黃鳳蘭,雷　雪,趙　永,李國(guó)瑞,羅　蕊,陳曉鳳,李　躍,孫華軍

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 通遼　028000;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心,

內(nèi)蒙古 通遼　028000;3.東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱　150036)

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毒蛋白A鏈基因被共抑制的蓖麻種子中毒蛋白含量的測(cè)定

黃鳳蘭1,2,雷雪1,3,趙永1,李國(guó)瑞1,2,羅蕊1,陳曉鳳1,李躍1,孫華軍1

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 通遼028000;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心,

內(nèi)蒙古 通遼028000;3.東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱150036)

摘要：為了獲得毒蛋白含量低的蓖麻轉(zhuǎn)基因新材料，以毒蛋白A鏈基因被共抑制的轉(zhuǎn)基因蓖麻植株的T0、T1、T2種子為研究對(duì)象，對(duì)種子中的毒蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，采用磷酸鹽提取法、BCA試劑盒、UVwin5紫外軟件V5.1.0、BandScan蛋白定量分析軟件相結(jié)合的方法，測(cè)定種子中毒蛋白含量，獲得了2個(gè)共抑制后穩(wěn)定遺傳的材料，即T2-9-1、T2-15，毒蛋白A鏈含量均為0，毒蛋白B鏈含量分別為對(duì)照通蓖5號(hào)的77.63%，83.38%。這2個(gè)材料可以作為低毒蛋白含量的蓖麻材料進(jìn)行推廣。

關(guān)鍵詞：蓖麻;毒蛋白;A鏈基因

蓖麻(RicinuscommunisL.)是世界上一種重要的油料作物[1-3]。中國(guó)作為世界第二大蓖麻生產(chǎn)國(guó),已有 1400多年的種植歷史,集約化栽培地區(qū)有內(nèi)蒙古、吉林、遼寧、山西、陜西等省區(qū),蓖麻種子年收購(gòu)量超過(guò)27.5萬(wàn)t[4]。對(duì)蓖麻的研究處于世界領(lǐng)先水平,蓖麻種子榨油后的副產(chǎn)物——蓖麻餅粕占蓖麻種子的50%以上,隨著蓖麻油需求量的增長(zhǎng),也伴隨著產(chǎn)生大量餅粕[5]。因此，對(duì)其綜合開發(fā)利用可變廢為寶,創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)效益,對(duì)推動(dòng)蓖麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有積極的作用[6]。蓖麻餅粕中含有豐富的蛋白質(zhì),粗蛋白含量達(dá)33%~35%,為糧食作物的3倍。蓖麻蛋白絕大部分可被動(dòng)物消化吸收利用[7],因此,開發(fā)蓖麻餅粕作為畜禽蛋白飼料,可充分利用其中的蛋白質(zhì),增加飼料行業(yè)的蛋白質(zhì)資源。但蓖麻餅粕中含有蓖麻堿、毒蛋白、凝集素、變應(yīng)原等毒素[7-8],而未經(jīng)脫毒的蓖麻餅粕不能直接用于配合飼料。目前,國(guó)內(nèi)開發(fā)研究蓖麻餅粕作為畜禽蛋白飼料途徑主要采用物理、化學(xué)、微生物方法脫毒[9-10],這些方法消耗大量的人力和能源,限制了蓖麻餅粕的廣泛利用。

蓖麻餅粕所含的毒性物質(zhì)中蓖麻毒蛋白的毒性最強(qiáng)、含量最高。蓖麻毒蛋白相對(duì)分子量約 64.0 kDa,由A、B兩條鏈構(gòu)成,其毒性部分A鏈分子量為 32.0 kDa,是一種N-糖苷酶,可失活60S核糖體,導(dǎo)致真核細(xì)胞的死亡,是活性鏈;B鏈分子量為 34.0 kDa,是一種半乳糖結(jié)合型蛋白,幾乎可與所有的真核細(xì)胞上半乳糖殘基相結(jié)合,是運(yùn)載體;A、B鏈通過(guò)二硫鍵相連[11-12]。曾佑煒等[13]曾測(cè)定過(guò)蓖麻種子中毒蛋白的含量,Huang等[14]對(duì)通遼地區(qū)的蓖麻品種種子中的毒蛋白含量進(jìn)行了定量測(cè)定;趙志強(qiáng)等[15]對(duì)蓖麻不同部位葉柄中的毒蛋白含量進(jìn)行了測(cè)定;羅蕊等[16]對(duì)蓖麻組培苗不同部位葉片中毒蛋白含量進(jìn)行了測(cè)定;黃鳳蘭等[17]對(duì)不同發(fā)育時(shí)間蓖麻鮮種子中的毒蛋白含量進(jìn)行了測(cè)定。但是對(duì)毒蛋白A鏈基因被共抑制的轉(zhuǎn)基因蓖麻種子中毒蛋白含量測(cè)定的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心克隆了蓖麻毒蛋白A鏈基因，采用共抑制技術(shù)，構(gòu)建含有蓖麻毒蛋白A鏈基因的反向重復(fù)表達(dá)載體，對(duì)通蓖5號(hào)蓖麻進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了毒蛋白A鏈基因表達(dá)被抑制的蓖麻轉(zhuǎn)基因植株。本試驗(yàn)的目的就是對(duì)所獲得的T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因植株種子中的毒蛋白含量進(jìn)行測(cè)定,這將為獲得低毒的蓖麻轉(zhuǎn)基因品種奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

待檢測(cè)材料:毒蛋白A鏈基因被共抑制的轉(zhuǎn)基因蓖麻植株的T0、T1、T2種子;對(duì)照材料:通蓖5號(hào)蓖麻種子。由內(nèi)蒙古民族大學(xué)的內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心提供。

儀器:Eppendorf移液槍,德國(guó);Hema冷凍離心機(jī),珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司;BCD-556WSDH型冰箱,澳柯瑪股份有限公司;BSA224S-CW型電子天平,賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;pHS-3C精密pH計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司;DYY-6C型電泳儀,北京六一儀器廠;恒溫干燥箱,精宏有限公司;格蘭仕微電腦-CH2082型電磁爐,中山市格蘭仕生活電器制造有限公司;WD-9406型膠片觀察燈,北京六一儀器廠;漩渦振蕩儀,上海大有儀器;900 SERIES型超低溫冰箱,美國(guó)Thermo;紫外分光光度計(jì),上海譜元儀器有限公司。

藥品:磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、氯化鈉(NaCl)、N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(BIS)、丙烯酰胺(Acrylamide)、三羥甲基氨基甲烷(Tris-Base)、濃鹽酸(HCl)、過(guò)硫酸銨((NH4)2S2O8)、硫酸銨((NH4)2SO4)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、甘氨酸(Gly)、低分子量蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(非預(yù)染,Protein Marker)、冰乙酸(CH3COOH)、乙醇(C2H5OH)、考馬斯亮藍(lán)R-250(C47H48N307S2Na)、異丙醇((CH3)2CHOH)、聚乙二醇(PEG8000)、甘油(C3H8O3)、溴酚藍(lán)(C19H10Br4O5S)、BCA蛋白定量試劑盒等,均購(gòu)于北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司。液氮,購(gòu)于通遼市通達(dá)氣體公司。

試劑:緩沖液A(磷酸緩沖液PBS,含100 mmol/L NaCl,pH=6.5)、30%(m/V)凝膠貯液、10%(m/V)過(guò)硫酸銨、1.5 mol/L Tris-HCl (pH=8.8)、1 mol/L Tris-HCl (pH=6.8)、10%(m/V)SDS、5×SDS-PAGE Loading Buffer、1×Tris-Glycine Buffer、考馬斯亮藍(lán)R-250染色液、考馬斯亮藍(lán)脫色液。

用具:離心管(100，500，1 000 μL)、研缽、研錘、刀片、MD25 mm透析袋(MW8000-14000)、培養(yǎng)皿、燒杯、量筒、玻璃棒、容量瓶。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子中粗蛋白含量測(cè)定毒蛋白A鏈基因被共抑制的T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子中粗蛋白的提取、蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作、粗蛋白濃度的測(cè)定、粗蛋白含量的計(jì)算,均參照黃鳳蘭等[17]對(duì)不同發(fā)育時(shí)間蓖麻鮮種子中毒蛋白含量的測(cè)定方法進(jìn)行。

1.2.2T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子中毒蛋白含量測(cè)定粗蛋白的SDS-PAGE電泳、毒蛋白條帶灰度百分比分析、毒蛋白含量的計(jì)算與分析,均參照黃鳳蘭等[10]對(duì)不同發(fā)育時(shí)間蓖麻鮮種子中毒蛋白含量的測(cè)定方法進(jìn)行。

1.2.3數(shù)據(jù)分析用IBM SPSS Statistics軟件,分析T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子質(zhì)量、種仁質(zhì)量、粗蛋白含量、毒蛋白含量的均值、標(biāo)準(zhǔn)誤、差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子中粗蛋白含量測(cè)定結(jié)果

2.1.1粗蛋白提取結(jié)果毒蛋白A鏈基因被共抑制的單粒T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻的種子質(zhì)量、種仁質(zhì)量和得到的粗蛋白體積見(jiàn)表1。

從表1可以看出,單粒T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻的種子質(zhì)量、種仁質(zhì)量和得到的粗蛋白體積與對(duì)照通蓖5號(hào)相比,均在0.01水平上,差異顯著。單粒T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻的種子質(zhì)量波動(dòng)范圍分別為0.275 4~0.281 6，0.276 6~0.286 7，0.284 5~0.289 1 g;T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻的種仁質(zhì)量波動(dòng)范圍分別為0.206 6~0.211 2，0.207 5~0.215 0,0.213 4~0.216 8 g。

表1　轉(zhuǎn)基因蓖麻種子中粗蛋白提取結(jié)果

注：數(shù)據(jù)采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行均值和標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算，不同字母表示在1%水平上顯著性差異。表2,4同。

Note:The data use Duncan′s new multiple range method to count the mean and the standard deviation.Different letters mean significant difference at 1% level.The same as Tab.2,4.

2.1.2蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作結(jié)果根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明,得出濃度計(jì)算公式:C=k1×(Abs)+k0,其校正方法為濃度法,k0=-0.080 91,k1=0.982 79,相關(guān)性為0.999 7,測(cè)量波長(zhǎng)為562.0 nm。從GeneQuant 1300儀器上得出的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。從圖1可以看出,所制作的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線能達(dá)到要求。

2.1.3粗蛋白含量測(cè)定結(jié)果毒蛋白A鏈基因被共抑制的單粒T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子粗蛋白稀釋100倍后測(cè)定的Abs值、根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線折算出稀釋100倍后粗蛋白的濃度,計(jì)算出蓖麻種子中粗蛋白的含量,見(jiàn)表2。

從表2可以看出:單粒T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子的粗蛋白含量與對(duì)照通蓖5號(hào)相比,均在0.01水平上,差異顯著。單粒T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子的粗蛋白含量波動(dòng)范圍分別為2.901 3~3.540 1，3.110 4~3.713 2,3.496 3~3.587 7 mg。

圖1　蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

樣品編號(hào)SampleNo.稀釋100后Abs/(μg/μL)Diluted100rearAbs稀釋100倍后濃度/(μg/μL)Afterthe100timesdilutedconcentration粗蛋白含量/mgThecontentofcrudeproteinofaseedT0T0-90.1223±0.0006B0.0393±0.0002B3.5401±0.0098BT0-150.1176±0.0013A0.0347±0.0003A2.9013±0.0004A通蓖5號(hào)0.1783±0.0011C0.0943±0.0017C9.4394±0.0015CT1T1-9-10.1254±0.0014B0.0423±0.0017B3.6880±0.0133BT1-9-40.1252±0.0009B0.0421±0.0007B3.7132±0.0007BT1-150.1198±0.0008A0.0369±0.0006A3.1104±0.0061A通蓖5號(hào)0.1781±0.0018C0.0941±0.0016C9.3746±0.0118CT2T2-9-10.1241±0.0010A0.0411±0.0007A3.4963±0.0086AT2-150.1249±0.0014A0.0419±0.0009A3.5877±0.0019B通蓖5號(hào)0.1773±0.0005B0.0933±0.0006B9.4520±0.0075C

2.2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子中毒蛋白含量測(cè)定結(jié)果

2.2.1粗蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果毒蛋白A鏈基因被共抑制的單粒T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子粗蛋白SDS-PAGE電泳,結(jié)果見(jiàn)圖2。

從圖2可以看出,電泳結(jié)果清晰,可被用于BandScan蛋白定量分析軟件進(jìn)行分析。

M.蛋白Marker;A:1.T0-9,2.T0-15,3.通蓖5號(hào);B:1.T1-9-1,2.T1-9-4,3.T1-15,4.通蓖5號(hào);C:1.T2-9-1,2.T2-15,3.通蓖比5號(hào)。

2.2.2蛋白條帶灰度分析毒蛋白A鏈基因被共抑制的單粒T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子粗蛋白SDS-PAGE電泳后,每種蛋白條帶的灰度值用BandScan蛋白定量分析軟件進(jìn)行分析的結(jié)果見(jiàn)圖3,種子中每種蛋白灰度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

圖3　T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子粗蛋白中每種蛋白質(zhì)灰度分析

條帶序號(hào)StripsNo.T0T1T2MarkerT0-9T0-15通蓖5號(hào)Tongbi5MarkerT1-9-1T1-9-4T1-15通蓖5號(hào)Tongbi5MarkerT2-9-1T2-15通蓖5號(hào)Tongbi5171595721201181171041051051031111111123139139136121123123120132134132416214614616351921772016206179178214215721518923082352092459242212263102592283081130931131026631431431512330269340132712732721428015290總灰度值Totalgrayvalue754799449160966064697984914147278027601622

從圖3、表3可以看出:T0-9的種子中毒蛋白A鏈條帶灰度為0,B鏈條帶灰度為311;T0-15的種子中毒蛋白A鏈條帶灰度為0,B鏈條帶灰度為0;對(duì)照通蓖5號(hào)的種子中毒蛋白A鏈條帶灰度為330,B鏈條帶灰度為310。T1-9-1的種子中毒蛋白A鏈條帶灰度為0,B鏈條帶灰度為273;T1-9-4的種子中毒蛋白A鏈條帶灰度為280,B鏈條帶灰度為269;T1-15的種子中毒蛋白A鏈條帶灰度為0,B鏈條帶灰度為266;對(duì)照通蓖5號(hào)的種子中毒蛋白A鏈條帶灰度為290,B鏈條帶灰度為272。T2-9-1的種子中毒蛋白A鏈條帶灰度為0,B鏈條帶灰度為314;T2-15的種子中毒蛋白A鏈條帶灰度為0,B鏈條帶灰度為314;對(duì)照通蓖5號(hào)的種子中毒蛋白A鏈條帶灰度為340,B鏈條帶灰度為315。

2.2.3毒蛋白含量測(cè)定結(jié)果根據(jù)BandScan蛋白定量分析軟件的3次分析表明,得到單粒T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因蓖麻種子中毒蛋白含量占粗蛋白含量百分比,并計(jì)算出種子中的毒蛋白含量,結(jié)果見(jiàn)表4。

從表4可以看出,T0-9、T1-9-1、T2-9-1對(duì)應(yīng)的材料在3個(gè)世代中毒蛋白A鏈的含量均為0,共抑制后穩(wěn)定遺傳;T1-9-4對(duì)應(yīng)試料在T1毒蛋白A鏈的含量不為0,共抑制后不穩(wěn)定遺傳,所以沒(méi)有進(jìn)行T2的檢測(cè);T0-15、T1-15、T2-15對(duì)應(yīng)的材料在3個(gè)世代中毒蛋白A鏈的含量均為0,共抑制后穩(wěn)定遺傳。到T2，T2-9-1、T2-15這2個(gè)材料毒蛋白A鏈的含量均為0，并且B鏈含量比對(duì)照通蓖5號(hào)低，分別為通蓖5號(hào)B鏈含量的77.63%(4.773 9/6.149 4)、83.38%(5.127 6/6.149 4)，因此T2-9-1、T2-15這2個(gè)材料可以作為低毒蛋白含量的蓖麻材料進(jìn)行推廣。

表4　轉(zhuǎn)基因蓖麻種子中毒蛋白含量測(cè)定結(jié)果

3結(jié)論與討論

蓖麻是一種重要的油料作物，種子中含有毒素物質(zhì)，限制了餅粕的廣泛利用，其中蓖麻毒蛋白的毒性最強(qiáng)含量最高。本實(shí)驗(yàn)以毒蛋白A鏈基因被共抑制的轉(zhuǎn)基因蓖麻植株的種子為研究對(duì)象，利用磷酸鹽提取法、BCA試劑盒、UVwin5紫外軟件V5.1.0、BandScan蛋白定量分析軟件相結(jié)合的方法，測(cè)定T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因植株種子中毒蛋白含量，為獲得毒蛋白含量低的蓖麻轉(zhuǎn)基因新材料奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)結(jié)果如下：獲得了2個(gè)共抑制后穩(wěn)定遺傳的材料，即T2-9-1、T2-15，毒蛋白A鏈含量均為0，毒蛋白B鏈分別為對(duì)照通蓖5號(hào)的77.63%,83.38%，這2個(gè)材料可以作為低毒蛋白含量的蓖麻材料進(jìn)行推廣。

本試驗(yàn)所用材料是毒蛋白A鏈基因被共抑制的轉(zhuǎn)基因蓖麻植株的種子，該種子的種子質(zhì)量、種仁質(zhì)量均比對(duì)照通蓖5號(hào)的值要低，主要原因是毒蛋白A鏈基因不表達(dá)、B鏈基因表達(dá)量也降低，使得種子內(nèi)的總蛋白含量減少，進(jìn)而使得種子質(zhì)量、種仁質(zhì)量降低。與黃鳳蘭、雷雪等[17-18]在對(duì)不同發(fā)育時(shí)間蓖麻鮮種子和單粒蓖麻種子中毒蛋白含量的測(cè)定研究中相同，測(cè)定的也是單粒蓖麻種子中毒蛋白的含量，所以在試驗(yàn)操作過(guò)程中，應(yīng)盡量減小誤差，可通過(guò)種子充分研磨、盡量收集研缽和研錘上的蛋白質(zhì)、充分溶解蛋白質(zhì)、硫酸銨沉淀完全等方式進(jìn)行。對(duì)單粒蓖麻種子中毒蛋白含量進(jìn)行測(cè)定時(shí)粗蛋白的提取過(guò)程，必須要比從大量蓖麻種子中提純蓖麻毒蛋白時(shí)粗蛋白的提取過(guò)程更加嚴(yán)格[19-21]。

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Determination of Toxic Protein Ricin a Chain Gene was Co-suppression of Seed Poisoning Protein Content

HUANG Fenglan1,2,LEI Xue1,3,ZHAO Yong1,LI Guorui1,2,LUO Rui1,CHEN Xiaofeng1,LI Yue1,SUN Huajun1

(1.School of Life Science,Inner Mongolia University for Nationalities,Tongliao028000,China 2.Inner Mongolia Industrial Engineering Research Center of Universities for Castor,Tongliao028000,China;3.School of Life Sciences,Northeast Forestry University,Harbin150036,China)

Abstract：The purpose of this experiment was to a chain gene toxic protein was co-suppressed in transgenic castor plants T0,T1,T2seeds were determination of toxic protein content,obtain a low content of toxic protein ricin new transgenic material to lay the foundation.The results were as follows:we used phosphate extraction method,BCA kit method,UVwin5,ultravioletV5.1.0,BandScan protein quantitative analysis.,after obtained the two co-suppression stable genetic material,nameed T2-9-1,T2-15,A chain toxin protein content were 0.Contrast Tongliao 5 ricin B chain respectively 77.63%,83.38%,both materials could be used as low-toxic protein ricin material to promote.

Key words:Castor;Ricin;A chain gene

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.005

中圖分類號(hào)：S565.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-7091(2016)01-0029-06

作者簡(jiǎn)介：黃鳳蘭(1973-),女,山東菏澤人,教授,博士,主要從事蓖麻分子育種研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30760123;31160290;31460353);國(guó)家農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)項(xiàng)目(201003057);內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?！扒嗄昕萍加⒉胖С钟?jì)劃”(NJYT-14-A10);內(nèi)蒙古自治區(qū)科技創(chuàng)新引導(dǎo)獎(jiǎng)勵(lì)資金項(xiàng)目(201506)；內(nèi)蒙古自治區(qū)“草原英才”計(jì)劃項(xiàng)目(201511)；市校合作項(xiàng)目(SXZD2012018);內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心開放基金項(xiàng)目(BMYJ2011009)

收稿日期：2015-09-14