許芹，王丹，徐晴，李霜（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210009）

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解脂耶氏酵母不對(duì)稱還原苯乙酮合成(R)-苯乙醇

許芹，王丹，徐晴，李霜
（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210009）

摘要：為了提高解脂耶氏酵母對(duì)苯乙酮的催化效率，以20mmol/L的苯乙酮和苯乙醇為篩選壓力，采用紫外誘變獲得突變株，優(yōu)化了反應(yīng)體系參數(shù)，如溫度、pH值、輔助底物、有機(jī)溶劑（如甲苯、己烷、辛烷、DMF、DMSO等）以及離子液體（1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，BMIM·PF6）等對(duì)催化體系的影響。結(jié)果表明，利用解脂耶氏酵母突變株全細(xì)胞催化苯乙酮（20mmol/L）合成(R)-苯乙醇，轉(zhuǎn)化率76%，e.e.達(dá)99.2%。優(yōu)化后的反應(yīng)體系如下：最適輔助底物為葡萄糖，反應(yīng)溫度30℃，pH=7.0，30%（體積分?jǐn)?shù)）疏水性離子液體BMIM·PF6。當(dāng)利用解脂耶氏酵母突變株的發(fā)酵液為催化體系，向反應(yīng)體系中添加30%（體積分?jǐn)?shù)） BMIM·PF6，以60mmol/L苯乙酮為底物，反應(yīng)36h，(R)-苯乙醇的轉(zhuǎn)化率達(dá)95%，e.e.值達(dá)97%。解脂耶氏酵母突變株全細(xì)胞催化苯乙酮不對(duì)稱還原反應(yīng)，在高底物濃度、高轉(zhuǎn)化率以及高光學(xué)純度等方面具有突出表現(xiàn)。

關(guān)鍵詞：解脂耶氏酵母; 苯乙酮; (R)-苯乙醇; 生物催化；酶；優(yōu)化

第一作者：許芹（1991—），女，碩士研究生，主要從事生物催化研究。

聯(lián)系人：李霜，教授，主要從事生物催化與生物轉(zhuǎn)化研究。E-mail lishuang@njtech.edu.cn。

含有芳香基的手性醇是許多手性藥物合成的關(guān)鍵手性模塊和平臺(tái)化合物，在手性合成中占有重要的地位；而前手性芳香酮的不對(duì)稱催化還原是制備光學(xué)活性醇的一個(gè)重要方法[1-2]。微生物細(xì)胞中含有許多具有立體選擇性的酶，使用全細(xì)胞催化不對(duì)稱合成反應(yīng)不但可以省去繁雜的酶分離和純化步驟，而且在催化反應(yīng)過程中細(xì)胞可以通過代謝廉價(jià)的葡萄糖等輔助底物實(shí)現(xiàn)輔酶再生，同時(shí)所有的酶和輔酶因被保護(hù)在天然的細(xì)胞環(huán)境中，不易失活，有利于生物催化反應(yīng)的進(jìn)行[3-4]。

解脂耶氏酵母是一種非常規(guī)性酵母，可使用油脂作為唯一碳源[5]。解脂耶氏酵母在羰基不對(duì)稱還原反應(yīng)中的應(yīng)用只有少數(shù)報(bào)道。LAGOS等[6]通過篩選得到解脂耶氏酵母CECT 1240，可將1-芳氧基-3-氯-2-丙酮還原為光學(xué)純度為99%的(S)-醇；而FANTIN等[7]則研究了來自不同環(huán)境中的解脂耶氏酵母催化各種前手性羰基化合物。

苯乙酮是篩選不對(duì)稱還原立體選擇性酶的模式底物，利用微生物細(xì)胞催化苯乙酮不對(duì)稱還原反應(yīng)得到光學(xué)純的苯乙醇，無論從經(jīng)濟(jì)角度還是學(xué)術(shù)角度考慮，都具有廣泛的應(yīng)用前景和潛在的巨大經(jīng)濟(jì)效益。由于底物苯乙酮對(duì)細(xì)胞具有毒性，過低的底物濃度（<10mmol/L）成為生物催化反應(yīng)的瓶頸之一。

本文通過將解脂耶氏酵母ACA-DC 50109進(jìn)行紫外誘變來提高對(duì)苯乙酮的耐受性和催化效率。為了進(jìn)一步提高產(chǎn)物光學(xué)純度和轉(zhuǎn)化率，優(yōu)化了反應(yīng)體系，如溫度、pH值、輔助底物和反應(yīng)時(shí)間；進(jìn)一步考察了添加有機(jī)溶劑（如甲苯、己烷、辛烷、DMF、DMSO等）以及離子液體（1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，BMIM?PF6）對(duì)催化體系的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及試劑

解脂耶氏酵母ACA-DC 50109[5]由希臘派圖拉斯大學(xué)George Aggelis教授饋贈(zèng)。底物苯乙酮、(R)-苯乙醇和(S)-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)品以及各種苯乙酮的衍生物均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。離子液體BMIM?PF6購(gòu)自Aladdin公司。其他試劑均為分析純。

1.1.2 產(chǎn)酶培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基組成：葡萄糖45g/L，酵母粉13g/L，NH4Cl 2.5g/L，K2HPO41.0g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，KH2PO41.0g/L，F(xiàn)e2(SO4)30.01g/L，ZnSO40.01g/L，苯乙酮（誘導(dǎo)劑）0.01g/L。固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入15g/L的瓊脂即可。

1.2 紫外誘變以及突變菌株篩選

解脂耶氏酵母ACA-DC 50109在15W的紫外線下照射30s，再將經(jīng)過紫外照射的酵母接種到含有20mmol/L苯乙酮和20mmol/L苯乙醇的固體培養(yǎng)基中，在避光條件下30℃培養(yǎng)兩天，將得到的單菌落進(jìn)行分離并研究催化苯乙酮效率。

1.3 催化苯乙酮的不對(duì)稱還原反應(yīng)

優(yōu)化反應(yīng)體系：將培養(yǎng)36h的解脂耶氏酵母ACA-DC 50109-H菌液離心分離，用0.85%的生理鹽水洗滌兩次，將洗滌后的菌體分散于磷酸緩沖液（pH=7.0）中。20mL還原反應(yīng)體系中添加0.2g濕菌體，加入一定量的底物苯乙酮，放入搖床（150r/min）中反應(yīng)36h。

發(fā)酵液反應(yīng)體系：解脂耶氏酵母培養(yǎng)36h后，向發(fā)酵后的培養(yǎng)基（20mL）中投加一定量的底物苯乙酮，放入搖床（150r/min）中反應(yīng)36h。

1.4 分析方法

反應(yīng)結(jié)束后，用1倍體積的乙酸乙酯萃取，用氣相色譜分析，安捷倫6890N氣相色譜儀，色譜柱：Supelco Bata DEXTM120（30m×0.25mm×0.25μm）。色譜條件為：進(jìn)樣量1μL，進(jìn)樣口溫度200℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度250℃，采用程序升溫：125℃保持5min，以10℃/min升溫至165℃，保持1min，載氣N2流速為25mL/min，燃燒氣H2流速為30mL/min，空氣流速為300mL/min，苯乙酮出峰時(shí)間7.032min，(R)-苯乙醇出峰時(shí)間為8.751min，(S)-苯乙醇出峰時(shí)間為8.923min。

2 結(jié)果與討論

2.1 解脂耶氏酵母ACA-DC 50109的突變菌株篩選

表1 底物濃度對(duì)解脂耶氏酵母ACA-DC 50109還原反應(yīng)的影響

首先，考察了野生解脂耶氏酵母ACA-DC 50109對(duì)苯乙酮的催化能力。從表1中可以看出，野生解脂耶氏酵母ACA-DC 50109對(duì)苯乙酮的催化能力較低，當(dāng)?shù)孜餅?mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率為75%，而當(dāng)?shù)孜镞_(dá)到15mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率只有12%。但是，對(duì)映體過量值（e.e.）值相對(duì)較高。

對(duì)于酵母菌而言，酮還原酶通常以組成型的形式存在于細(xì)胞，往培養(yǎng)基中添加少量的苯乙酮可以促進(jìn)產(chǎn)酶。但是，苯乙酮的細(xì)胞毒性較大，2mmol/L的苯乙酮即可抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，生物催化不對(duì)稱還原苯乙酮的反應(yīng)體系中，要想獲得較高的轉(zhuǎn)化率，底物濃度較低（1～10mmol/L）[8]，細(xì)胞用量極大（150g/L）[9]，或者使用雙相反應(yīng)體系[10]。

為了提高解脂耶氏酵母ACA-DC 50109的催化能力和底物耐受性，將野生菌進(jìn)行紫外誘變，以20mmol/L苯乙酮和20mmol/L外消旋苯乙醇為篩選壓力，最終獲得10株突變菌。以20mmol/L苯乙酮為底物，表2中，大部分突變菌株都保留了較高的選擇性，其中突變株H的轉(zhuǎn)化率和選擇性都最高，分別為76%和99.2%。因此，突變株H繼續(xù)應(yīng)用于后面的研究。

表2 10株突變株的催化能力

2.2 反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.2.1 pH值對(duì)反應(yīng)的影響

生物催化體系的pH值不僅影響酶的活性和立體選擇性[11]，還影響到細(xì)胞內(nèi)輔酶再生，從而影響生物催化劑的轉(zhuǎn)化表現(xiàn)[12]。因此，考察了體系pH值對(duì)突變株H立體選擇性和產(chǎn)物得率的影響。以20mmol/L底物反應(yīng)36h后，從圖1可知，在pH=7.0～8.0范圍內(nèi)，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率和選擇性都具有優(yōu)勢(shì)，反應(yīng)pH=7.0時(shí)，轉(zhuǎn)化率為80%，e.e.值為93%，兩者均達(dá)到最大。

2.2.2 溫度對(duì)反應(yīng)的影響

反應(yīng)溫度通常影響催化劑的選擇性和穩(wěn)定性[13-14]，為了確定突變株H的最適轉(zhuǎn)化溫度，考察了當(dāng)pH值為7.0時(shí)，反應(yīng)溫度（25～50℃）對(duì)反應(yīng)的影響。從圖2中可知，以20mmol/L苯乙酮為底物，30℃時(shí)轉(zhuǎn)化率和e.e.值均最高；30℃以下，酶活不足；超過30℃，酶迅速失活，轉(zhuǎn)化率和e.e.值均迅速下降。

圖1 pH值對(duì)反應(yīng)的影響（反應(yīng)條件：20mL反應(yīng)緩沖，細(xì)胞量0.2g，苯乙酮濃度20mmol/L，葡萄糖10mmol/L，30℃，150r/min，36h）

根據(jù)多點(diǎn)依附的理論，前手性碳周圍的3個(gè)基團(tuán)必需和酶相互作用，使底物被牢牢地控制在一個(gè)不對(duì)稱活性部位上，只有一個(gè)面對(duì)著攻擊基團(tuán)，從而得到某一對(duì)映體產(chǎn)物，即高e.e.值的產(chǎn)物，而隨著溫度的升高，這種酶與底物基團(tuán)的結(jié)合會(huì)逐步破壞，e.e.下降，溫度低時(shí)，分子運(yùn)動(dòng)速度變慢，影響酶活力的發(fā)揮，e.e.值也不高[15]，因此，較適合的反應(yīng)溫度為30℃。

2.2.3 輔助底物的選擇

圖2 溫度對(duì)反應(yīng)的影響（反應(yīng)條件：20mL反應(yīng)緩沖，細(xì)胞量0.2g，pH=7.0，苯乙酮濃度20mmol/L，不同溫度，150r/min，36h，葡萄糖10mmol/L）

酵母細(xì)胞內(nèi)含有NADPH和NADH，但其數(shù)量有限[16]，為使生物催化反應(yīng)能夠順利進(jìn)行，通常需要向反應(yīng)介質(zhì)內(nèi)添加一定量輔助底物[17]，常見的輔助底物為糖類和醇類化合物[18]。本實(shí)驗(yàn)中以葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、異丙醇、乙醇和丙三醇為輔助底物研究了添加輔助底物對(duì)反應(yīng)的影響（表3）。以30mmol/L苯乙酮為底物，反應(yīng)36h后，葡萄糖和蔗糖為輔助底物均可提高反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率，其中葡萄糖提高轉(zhuǎn)化率最佳，其轉(zhuǎn)化率為62%，而e.e.值只有95.9%，低于空白98.6%，雖然蔗糖同樣提高轉(zhuǎn)化率為54%，但是e.e.值只有87.4%，為此選擇葡萄糖為輔助底物。

鑒于突變株H產(chǎn)酶發(fā)酵36h時(shí)細(xì)胞生物量（濕重）約25g/L，同時(shí)發(fā)酵液中的殘余葡萄糖濃度為5～8g/L（27～44mmol/L），為了省略收集細(xì)胞的繁瑣操作，并充分利用發(fā)酵液殘?zhí)?，此后的研究中可將產(chǎn)酶培養(yǎng)基作為反應(yīng)體系，添加底物苯乙酮及離子液體等考察反應(yīng)進(jìn)程。

2.2.4 底物投加量對(duì)轉(zhuǎn)化率和e.e.值的影響

由表4可知，在5mmol/L和10mmol/L的低底物濃度下，轉(zhuǎn)化率為100%，且e.e.值為95%以上。但隨著底物濃度的增加，轉(zhuǎn)化率逐漸下降，底物濃度達(dá)60mmol/L時(shí)，e.e.值開始大幅下降。

表4 底物投加量對(duì)反應(yīng)的影響

當(dāng)酵母細(xì)胞的濃度一定時(shí)，其酶活性部位所能接納的底物量也就確定了，因此酵母濃度一定時(shí)底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的量基本不變，但隨著底物濃度的增加，底物對(duì)酶產(chǎn)生了抑制作用，底物的轉(zhuǎn)化率下降。當(dāng)酵母細(xì)胞的濃度一定、底物濃度較低時(shí)，酶活性部位數(shù)目與底物濃度相比較充足，對(duì)底物的誘導(dǎo)契合較好，從而得到某一對(duì)映體產(chǎn)物，即高e.e.值的產(chǎn)物，但底物濃度增加時(shí)，酶活性部位數(shù)目不足，對(duì)底物的誘導(dǎo)契合不好，羰基的加氫能從底物的兩面進(jìn)行，此時(shí)e.e.值下降[19]。

2.3 雙相體系反應(yīng)

2.3.1 有機(jī)試劑的選擇

從表5可以看出，與未添加有機(jī)試劑相比，所選的甲苯、正己烷、辛烷、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和二甲基亞砜（DMSO）這5種有機(jī)試劑并沒有提高反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率，可能是因?yàn)橛袡C(jī)溶劑也具有一定的細(xì)胞毒性，并引起酶構(gòu)象變化導(dǎo)致失活而轉(zhuǎn)化率較低。而添加離子液體BMIM?PF6后，轉(zhuǎn)化率和e.e.值均有所提高。這是因?yàn)殡x子液體通常被認(rèn)為是一種能替代有機(jī)溶劑的綠色介質(zhì)，用其替代有機(jī)溶劑與水形成雙相反應(yīng)體系用于微生物細(xì)胞催化的生物轉(zhuǎn)化過程，不僅可以減少對(duì)環(huán)境和產(chǎn)品的污染，還可能提高細(xì)胞的活性和穩(wěn)定性[20]。

2.3.2 離子液體濃度對(duì)反應(yīng)的影響

由表6可知，離子液體和緩沖液的體積比對(duì)突變株H催化苯乙酮不對(duì)稱還原反應(yīng)產(chǎn)率有明顯影響，但是對(duì)產(chǎn)物e.e.值的影響較小。當(dāng)離子液體用量由5%上升到30%，轉(zhuǎn)化率和e.e.值隨之增加；而繼續(xù)離子液體用量，會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率和e.e.值降低。離子液體最適添加體積為30%（體積分?jǐn)?shù)）。

2.4 解脂耶氏酵母突變株H不對(duì)稱還原苯乙酮

表5 有機(jī)溶劑的選擇

將30%（體積分?jǐn)?shù)）離子液體BMIM?PF6及60mmol/L苯乙酮直接添加到發(fā)酵36h的發(fā)酵液（100mL）中，于30℃反應(yīng)，考察不對(duì)稱還原的轉(zhuǎn)化過程。

表6 離子液體濃度對(duì)反應(yīng)的影響

由圖3可知，在反應(yīng)6～36h內(nèi)，轉(zhuǎn)化率由27%增加到95%，e.e.值變化不大。綜合時(shí)間、轉(zhuǎn)化率和e.e.值三方面因素，確定最佳反應(yīng)時(shí)間為36h。

圖3 解脂耶氏酵母-H不對(duì)稱還原苯乙酮的時(shí)間進(jìn)程（反應(yīng)條件：100mL發(fā)酵液（36h），苯乙酮濃度60mmol/L，BMIM?PF6 30%（體積分?jǐn)?shù)），pH=7.0，30℃，150r/min）

與其他微生物不對(duì)稱還原苯乙酮相比（表7），將苯乙酮和離子液體直接添加到發(fā)酵液中，省略收集細(xì)胞的繁瑣操作，并充分利用發(fā)酵液殘?zhí)牵忍岣叩孜锏纳陷d量（60mmol/L），又得到了較高的立體選擇性（97%）。

表7 微生物不對(duì)稱還原苯乙酮的比較

3 結(jié) 論

本文通過紫外誘變得到1株解脂耶氏酵母突變株H，通過向解脂耶氏酵母產(chǎn)酶發(fā)酵液（20mL）中直接添加30%（體積分?jǐn)?shù)）的離子液體BMIM?PF6 和60mmol/L 苯乙酮底物，30℃下催化反應(yīng)36h，(R)-苯乙醇的轉(zhuǎn)化率達(dá)95%，e.e.值達(dá)97%。突變株全細(xì)胞催化苯乙酮不對(duì)稱還原反應(yīng)，在高底物濃度、高轉(zhuǎn)化率以及高光學(xué)純度產(chǎn)物得率等方面具有突出表現(xiàn)，也為其在工業(yè)應(yīng)用和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)

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研究開發(fā)

Asymmetric reduction of acetophenone to (R)-phenyl ethanol by Yarrowia lipolytica

XU Qin，WANG Dan，XU Qing，LI Shuang
（College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech. University，Nanjing 21009，Jiangsu，China）

Abstract：In order to improve Yarrowia lipolytica’s catalytic efficiency for acetophenone ，using 20mmol/L acetophenone and 20mmol/L phenyl ethanol as screening pressure，we obtained a mutant strain through UV mutation. Then we optimized the reaction conditions，such as temperature，pH，co-substrate and organic solvents. The mutant strain Yarrowia lipolytica ACA-DC 50109-H could reduce 20mmol/L acetophenone to optical pure (R)-phenyl ethanol (76% conversion，99.2% e.e.). The optimal reaction conditions were using glucose as co-substrate，and with t=30℃，pH=7.0 and the addition of 30%(v/v) ionic liquid (BMIM?PF6). When the culture broth of Yarrowia lipolytica ACA-DC 50109-H was used as the reaction system，with the addition of 30% BMIM?PF6， 60mmol/L acetophenone could be reduced to (R)-phenyl ethanol (97.5% conversion，95% e.e.) after 36h. Yarrowia lipolytica ACA-DC 50109-H could efficiently catalyze the asymmetric reduction of α-acetophenone to (R)-phenyl ethanol with high substrate loading，high conversion and e.e..

Key words：Yarrowia lipolytica; acetophenone; (R)-phenyl ethanol; biocatalysis; enzyme; optimization

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2011CB710800）。

收稿日期：2015-05-21；修改稿日期：2015-07-30。

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.02.028

中圖分類號(hào)：Q 503

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000–6613（2016）02–0528–06