葉浩田，張琳琳，張登宇　(浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江臨安 311300)

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水稻巨大胚突變體MH-ge1的萌發(fā)生理研究

葉浩田，張琳琳*，張登宇(浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江臨安 311300)

摘要[目的] 探討水稻巨大胚突變體的萌發(fā)生理，為富含功能性成分的水稻新品種開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。[方法]研究巨大胚突變體MH-ge1及其野生型MH86在種子萌發(fā)過(guò)程中GABA及其他主要營(yíng)養(yǎng)成分、相關(guān)酶活性的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。 [結(jié)果] 與MH86相比，巨胚突變體MH-ge1的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等均明顯降低；淀粉酶活性較低，蛋白和脂肪含量較高；浸種后，突變體與野生型的GABA含量均迅速升高。[結(jié)論] 巨大胚突變體發(fā)芽勢(shì)較差，發(fā)芽率較低；巨大胚突變體發(fā)芽糙米GABA的富集與胚的大小基本成倍數(shù)關(guān)系。

關(guān)鍵詞水稻；巨大胚；萌發(fā)

稻米胚中含有豐富的生理活性成分，特別是伽瑪(γ)-氨基丁酸(Gamma Amino-Butyric Acid，GABA)具有降血壓等多種保健功能[1-4]。米胚中的蛋白質(zhì)水解后產(chǎn)生豐富的谷氨酸，繼而由谷氨酸脫羧酶(GAD)催化成GABA[3-5]。

巨大胚水稻因胚部巨大而得名，是富含多種營(yíng)養(yǎng)素的功能性專用水稻。國(guó)內(nèi)外研究表明，巨大胚水稻的種子浸水后，與普通胚水稻相比，GABA快速富集[6-7]。MH-gel是以MH86為起始材料誘導(dǎo)得到的巨大胚突變體，深入研究MH-ge1的萌發(fā)生理以便對(duì)其進(jìn)行定向改良和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，從而提高稻米的附加值。筆者通過(guò)對(duì)巨大胚突變體MH-ge1及其野生型MH86萌發(fā)生理進(jìn)行對(duì)比，探討GABA等成分的富集以及相關(guān)活性酶的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以期為富含功能性成分的水稻新品種開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料供試材料為巨大胚突變體MH-ge1及其野生型MH86。

1.2試驗(yàn)方法選取糙米籽粒200 g，用0.5%次氯酸鈉溶液消毒，常溫下浸泡24 h后，置30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)在黑暗條件下發(fā)芽，3次重復(fù)。浸種后12、24 h及置床后1～8 d每天取樣，樣品真空冷凍干燥48 h后，粉碎，過(guò)篩，密封，超低溫冰箱保存。

1.3測(cè)定項(xiàng)目與方法(1)發(fā)芽指數(shù)。參照國(guó)標(biāo)GB/T3543.4農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)。

活力指數(shù)GI=∑Gt/Dt

式中，Dt為發(fā)芽日數(shù)，Gt為發(fā)芽數(shù)。

(2)活力指數(shù)。用芽長(zhǎng)(L)和發(fā)芽指數(shù)(GI)計(jì)算活力指數(shù)(VI)。

VI=GI×L

(3)淀粉酶活性。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取6支25 mL試管，分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mL 1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，補(bǔ)水至1 mL，每只試管中加入0.5 mL 2，4-二硝基水楊酸(DNS)試劑，沸水浴反應(yīng)5 min，迅速用流水冷卻，再分別加入7 mL蒸餾水，搖勻后以未加葡萄糖為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

淀粉酶活性參照朱廣廉等[8]的測(cè)定方法。

(4)總淀粉(TS)。TS參照Garcia-Alonso等[9]的測(cè)定方法，在510 nm處測(cè)定吸光度。

(5)表觀直鏈淀粉(ACC)、總蛋白(PC)、粗脂肪(LC)和還原糖。AAC按農(nóng)業(yè)部部頒標(biāo)準(zhǔn)(NY147-88)進(jìn)行測(cè)定；PC和LC按國(guó)標(biāo)法GB/T5009.5-2003和GB/T5006.6-2003交由浙江大學(xué)飼料所測(cè)定；還原糖含量測(cè)定參照Frei等[10]方法進(jìn)行改良。

(6)谷氨酸脫羧酶(GAD)與γ-氨基丁酸(GABA)。GAD采用比色法測(cè)定；GABA采用比色法，在波長(zhǎng)645 nm處用1 cm比色皿測(cè)定吸光值。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)芽情況結(jié)果表明，巨大胚突變體MH-ge1的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著低于野生型MH86(表1)。萌發(fā)過(guò)程中，MH86與普通水稻類似，在浸種催芽24 h后即可見(jiàn)部分種子露白，突變體MH-ge1種子露白比MH86遲 1～2 d；置床后第5天，MH-gel種子萌發(fā)數(shù)明顯低于野生型，芽長(zhǎng)也更短(圖2)。

表1巨大胚突變體MH-gel和野生型MH86的發(fā)芽情況

Table 1The germination of giant embryo rice mutantMH-geland wild type MH86

注：同列不同小寫字母表示材料間差異顯著。

Note:The different small letters within the same column mean significant difference between the materials.

2.2淀粉酶活性變化在種子發(fā)芽前期和中期，突變體MH-gel和野生型MH86的α-淀粉酶活性均快速升高，發(fā)芽后期α-淀粉酶活性下降(圖3)。突變體和野生型的總淀粉酶活性與α-淀粉酶活性變化趨勢(shì)基本一致(圖4)。萌發(fā)過(guò)程中，突變體的α-淀粉酶和總淀粉酶活性均始終低于野生型，突變體的α-淀粉酶和總淀粉酶活性的最高值也均顯著低于野生型。

2.3TS、ACC、PC、LC和還原糖含量的變化巨大胚突變體MH-ge1的TS含量略低于野生型MH86。在種子萌發(fā)過(guò)程中，突變體MH-ge1和野生型MH86的TS含量均不斷降低。發(fā)芽前中期，兩者淀粉含量驟減，發(fā)芽后期下降幅度趨緩(圖5)。在整個(gè)發(fā)芽期內(nèi)，種子中TS含量隨淀粉酶活性的升高而降低，同時(shí)隨α-淀粉酶活性的升高而降低。與野生型相比，MH-ge1的TS下降速度較慢。巨大胚水稻干種子的AAC與野生型一致。浸種后，ACC含量均快速下降(圖6)。

萌發(fā)第1天，巨大胚突變體MH-ge1與野生型MH86的還原糖含量均急劇上升(圖7)，但野生型還原糖含量的上升速度比突變體快，在整個(gè)發(fā)芽過(guò)程中，野生型MH86的還原糖含量始終高于巨大胚突變體MH-ge1。這表明種子發(fā)芽過(guò)程中，隨著淀粉酶的形成和活力的提高，淀粉不斷被降解，還原糖大量生成。

突變體MH-ge1與野生型MH86浸種后PC和LC含量均降低(圖8)。隨著浸種時(shí)間的延長(zhǎng)，PC和LC含量均升高。突變體與野生型在種子發(fā)芽后其PC和LC含量略有升高。其中，干種子和種子浸水后一直到發(fā)芽第8天，突變體的PC和LC含量均高于野生型。

2.4GAD活性與GABA含量的變化浸種后，巨大胚突變體MH-ge1及其野生型MH86的GAD活性變化趨勢(shì)一致，均急劇升高(圖9)，但巨大胚突變體MH-ge1的GAD活性始終高于其野生型MH86。

巨大胚突變體MH-ge1與野生型MH86干種子的GABA含量無(wú)明顯差異，種子浸水后，兩者的GABA含量均迅速升高(圖10)。萌發(fā)過(guò)程中，GABA含量與GAD活性變化趨勢(shì)基本一致。浸水后，巨大胚突變體MH-ge1的GABA含量始終高于其野生型MH86，且基本成倍數(shù)關(guān)系。

3結(jié)論與討論

該研究表明，在種子萌發(fā)過(guò)程中，巨大胚突變體的淀粉酶活性始終低于MH86，同時(shí)最大值也相對(duì)較低，且MH86出現(xiàn)時(shí)間稍遲，從而導(dǎo)致其發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率等指標(biāo)均明顯低于MH86。

除淀粉酶外，萌發(fā)過(guò)程中還有蛋白水解酶、脂肪酶等形成。而MH-ge1在整個(gè)發(fā)芽過(guò)程中具有相對(duì)較高的蛋白和脂肪含量，推測(cè)可能是蛋白水解酶和脂肪酶的形成和活性受到了某種抑制。

與干種子相比，發(fā)芽糙米的GABA急劇富集。谷氨酸是種子浸水后含量最高的氨基酸[7，11]，在GAD的催化作用下大量形成GABA。浸水后，MH-ge1及其野生型GAD活性明顯增強(qiáng)，GABA含量也迅速升高；浸水12 h后，雖然GAD活性稍有下降，但GABA繼續(xù)緩慢富集。推測(cè)可能是源于干種子胚中束縛態(tài)GABA的釋放。與MH86相比，巨大胚突變體MH-ge1種子的胚增大2倍，而該試驗(yàn)結(jié)果也表明，巨大胚突變體與野生型在種子發(fā)芽過(guò)程中，無(wú)論是GAD活性還是GABA含量基本成倍數(shù)關(guān)系。

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The Physiological Effect during Germination of the Giant Embryo Rice MutantMH-ge1

YE Hao-tian, ZHANG Lin-lin*, ZHANG Deng-yu

(School of Agricultural and Food Science, Zhejiang A&FUniversity, Lin’an,Zhejiang 311300)

Key wordsRice; Giant embryo; Germination

Abstract[Objective]The aim was to explore the physiological effect during germination of the giant embryo rice mutant, and provide scientific basis for development and utilization of rice new varieties containing abundant functional components. [Method] Using the giant embryo rice mutantMH-ge1 and its wild type MH-86 as the materials, we observed the process of seeds’ germination to understand the dynamic variation regularity of nutritional components including GABA and some related active enzymes. [Result]There were lower indexes on the germinating energy, germination percentage, germination index, vigor index ofMH-ge1; amylase activity ofgiant embryo was lower, and there were higher volume of protein and fat. After soaking, the amount of GABA inMH-ge1 and MH86 was increased rapidly. [Conclusion]The mutant has the lower germinating energy and germination percentage; GABA gathering in the germinated brown rice of the mutants has multiple relationship to the size of embryo.

基金項(xiàng)目浙江省教育廳項(xiàng)目(Y201326580)。

作者簡(jiǎn)介葉浩田(1995-)，男，浙江金華人，本科生，專業(yè)：農(nóng)學(xué)。*通訊作者，講師，博士，從事作物品質(zhì)與成分改良研究。

收稿日期2016-02-10

中圖分類號(hào)S 188

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)07-111-03