，菌液10 μL。誘變后利用高糖-溴甲酚綠高通量篩選平板復(fù)篩，最終篩選得到1株遺傳穩(wěn)定性良好而且產(chǎn)酸速率高的突變菌株Y90s-1，D-乳酸發(fā)酵速率達(dá)1.05 g/(L·h)，比出發(fā)菌株提高了36.3%。

1.2 芽胞乳桿菌的基因工程育種

近幾年利用分子手段改造菌株迅速發(fā)展，其定向性強(qiáng)，可大量擴(kuò)增出目的產(chǎn)物的基因，定向改造菌株。胡媛等[10-11]以枯草芽胞桿菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增出葡萄糖脫氫酶基因(gdh)，與表達(dá)載體pETduet-1連接得到pETduet-GDH。再以粘質(zhì)沙雷氏菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增出乳酸脫氫酶基因(ldh)，與已構(gòu)建的pETduet-GDH連接獲得pETduet-LG，轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coliBL21進(jìn)行共表達(dá)。重組大腸埃希菌可以還原丙酮酸生成D-乳酸。底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到86.5%，D-乳酸產(chǎn)量為17.3 g/L。鄭輝杰[12]以菊糖芽胞乳桿菌SP-BME126 為出發(fā)菌株，通過紫外、硫酸二乙酯(DES)誘變和 pH 梯度篩選3種方法，篩選出遺傳穩(wěn)定性較好的菌株。再利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到原生質(zhì)體的優(yōu)化條件，在 RSM 優(yōu)化工藝條件下得到原生質(zhì)體，原生質(zhì)體通過3輪基因重排、pH優(yōu)化、單因素實(shí)驗(yàn)、PB實(shí)驗(yàn)和中心組合實(shí)驗(yàn)對菌種的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，最終菌株最大D-乳酸產(chǎn)量達(dá)到91.7 g/L。

2 大腸埃希菌

大腸埃希菌是生物領(lǐng)域最常使用的工程菌株之一，是模式菌株，其基因序列研究得比較清楚，基因組序列已全部測出。在生物基因工程領(lǐng)域常被應(yīng)用于基因的克隆和載體的構(gòu)建。孟武等[13]克隆大腸埃希菌E.coliW3110菌株中的4個(gè)代謝木糖的關(guān)鍵基因：木酮糖激酶基因(xylB)、木糖異構(gòu)酶基因(xylA)、轉(zhuǎn)醛醇酶基因(talA)和轉(zhuǎn)酮醇酶基因(tktA)，并構(gòu)建了含有低氧啟動(dòng)子相關(guān)基因Pvgb 的木糖加強(qiáng)型表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化到甲酸乙醇基因缺失突變株大腸埃希菌 W3110中。在 W3110 中構(gòu)建了組成型代謝木糖基因的表達(dá)載體，使受體菌獲得了利用木糖高效產(chǎn)生 D-乳酸的能力，E.coliW3110突變株中的質(zhì)粒得到表達(dá)，加強(qiáng)重組菌株代謝木糖能力，重組菌株代謝木糖合成 D-乳酸的光學(xué)純度達(dá)到 99%以上，產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了近 10%。周麗等[14]刪除了大腸埃希菌菌株B0013-030 的琥珀酸 (frdA) 和乙酸 (tdcDE)合成途徑，并構(gòu)建了含有突變盒的重組質(zhì)粒，再將突變盒整合于目的基因上并去除抗性基因，D-乳酸產(chǎn)量達(dá)114.5 g/L，光學(xué)純度大于 99.9%。進(jìn)一步刪除了tdcD 和tdcE基因，得到111.9 g/L的D-乳酸產(chǎn)量，乙酸和琥珀酸的合成量降低，其他副產(chǎn)物含量較低。李劍等[15]利用乳酸脫氫酶和丙酮酸裂解酶缺陷的大腸埃希菌作為宿主，互補(bǔ)篩選獲得新型的乳酸脫氫酶基因(ldh)，并通過基因序列分析獲得2個(gè)保守區(qū)域，其中V147～D176區(qū)是NADH的結(jié)合位點(diǎn)，R77～E107區(qū)是酶的活性部位。田甜等[16]以可利用蔗糖的大腸埃希菌HBUT-D1為出發(fā)菌株，采用λRed 重組系統(tǒng)技術(shù)將大腸埃希菌利用蔗糖的阻遏基因(cscR)敲除，得到1株可降解并促進(jìn)蔗糖運(yùn)輸?shù)拇竽c埃希菌工程菌株E.coliHBUT-D2。并對 HBUT-D2 進(jìn)行厭氧生長馴化，得到1株在厭氧及相同發(fā)酵條件下生長良好的菌株HBUT-D。并且進(jìn)行了發(fā)酵條件優(yōu)化，最終得到了D-乳酸，產(chǎn)量為 62 g/L，光學(xué)純度為99.9%，HBUT-D比出發(fā)菌株產(chǎn)酸量提高了38%。

3 乳桿菌

乳桿菌為革蘭陽性菌，不產(chǎn)芽胞，多數(shù)為益生菌，分解糖的主要產(chǎn)物是乳酸。在自然界中廣泛存在。

3.1 乳桿菌的物理、化學(xué)誘變育種

Nakano等[17]研究了利用碎米同步發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸，結(jié)果表明乳桿菌發(fā)酵過程中，中和劑氫氧化鈣可顯著提高產(chǎn)酸量。Joshi[18]對乳桿菌(Lactobacilluslactis) NCIM 2368 進(jìn)行反復(fù)的紫外誘變，獲得1株能利用纖維素酶水解纖維素材料得到纖維二糖的突變株，乳酸最高產(chǎn)量達(dá)到 110 g/L。Demirci 等[19]對D-乳酸產(chǎn)生菌德氏乳桿菌ATCC 9649 進(jìn)行反復(fù)化學(xué)誘變EMS誘變，得到生長速率快、滯后期短、乳酸產(chǎn)量高和乳酸耐受性較強(qiáng)的突變株DP3，其最高產(chǎn)酸量達(dá)到77 g/L，比原始菌株提高了32.76%。Kadam等對德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii) NCIM 2365 進(jìn)行馴化和紫外誘變處理，得到1株生長速率較快、滯后期短的誘變突變株 UC-3，在150 g/L蔗糖的條件下，D-乳酸產(chǎn)量最高達(dá)135 g/L[16]。

3.2 乳桿菌的基因工程育種

利用分子手段改造乳桿菌是很理想的方法，將乳桿菌的產(chǎn)酸基因轉(zhuǎn)入到其他菌株中，重組菌株便有了兩親本綜合的優(yōu)良性狀，得到了研究者所需要的目的菌株，分子手段是改造菌種最有效的方法之一。黃艷燕等[20]將鼠李糖乳桿菌基因組DNA中的D-(+)-乳酸脫氫酶基因ldhD連接到載體pSE380上，將構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸埃希菌，重組菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并在大腸埃希菌中檢測到D-(+)-乳酸脫氫酶的酶活。

4 其他菌株

其他類型的重組菌株和突變株在D-乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)中也占有舉足輕重的地位，例如粘質(zhì)沙雷氏菌和酵母菌在基因工程構(gòu)建D-乳酸高產(chǎn)菌株的研究中，得到了廣泛的應(yīng)用。滿永博[21-22]將構(gòu)建的乳酸脫氫酶質(zhì)粒pPbud-dldh轉(zhuǎn)入粘質(zhì)沙雷氏菌，構(gòu)建得到重組菌株S.MR1-dldh，與出發(fā)菌株相比較，葡萄糖的消耗速率加快而且D-乳酸的產(chǎn)量提高到(64.8±1.96) g/L。蘇剛等[23-24]對經(jīng)過基因工程改造的粘質(zhì)沙雷氏菌R1發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸進(jìn)行了培養(yǎng)基的優(yōu)化，確定了菌種的培養(yǎng)條件，在含有50 g/L的乳酸鹽培養(yǎng)基中篩選對乳酸鹽耐受性好的菌株，從而得到乳酸耐受性好的D-乳酸生產(chǎn)菌株，D-乳酸的產(chǎn)量達(dá)83.5 g/L。Ishida 等[25]通過敲除酵母菌丙酮酸脫羧酶基因(pdc1)，再將明串珠菌亞種2個(gè)拷貝的D-乳酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)入到酵母菌中，該菌株可發(fā)酵生產(chǎn) 61.5 g/L 的 D-乳酸，光學(xué)純度達(dá) 99.9%以上。Okino等[26]利用基因工程手段構(gòu)建了產(chǎn) D-乳酸的谷氨酸棒桿菌。先敲除谷氨酸棒桿菌L-乳酸脫氫酶基因(L-ldh)，再將大腸埃希菌D-乳酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)入，該菌株能利用缺氧的礦物鹽培養(yǎng)基，發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的量達(dá)到120 g/L，光學(xué)純度高于 99.9%。

5 展 望

菌種性能優(yōu)劣直接關(guān)系到發(fā)酵工業(yè)的成敗，一般情況下，野生型菌株往往無法達(dá)到工業(yè)要求，必須對其進(jìn)行育種才能實(shí)現(xiàn)。傳統(tǒng)微生物菌種選育多采用物理或化學(xué)誘變劑(紫外線、X 射線、γ 射線、快中子以及各種化學(xué)誘變劑)對出發(fā)菌株進(jìn)行誘變，從而獲得生產(chǎn)能力提高的突變菌株。隨著D-乳酸在工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，日益短缺的D-乳酸生產(chǎn)菌種問題逐漸成為限制其工業(yè)化的瓶頸。目前，D-乳酸生產(chǎn)菌的改造多采用傳統(tǒng)微生物菌種選育方法，部分學(xué)者應(yīng)用基因工程育種方法。然而，微生物是一個(gè)復(fù)雜的有機(jī)體，目的產(chǎn)物的合成需要整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)的多步酶促反應(yīng)進(jìn)行協(xié)同作用。僅進(jìn)行單一酶促反應(yīng)的基因工程改造對提高菌株的發(fā)酵性能作用極其有限。因此，充分利用現(xiàn)有各種D-乳酸產(chǎn)生菌基因組序列信息數(shù)據(jù)，分別在基因組水平、轉(zhuǎn)錄組水平、蛋白質(zhì)組水平、代謝產(chǎn)物組水平以及代謝通量組水平開展D-乳酸生產(chǎn)菌的代謝網(wǎng)絡(luò)分析和育種，是D-乳酸生產(chǎn)菌的主要方向。

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The Research Progress of D-Lactic Acid Fermentation Bacterial Strains

LIU Juan1, WANG Gang1, ZHANG Ming-lei1, JIANG Xing-lin1, GUO Ming-zhu2, CHEN Guang1

(1.Schl.ofLifeSci.,JilinAgric.Uni.,Changchun130118; 2.Coll.ofInformt’n,ChangchunVocat’lInst.ofTechnol.,Changchun130118)

As an important industrial organic acid, D-lactic acid is the intermediate of many chiral substances. It has received increased attention for use as a monomer for the production of biodegradable poly especially. Microbial fermentation is the most important method for D-lactic acid production and microorganisms play a key role in the fermentation method. The research development of D-lactic acid-producing microorganisms was summarized.

d-lactic acid; lactic acid bacteria; lactate dehydrogenase

科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(2013GB2B100110)；長春市科技支撐項(xiàng)目(12XN18)；吉林省教育廳項(xiàng)目(2014[465])；

劉娟 女，碩士研究生。研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。Tel：0431-84532886，E-mail：1040746303@qq.com

* 通訊作者。男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)樯锎呋c代謝工程。Tel：0431-84532886，E-mail：gangziccc@163.com

2015-02-21；

2015-03-16

Q939.97

A

1005-7021(2016)01-0096-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.01.016

吉林省秸稈綜合利用技術(shù)創(chuàng)新平臺(tái)項(xiàng)目(吉高平臺(tái)字[2014]C-1)