陳磊，彭靜靜，滕建文，黃麗（廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧530004）

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蒼梧六堡茶與其他茶葉中酚酸的對比研究

陳磊，彭靜靜，滕建文，黃麗*
（廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧530004）

摘要：選取蒼梧盒裝六堡茶、竹簍裝六堡茶、云南普洱茶、桂平綠茶，以及福建烏龍茶作為研究對象，旨在探討蒼梧六堡茶與其他茶葉中酚酸含量及種類的不同。通過分離提取，結果說明了蒼梧六堡茶的酚酸含量比云南普洱茶要高，比桂平綠茶和福建烏龍茶要低。其中蒼梧盒裝六堡茶、桂平綠茶和福建烏龍茶的50 %甲醇洗脫液中酚酸純度最高，分別為34.1%、60.0%、66.3%；蒼梧竹簍裝六堡茶的100%甲醇洗脫液中酚酸純度最高，為36.8%；云南普洱茶的10%甲醇洗脫液中酚酸純度最高，為17.8%。最后用HPLC分析檢測酚酸，結果表明蒼梧竹簍裝六堡茶中存在兩種含量較高的特征性酚酸，而云南普洱茶中也存在一種含量較高的特征性酚酸。相對于桂平綠茶和福建烏龍茶，屬于黑茶的蒼梧六堡茶和云南普洱茶中酚酸含量較少，但卻存在一些含量較多的特征性酚酸。

關鍵詞：六堡茶；酚酸；分離純化；色譜分析

茶多酚（Tea Po1yphenol，TPP）是一種稠環(huán)芳香烴，是茶葉中多酚類物質的總稱，在茶葉中的含量一般為20 %～35 %，可分為黃烷醇類（其中兒茶素約占多酚類總量的60 %~80 %）、黃酮醇類、黃酮類、花色苷類（花青素、花白素等）和酚酸類（包括酚酸及縮酚酸）等。其中酚酸是一類分子中含有羧基和羥基的芳香族化合物；縮酚酸是由酚酸上的羧基與另一分子酚酸上的羥基相互作用縮合而成。茶葉中含有的酚酸和縮酚酸類化合物，經(jīng)紙層析分離與鑒定，它們多為沒食子酸、咖啡酸、雞納酸的縮合衍生物，總量大約占茶鮮葉干重的5 %[1]。在茶葉生化研究中，沒食子酸作為黑茶尤其是普洱茶中的特征性酚類物質受到關注。沒食子酸是茶多酚的重要組成單元，微生物分解和EGCG等酯型兒茶素的氧化分解等均能導致茶葉中沒食子酸含量的增加[2]。

六堡茶的滋味物質主要是茶葉多酚類及其衍生物、氨基酸、咖啡堿和糖類等。黑茶中保留的多酚類物質較少，多數(shù)為游離型兒茶素，故苦澀味較輕。由于多酚類物質和辛辣的茶黃素（兒茶素的氧化物）較少，而刺激性較弱的茶紅素、茶褐素含量較多，因而使黑茶滋味變得醇和。目前對六堡茶的研究主要為基本的理化特性和生產(chǎn)工藝的優(yōu)化兩方面，對于六堡茶中酚酸類物質的深入研究鮮見報道。因此本文從六堡茶酚酸的提取、分離純化、測定及與其他茶樣的對比等方面做了更加系統(tǒng)的研究，從而為六堡茶的風味功能研究和市場開發(fā)利用提供更全面的科學參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗原料

蒼梧盒裝六堡茶（緊壓餅茶，2006年生產(chǎn)）、蒼梧竹簍裝六堡茶（緊壓茶餅，產(chǎn)期未標注）：蒼梧六堡茶茶業(yè)有限公司；云南普洱茶（緊壓餅茶，2009年生產(chǎn)）：昆明新購商貿有限公司；桂平綠茶（散茶，2010年生產(chǎn)）：桂平市西山碧香茶廠；福建烏龍茶（散茶，2010年生產(chǎn)）：南寧市綠野茶業(yè)有限責任公司。茶樣的預處理參照GB/T 8303-2013《茶磨碎試樣的制備及其干物質含量測定》[3]。

1.1.2試驗儀器

RE-52AA型旋轉蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；SB-5200DT型超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；MJ-250PP018型榨汁攪拌機：廣東美的生活電器制造有限公司；LD10-2.4A型高速離心機：北京醫(yī)用離心機廠；721W型可見分光光度計：上海光學儀器廠；Series 200型高效液相色譜儀：PerkinElmer公司；60目和100目的標準檢驗篩（孔徑分別為0.3mm和0.15mm）：浙江上虞市道墟開發(fā)篩具廠。

1.1.3藥品試劑

甲醇（AR，色譜純）、鹽酸、二水鎢酸鈉（AR）：國藥集團化學試劑有限公司；HP-20大孔吸附樹脂、磷酸、一水合硫酸鋰、溴水、無水乙醇、乙酸乙酯、氫氧化鈉（AR）：廣東光華化學廠有限公司；鉬酸鈉（AR）：廣東臺山化工廠；沒食子酸（AR）：上海潤捷；無水碳酸鈉（AR）：廣州醫(yī)藥站化學試劑綜合公司。

1.2方法

1.2.1茶葉干物質含量的測定

將稱量皿預處理并采用103℃恒重法計算茶葉的干物質含量[3-4]。

1.2.2茶多酚總量的測定

采用Folin-Ciocalteu法[5]測定茶多酚含量。

1.2.3酚酸類物質的提純及分離測定

1.2.3.1酚酸類物質的提取

酚酸（酸性酚）用70 %的乙醇提取和乙酸乙酯分離萃取[6]。

1.2.3.2酚酸類物質的洗脫分離

HP-20大孔吸附樹脂的預處理參照文獻[7]。先用兩個柱體積（即2×90 mL）的蒸餾水洗滌樹脂，除去一些氨基酸、多糖類的大分子物質。再分別用兩個柱體積10 %、30 %、50 %、100 %的甲醇對各個茶樣進行逐級洗脫，洗脫速度約為2 mL/min。收集不同濃度甲醇洗脫得到的洗脫液，記錄體積。測定所得洗脫液的干物質含量和吸光度，再計算洗脫分離后各個茶樣液中酚酸類物質的純度。

1.2.3.3酚酸純度的計算

式中：A為樣品測試液吸光度；V為樣品提取液體積或甲醇洗脫液體積，mL；d為稀釋因子；SLOPEStd為沒食子酸標準曲線的斜率；m2為5 mL甲醇提取液或甲醇洗脫液的可溶性固形物含量，g。

1.2.3.4酚酸類物質的色譜分析

經(jīng)過大孔吸附樹脂提純后得到的甲醇洗脫液，取各個茶樣中酚酸純度最高的洗脫液旋轉蒸發(fā)至近干，用甲醇（色譜純）溶解定容至5.0 mL。經(jīng)有機系微膜（0.22 μm）過濾后，待分析。高效液相色譜條件為：（1）色譜柱：Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；（2）流速：1.0mL/min；（3）柱溫：25℃；（4）檢測波長：320nm[8]；（5）進樣體積：5 μL；（6）流動相：以0.1 %磷酸溶液為流動相A，甲醇為流動相B；（7）梯度洗脫具體如表1所示。

表1梯度洗脫程序Table 1 Gradient Dilution Program

2結果與分析

2.1 5種茶樣中茶多酚的總量分析

2.1.1沒食子酸標準曲線方程

以吸光值（A765 nm）為縱坐標，以沒食子酸濃度（μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，得出回歸方程y= 0.013 8x+0.007 6，R2=0.999 5。

2.1.2各茶樣的干物質含量及茶多酚總量

按1.2.1和1.2.2的方法分別測定蒼梧盒裝六堡茶、蒼梧竹簍裝六堡、云南普洱茶、桂平綠茶及福建烏龍的干物質含量m（%）和茶多酚含量（干基），具體結果見表2。

表2各種茶樣的干物質含量及茶多酚總量Table 2 The dry matter content and tea polyphenols content of different tea

從茶葉的干物質含量看，屬于后發(fā)酵茶的蒼梧六堡茶和云南普洱茶比福建烏龍茶和桂平綠茶要低；但蒼梧盒裝六堡茶比竹簍裝六堡茶高，保留了更多的成分。從茶多酚總含量測定結果可知，蒼梧盒裝六堡茶比竹簍裝六堡茶高6.5 %，保留了更多的茶多酚；蒼梧盒裝六堡茶要比桂平綠茶（非發(fā)酵茶）和福建烏龍茶（半發(fā)酵茶）低一些，但明顯比同是黑茶的云南普洱茶（發(fā)酵茶）高出7.1 %。

2.2酚酸的純度及含量計算

按1.2.3.2的方法用HP-20大孔吸附樹脂和不同濃度的甲醇將酚酸類物質洗脫分離后，測定其干物質含量并再按1.2.3.3的方法計算純度，具體結果見表3。

表3不同甲醇洗脫液的酚酸純度Table 3 The purity of phenolic acid in different concentrations

從表3可以看出，在5種茶樣提取液進入液相分析前，先用大孔吸附樹脂提純，結果表明，蒼梧盒裝六堡茶、桂平綠茶和福建烏龍茶的50 %甲醇洗脫液中酚酸純度最高，蒼梧竹簍裝六堡茶的100 %甲醇洗脫液中酚酸純度最高，云南普洱茶的10 %甲醇洗脫液中酚酸純度最高，其酚酸純度分別為34.1 %，60.0 %，66.3 %，36.8 %和17.8 %，表明蒼梧六堡茶的酚酸含量比云南普洱茶要高，比桂平綠茶和福建烏龍茶要低。

2.3 5種茶樣中酚酸類物質的色譜分析

2.3.1分析樣液的預處理

將5種茶葉的50 %甲醇洗脫液、蒼梧竹簍裝六堡茶100 %甲醇洗脫液和云南普洱茶10 %甲醇洗脫液共7個洗脫液蒸發(fā)至近干，用色譜純甲醇定容至5 mL，經(jīng)有機系微膜（0.22 μm）過濾后，待分析。

2.3.2液相合并圖譜分析

將5種茶葉中酚酸純度最高的甲醇洗脫液的HPLC圖譜合并起來，得到圖1。按照1.2.3.4酚酸類物質的色譜分析法，對2.3.1中7個待測液的計算機合并圖譜分析如圖1所示。

圖1 5種茶葉的合并圖譜Fig.1 The HPLC chromatograms of five different tea

根據(jù)圖譜分析得出：（1）桂平綠茶和福建烏龍茶的50 %甲醇洗脫液均在第23、29、36、43 min有4個顯著的峰值（圖中的2號、3號、4號和5號峰）；從保留時間上看，這兩種茶葉中主要酚酸類物質的種類基本一致。（2）云南普洱茶的10 %甲醇洗脫液和50 %甲醇洗脫液均在第6 min有一個明顯而獨特的峰值（圖中的1號峰），說明云南普洱茶中該種特征性酚酸的含量比其他4種茶樣都要高。（3）蒼梧盒裝六堡茶和竹簍裝六堡茶的50 %甲醇洗脫液均在第43 min有一個顯著的峰值（圖中的4號峰），說明蒼梧六堡茶與桂平綠茶、福建烏龍茶含有同種酚酸類物質。（4）蒼梧竹簍裝六堡茶的100 %甲醇洗脫液在第44、45 min有兩個明顯而獨特的峰值（圖中的6號和7號峰），說明蒼梧竹簍裝六堡茶中這兩種特征性酚酸的含量比其他4種茶樣都要高。以上結果提示，雖然相對于桂平綠茶和福建烏龍茶，屬于黑茶的蒼梧六堡茶和云南普洱茶中酚酸含量較少，但卻存在一些含量較多的特征性酚酸。

3　總結

通過分析測定，我們發(fā)現(xiàn)蒼梧六堡茶的酚酸含量比云南普洱茶要高，比桂平綠茶和福建烏龍茶要低。其中蒼梧盒裝六堡茶、桂平綠茶和福建烏龍茶的50 %甲醇洗脫液中酚酸純度最高，分別為34.1 %、60.0 %、66.3 %；蒼梧竹簍裝六堡茶的100 %甲醇洗脫液中酚酸純度最高，為36.8 %；云南普洱茶的10 %甲醇洗脫液中酚酸純度最高，為17.8 %。最后利用HPLC法分析了每種茶樣中具有的特殊酚酸，結果表明蒼梧竹簍裝六堡茶中存在兩種含量較高的特征性酚酸，而云南普洱茶中也存在一種含量較高的特征性酚酸。結果提示，相對于桂平綠茶和福建烏龍茶，屬于黑茶的蒼梧六堡茶和云南普洱茶中酚酸含量較少，但卻存在一些含量較多的特征性酚酸。

4　討論

4.1影響黑茶中茶多酚含量的主要因素

黑茶中的茶多酚含量與其制作過程中的發(fā)酵作用和貯藏過程中的溫度、濕度、光線以及包裝材料等密切相關[9-12]。因為在發(fā)酵過程中，微生物所分泌的多酚氧化酶，促進了茶葉中多酚類物質的氧化，氧化產(chǎn)物進而聚合生成與茶湯品質特征相關的化學物質。隨著發(fā)酵的不斷進行，茶多酚的含量就越少，故試驗中所選取的黑茶（蒼梧六堡茶和云南普洱茶）的茶多酚含量比非發(fā)酵桂平綠茶以及半發(fā)酵福建烏龍茶的茶多酚含量少。另外，由于竹簍有空隙，使得茶葉在貯藏過程中接觸空氣的時間較長，受到溫度、濕度等環(huán)境因素的影響較大，所以蒼梧竹簍裝六堡茶的茶多酚含量比蒼梧盒裝六堡茶的茶多酚含量低。但是蒼梧竹簍裝六堡茶的茶多酚總量卻比云南普洱茶的高0.6 %，有可能是因為云南普洱茶的發(fā)酵更為徹底。

4.2酚酸的提純機理及效果探討

在純化酚類物質時，HP-20大孔樹脂[13]通過與茶多酚提取液中有機物疏水部分的相互作用來吸附茶多酚類物質（酚酸等）；水洗完畢后采用非極性的甲醇有機溶劑作為洗脫液，其中疏水性較弱的物質與樹脂的吸附作用較小，就先被甲醇洗脫出來，后面隨著甲醇洗脫液濃度的提高，疏水性較強的物質就被慢慢洗脫出來，從而達到分離提純的效果。然而，實驗中云南普洱茶各個濃度的甲醇洗脫液的酚酸純度均比使用大孔樹脂分離純化前要低，有可能是因為甲醇將普洱茶中的酚酸類物質分散洗脫于各個濃度梯度里，使得普洱茶中的酚酸類物質無法集中到一個濃度的甲醇里，所以酚酸純度比過柱前有所下降。

參考文獻：

[1]宛曉春.茶葉生物化學[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2003:8-21

[2]陳小強,葉陽,成浩,等.三類茶中茶氨酸、咖啡堿及多酚類的比較分析[J].食品研究與開發(fā),2007,28(12):141-144

[3]中國國家標準化管理委員會.GB/T 8303-2013.茶磨碎試樣的制備及其干物質含量測定[S].北京:中國標準出版社,2013:4

[4]中國國家標準化管理委員會.GB/T 8304-2013.茶水分測定[S].北京:中國標準出版社,2013:3

[5]中國國家標準化管理委員會.GB/T 8313-2008.茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法[S].北京:中國標準出版社,2008:6

[6]周媛等.苧麻葉中總酚酸提取工藝的正交設計優(yōu)化[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20(8):1867-1869

[7]葉儉慧,梁月榮.大孔吸附樹脂分離茶多酚的研究[J].茶葉,2006, 32(3):128-132

[8]江和源,蔣迎.茶葉中5種酚酸類化合物的HPLC測定方法[J].分析檢測,2004,25(12):122-124

[9]顧謙,陸錦時,葉寶存.茶葉化學[M].合肥:中國科學技術大學出版社,2002:43-185

[10]吳平.微生物種群在形成“六堡茶”品質中的作用研究兼論離開梧州生產(chǎn)不出純正的“六堡茶”[J].廣東茶葉,2007,16(2):12-18

[11]周樹紅.成品普洱茶陳化機理及提質技術研究[D].杭州:浙江大學,2004:1-41

[12]周才瓊.沱茶貯藏過程中品質變化分析[J].茶葉通訊,1993,11(4): 9-11

[13]汪洪武,劉艷清.大孔吸附樹脂的應用研究進展[J].藥材,2005,8 (4):53-356

The Comparative Study of Phenolic Acids among Cangwu Liubao Tea and Other Teas

CHEN Lei，PENG Jing-jing，TENG Jian-wen，HUANG Li*
（Light Industry and Food Engineering College，Guangxi University，Nanning 530004，Guangxi，China）

Abstract：This research chose Cangwu boxed Liubao tea，Cangwu bamboo packed Liubao tea，Yunnan Pu'er，Guiping green tea and Fujian oolong tea as objects to study the differences of phenolic acids' content and type among Cangwu Liubao tea and other teas. After extraction and purification，the optimal phenolic acids purity was turned to be as follows：the 50 % methanol elution of Cangwu boxed Liubao tea，Guiping green tea and Fujian oolong tea were all highest，and so were the 100 % elution of Cangwu bamboo packed Liubao tea and 10 % elution of Yunnan Pu'er. Their purity was 34.1 %，60.0 %，66.3 %，36.8 % and 17.8 % respectively，which indicated the phenolic acids amount of Cangwu Liubao tea was more than Yunnan Pu'er but less than Guiping green tea and Fujian oolong tea. HPLC was lastly applied in the later analysis. The results showed that Cangwu bamboo packed Liubao tea contained two high content featured phenolic acids，and there was also a high content featured phenolic acid in Yunnan Pu'er. The above results indicated that Cangwu Liubao tea and Yunnan Pu'er which belong to dark tea had less phenolic acids compared to Guiping green tea and Fujian oolong tea，but they had some high content featured phenolic acids.

Key words：Liubao tea；phenolic acids；extraction and purification；chromatographic analysis

收稿日期：2014-08-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.034

*通信作者

作者簡介：陳磊（1991—），男（漢），碩士研究生在讀，研究方向：食品科學。

基金項目：廣西青年基金項目（2012GXNSFBA053024）