滕凡全，田英，趙明義，田艷秋

（1.遼寧省水文局，遼寧 沈陽(yáng) 110000；2.遼寧省沈陽(yáng)市兒童醫(yī)院輸血科，遼寧 沈陽(yáng) 110000；3.遼寧大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110000）

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飲用水中未知細(xì)菌鑒定方法研究進(jìn)展

滕凡全1，田英1，趙明義2，田艷秋3

（1.遼寧省水文局，遼寧 沈陽(yáng) 110000；2.遼寧省沈陽(yáng)市兒童醫(yī)院輸血科，遼寧 沈陽(yáng) 110000；3.遼寧大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110000）

［摘 要］世界衛(wèi)生組織（WHO）《飲用水水質(zhì)準(zhǔn)則》指出，與飲用水有關(guān)的衛(wèi)生問(wèn)題大多來(lái)自微生物的污染，且飲用水受到微生物污染是全世界普遍存在的問(wèn)題。因此，嚴(yán)格監(jiān)測(cè)飲用水微生物污染，對(duì)保障人民群眾身體健康具有重要現(xiàn)實(shí)意義。文中主要綜述了飲用水中未知細(xì)菌的多種鑒定方法的研究進(jìn)展，對(duì)幾種鑒定方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行比較。

［關(guān)鍵詞］飲用水；細(xì)菌；鑒定方法

據(jù)聯(lián)合國(guó)有關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)字[1]，目前全球有17億人喝不到干凈的飲用水，每天約有2.5萬(wàn)人因水質(zhì)低劣而死亡。飲用水水質(zhì)的好壞直接決定人們的健康。環(huán)境中微生物尤其是細(xì)菌污染嚴(yán)重威脅著人類的健康，快速鑒定環(huán)境中的致病微生物對(duì)于控制傳染病的爆發(fā)和傳染病的監(jiān)測(cè)極為重要。近20年來(lái)，一些環(huán)境中非常見(jiàn)的致病菌(包括條件致病菌)感染引起腹瀉的事件時(shí)有發(fā)生，軍團(tuán)菌感染引起的肺炎也引起人們的廣泛關(guān)注。在飲用水中不斷發(fā)現(xiàn)新的對(duì)人類造成重大危害的病原微生物，如大腸桿菌O157:H7、軍團(tuán)菌、隱孢子蟲(chóng)、柯薩奇病毒等[2-4]，常規(guī)飲用水處理技術(shù)難以有效地去除。由于環(huán)境污染加劇，還會(huì)產(chǎn)生一些新的病原微生物，危害人類健康。因此尋找快速鑒定飲用水中未知細(xì)菌的方法，對(duì)保障飲用水安全具有重要現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用意義?，F(xiàn)階段對(duì)于飲用水樣品的鑒定主要還是依賴于傳統(tǒng)的培養(yǎng)特性、生化反應(yīng)等技術(shù)。隨著生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，細(xì)菌的分類鑒定發(fā)生了重大革新，開(kāi)始進(jìn)入分子水平，一批新的細(xì)菌鑒定方法也隨之產(chǎn)生。現(xiàn)將飲用水中細(xì)菌的鑒定方法進(jìn)行分類介紹：

1　表型鑒定法

1.1常規(guī)形態(tài)學(xué)觀察

通過(guò)常規(guī)宏觀菌落形態(tài)學(xué)觀察，如細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)形態(tài)、大小、顏色等特征；在液體培養(yǎng)基上的渾濁狀況、沉淀狀況、液面菌膜等狀況；半固體培養(yǎng)基上穿刺接種后生長(zhǎng)狀態(tài)等；在鑒別培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察結(jié)果是否跟預(yù)期結(jié)果相同。

1.2染色方法鑒定

染色方法鑒定細(xì)菌為細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)學(xué)觀察，主要包括：①單染色法：用一種染料將細(xì)菌和周圍物體染成同一種顏色。細(xì)菌經(jīng)單染色法處理后，可觀察其形態(tài)、排列、大小及簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)，但不能顯示各種細(xì)菌染色性的差異。②復(fù)染色法：用兩種或兩種以上的染料染色的方法，稱為復(fù)染色法或鑒別染色法。常用的有革蘭染色法和抗酸染色法。③熒光染色法：熒光染色法敏感性強(qiáng)，效率高而且容易觀察結(jié)果，在細(xì)菌鑒定中有很大的實(shí)用價(jià)值。

1.3生化鑒定

根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中不同菌種所產(chǎn)生的新陳代謝產(chǎn)物，表現(xiàn)出不同的生長(zhǎng)特性。通過(guò)生物化學(xué)的方法來(lái)檢測(cè)這些物質(zhì)的存在與否，從而能夠得到細(xì)菌的鑒定結(jié)果。如糖（醇）類代謝試驗(yàn)、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn)、有機(jī)酸鹽和胺鹽利用試驗(yàn)、呼吸酶類試驗(yàn)、毒性酶類試驗(yàn)等。

傳統(tǒng)的手工生化鑒定存在耗時(shí)長(zhǎng)，人為因素影響大，隨著儀器分析技術(shù)的進(jìn)步和計(jì)算機(jī)的廣泛應(yīng)用，近年來(lái)微生物的檢測(cè)鑒定技術(shù)，已逐步由傳統(tǒng)的手工檢測(cè)鑒定進(jìn)入了基于儀器自動(dòng)化分析的鑒定系統(tǒng)階段，并力求快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確。一系列商品化全自動(dòng)/半自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)相繼推出，并在應(yīng)用中取得了比較理想的效果，如美國(guó)Biolog公司的 BIOLOG系統(tǒng)和法國(guó)梅里埃公司的VITEK系統(tǒng)。目前市場(chǎng)上的微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)雖然基本上都通過(guò)了相關(guān)權(quán)威組織的認(rèn)可，在細(xì)菌快速鑒定或初步鑒定中起到了一定的作用，但如前所述，其穩(wěn)定性尚存在一定問(wèn)題，同樣需要配合其他方法來(lái)相互印證，從而更精確、快速地完成細(xì)菌鑒定工作。

2　以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的鑒定技術(shù)

這類技術(shù)包括：乳膠凝集反應(yīng)、ELISA方法、膠體金技術(shù)、免疫磁珠法以及細(xì)菌鑒定經(jīng)典方法—血清型鑒定等。以血清型鑒定為例，它是根據(jù)細(xì)菌具有相對(duì)特異性的抗原結(jié)構(gòu)這個(gè)特點(diǎn)進(jìn)行微生物鑒定的特異方法?？乖奶禺愋猿潭扔执嬖谟趯匍g細(xì)菌所共有的共同抗原，這種抗原的存在，能表明其屬性。通過(guò)專門的分型血清即可對(duì)這些細(xì)菌的血清型進(jìn)行鑒定。該方法有一定的局限性，只能對(duì)細(xì)菌抗原大分子表面構(gòu)型進(jìn)行分析比較，受抗原空間構(gòu)型的限制無(wú)法深入分析。

3　以核酸檢測(cè)為基礎(chǔ)的鑒定技術(shù)

3.1 16SrDNA序列鑒定

近年來(lái)，16SrDNA被用來(lái)作為細(xì)菌鑒定分類的重要依據(jù)，而且應(yīng)用越來(lái)越廣泛[5]。16SrDNA基因序列長(zhǎng)約1.6kb左右，存在于原核生物中。它由保守區(qū)和可變區(qū)組成，保守區(qū)為所有細(xì)菌所共有，細(xì)菌間沒(méi)有差別；可變區(qū)在不同細(xì)菌之間存在不同程度的差異，具有屬或種的特異性。細(xì)菌的16SrDNA序列變化速度與進(jìn)化速率相適應(yīng)，因此被廣泛用于種屬鑒定。結(jié)合完善的數(shù)據(jù)庫(kù)，16SrDNA序列分析可以快速準(zhǔn)確的對(duì)微生物進(jìn)行種屬鑒定，確定微生物在進(jìn)化中的位置。根據(jù)16SrDNA序列同源性分析建立細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分類的準(zhǔn)確性和重要性已經(jīng)被越來(lái)越多的細(xì)菌分類學(xué)者所認(rèn)識(shí)和接受。

3.2指紋圖譜技術(shù)

利用重復(fù)性DNA序列之間距離不同(repeat-PCR)，通過(guò)對(duì)它的擴(kuò)增，產(chǎn)生不同大小的DNA片段來(lái)代表這些重復(fù)性DNA間的不同距離。PCR產(chǎn)物可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳產(chǎn)生特異性DNA指紋。許多拷貝的基因外重復(fù)序列，如重復(fù)性基因外回紋結(jié)構(gòu)(REP)和腸桿菌重復(fù)性基因內(nèi)共有序列(ERIC)，都存在于許多菌種中，將染色體DNA和以REP為基礎(chǔ)的探針雜交，可區(qū)分腸桿菌種和大腸桿菌分離物[6]。盡管PCR技術(shù)以其明顯的優(yōu)勢(shì)在細(xì)菌分類鑒定中起到了巨大作用,但也有一定缺點(diǎn)，主要是引起一定程度的單核苷酸的錯(cuò)誤摻入，而且微量的外源DNA進(jìn)入PCR，引起的無(wú)限放大可產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。

3.3質(zhì)粒圖譜分析法

質(zhì)粒圖譜分析就是將質(zhì)粒從每個(gè)分離物中提取出來(lái),在瓊脂糖凝膠上作分離電泳，檢測(cè)它們的大小與數(shù)量，還可進(jìn)一步用限制性核酸內(nèi)切酶消化質(zhì)粒，然后比較酶切片段的大小與數(shù)量,通過(guò)此種方法可提高質(zhì)粒圖譜分析的分辨力[7]。該技術(shù)有一定缺點(diǎn)，如適用范圍窄，只適于存在質(zhì)粒的細(xì)菌，無(wú)法用于不含質(zhì)粒的細(xì)菌；有些質(zhì)粒不穩(wěn)定；限于一定時(shí)間和地區(qū)范圍內(nèi)；需要保存在-70℃；如純化不凈，質(zhì)粒和染色體DNA條帶容易相互混淆，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.4基因探針技術(shù)

具有同源序列的兩條DNA單鏈或DNA與RNA單鏈，在適當(dāng)?shù)臈l件下能互補(bǔ)地形成穩(wěn)定的DNA雙鏈或DNA-RNA鏈，隨著Southern印跡技術(shù)的出現(xiàn)，用標(biāo)記的帶有高度特異性DNA限制性同源基因位點(diǎn)的DNA，探針可識(shí)別具有同源序列的限制性片段，從而降低片段長(zhǎng)度多態(tài)性所要分析的條帶數(shù)量。所有攜帶與探針一樣的同源基因位點(diǎn)的細(xì)菌菌株都可得到分離，結(jié)果具有很高的重復(fù)性。目前常用的雜交探針包括隨機(jī)克隆的染色體DNA序列、抗性基因、毒素基因、rRNA基因及其它一些基因。以前該法還受到探針?lè)派湫詷?biāo)記的限制，但隨著非放射性標(biāo)記方法的產(chǎn)生，特別是生物素地高辛標(biāo)記探針的產(chǎn)生和商品化，該法得到了廣泛應(yīng)用。雜交后經(jīng)放射自顯影或生物素地高辛顯色，可利用特異性DNA條帶和指紋圖對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定，而且可通過(guò)對(duì)它們之間的同源性比較進(jìn)一步了解菌株間的親緣關(guān)系。

3.5 DNA GC含量

染色體DNA的GC含量即DNA的堿基組成。由于不受菌齡的影響，已成為細(xì)菌分類鑒定的重要指標(biāo)。每一種生物的DNA均有特定的GC含量，不同生物各不相同，生物種間親緣關(guān)系較近，則GC含量差別較小，反之亦然。DNA的GC含量測(cè)定方法主要有紙層析法，浮力密度法，高效液相色譜法，熱變性溫度測(cè)定法（Tm法）和熒光法等，由于Tm法操作簡(jiǎn)便、精確度高、重復(fù)性好，被廣為采用。

4　基于蛋白質(zhì)圖譜分析的鑒定技術(shù)

蛋白質(zhì)圖譜鑒定細(xì)菌主要是基于圖譜中存在細(xì)菌蛋白質(zhì)標(biāo)志物，其含量和結(jié)構(gòu)具有種屬特異性，能夠標(biāo)志某一類或某種特定細(xì)菌的存在。近年來(lái)，基于蛋白質(zhì)組學(xué)的質(zhì)譜技術(shù)憑借其高靈敏度、高通量、快速等特點(diǎn)，在細(xì)菌檢測(cè)及鑒定方面得到快速發(fā)展?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜是近幾年快速發(fā)展起來(lái)的應(yīng)用于細(xì)菌全細(xì)胞快速檢測(cè)的一項(xiàng)技術(shù)。此種技術(shù)的應(yīng)用與其它細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)相比,具有明顯的優(yōu)勢(shì)：所需時(shí)間短；可在細(xì)菌的種、株水平上將細(xì)菌區(qū)分開(kāi)來(lái)；產(chǎn)生質(zhì)譜圖的生物標(biāo)記物來(lái)源于細(xì)菌表面，有利于對(duì)不同血清型菌株的鑒別。但在應(yīng)用MALDI-TOF-MS的過(guò)程中，很多因素會(huì)對(duì)質(zhì)譜圖產(chǎn)生影響，如有些細(xì)菌需要特殊的培養(yǎng)基才能正常生長(zhǎng)，培養(yǎng)基的選擇會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。另外，該技術(shù)所使用的儀器價(jià)格昂貴，儀器使用成本高等缺點(diǎn)，需要專業(yè)人才才能使用，不易普及應(yīng)用。

5　結(jié)語(yǔ)

綜上所述，每種鑒定方法均有其優(yōu)點(diǎn)和缺陷，因此為了準(zhǔn)確地對(duì)飲用水中未知細(xì)菌進(jìn)行鑒定，應(yīng)該把表型鑒定和基因鑒定方法結(jié)合起來(lái)。PCR技術(shù)、顯微熒光技術(shù)、免疫組化技術(shù)往往需要較長(zhǎng)的時(shí)間和復(fù)雜的前處理程序，鑒定實(shí)驗(yàn)要求較高，不利于細(xì)菌的快速檢測(cè)。16SrDNA序列鑒定方法操作簡(jiǎn)單，具有高靈敏度和高特異性，BIOLOG快速鑒定方法快速、準(zhǔn)確，兩者結(jié)合可以達(dá)到快速、準(zhǔn)確鑒定飲用水中細(xì)菌的要求。另外，在鑒定飲用水中未知細(xì)菌的過(guò)程中，還要注意特殊細(xì)菌（如耐氯細(xì)菌等）的生理特性。在日常工作中充分利用和完善現(xiàn)有鑒定技術(shù)，研究和對(duì)比新的鑒定方法，尋找在靈敏性、特異性和實(shí)用性上更適合飲用水中細(xì)菌快速鑒定需要的方法，更大程度地滿足飲用水安全控制的迫切需求，保障人民群眾的用水安全和健康?？偠灾?，更多地使用傳統(tǒng)與現(xiàn)代相結(jié)合以及不斷發(fā)掘新的鑒定方法才能尋找到更簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏并且成本低廉的檢測(cè)方法，更好地完成飲用水中細(xì)菌快速鑒定工作。

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[項(xiàng)目資助]沈陽(yáng)市科技局計(jì)劃項(xiàng)目（F13-316-1-63），遼寧省教育廳一般項(xiàng)目（L2015201）

［中圖分類號(hào)］X832

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］C

［文章編號(hào)］1002－0624（2016）05－0044－03

[收稿日期]2016-03-05