李盛華，周明旺，潘 文，王曉萍，敬平福，喬 斌，陳 威，陳 嫻

1 甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2 甘肅省中醫(yī)藥研究院

陽虛質(zhì)膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨組織Sox9、Col2al基因表達(dá)的研究*

李盛華1，周明旺1，潘 文2，王曉萍1，敬平福1，喬 斌1，陳 威1，陳 嫻1

1 甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2 甘肅省中醫(yī)藥研究院

目的：通過檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨Sox9、Col2al基因在陽虛質(zhì)與平和質(zhì)兩者之間的表達(dá)水平，探討膝骨性關(guān)節(jié)炎中Sox9、Col2al與中醫(yī)體質(zhì)的內(nèi)在聯(lián)系和規(guī)律。方法：2012年10月20日至2014年12月27日，對(duì)甘肅省中醫(yī)院關(guān)節(jié)骨科門診及住院部確診為膝骨性關(guān)節(jié)炎的患者進(jìn)行中醫(yī)體質(zhì)問卷調(diào)查，同時(shí)調(diào)查、收集非膝骨性關(guān)節(jié)炎正常人群的一般資料。在顯微鏡下觀察不同體質(zhì)KOA患者軟骨的病理改變，采取免疫組化及Real-Time RT-PCR的方法檢測(cè)Sox9基因、Col2al在陽虛質(zhì)膝骨性關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞mRNA及蛋白水平中的表達(dá)。結(jié)果：在對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)在不同體質(zhì)的KOA患者中，陽虛質(zhì)KOA患者中軟骨內(nèi)細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞聚集成團(tuán)或者局部退化消失，Sox9在軟骨細(xì)胞核中表達(dá)，Col2al在細(xì)胞外基質(zhì)中表達(dá)，在陽虛質(zhì)KOA、陽虛質(zhì)非KOA患者軟骨細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，在平和質(zhì)KOA相對(duì)陽虛體質(zhì)表達(dá)比較低，兩者的表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。結(jié)論：膝骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的體質(zhì)危險(xiǎn)因素主要為陽虛質(zhì)。在分子表達(dá)水平Sox9及Col2al均呈現(xiàn)高表達(dá)，其與中醫(yī)體質(zhì)存在一定的內(nèi)在相關(guān)性，說明體質(zhì)因素是誘發(fā)膝骨性關(guān)節(jié)炎的高危因素，因人的體質(zhì)是相對(duì)恒定的，某一疾病的誘發(fā)是具有時(shí)間性的，故陽虛質(zhì)是膝骨性關(guān)節(jié)炎中誘導(dǎo)Sox9及Col2al高表達(dá)的主要因素之一。

膝骨性關(guān)節(jié)炎；Sox9；Col2al；中醫(yī)體質(zhì)；陽虛質(zhì)

1 資料與方法

1.1 臨床資料 標(biāo)本來源于2013年10月至

2014年10月在甘肅省中醫(yī)院行人工膝關(guān)節(jié)全膝置換術(shù)患者，共采集65例軟骨組織，將所獲得標(biāo)本分成4份(分別用于mRNA、蛋白表達(dá)檢測(cè)、HE染色及免疫組化)。標(biāo)本在無菌條件下采集后迅速置于小型隨身液氮瓶中，30分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)入-80℃冰箱備用。在實(shí)驗(yàn)中，隨機(jī)選取陽虛質(zhì)、平和質(zhì)、非膝骨性關(guān)節(jié)炎患者標(biāo)本各10例。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 符合KOA診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］者。具體如下：患者除有膝關(guān)節(jié)疼痛，還伴有下列7項(xiàng)中的3項(xiàng)者：1)年齡≥45歲；2)晨僵＜30分鐘；3)關(guān)節(jié)活動(dòng)時(shí)有骨響聲；4)膝部檢查示骨性肥大；5)有骨壓痛；6)無明顯皮溫升高；7)放射學(xué)檢查有關(guān)節(jié)間隙明顯變窄及骨贅形成。

1.2.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 符合《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》中的關(guān)于膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)。具體標(biāo)準(zhǔn)如下：1)初起膝關(guān)節(jié)隱隱作痛，屈伸不利，輕微活動(dòng)稍緩解，氣候變化加重，反復(fù)纏綿不愈；2)起病隱襲，發(fā)病緩慢，多常見中老年人；3)膝部可輕度腫脹，活動(dòng)時(shí)關(guān)節(jié)常有喀嚓聲和磨擦聲；4)X線檢查可見骨質(zhì)疏松，關(guān)節(jié)間隙變窄，軟骨下骨質(zhì)硬化，邊緣唇樣改變，骨贅形成。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 納入：1)符合中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)的KOA患者(包括接受手術(shù)或中醫(yī)藥對(duì)癥治療者)；2)不伴有其他嚴(yán)重的心、腦、腎等原發(fā)性疾病者；3)愿意接受本次科研調(diào)查者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 排除：1)診斷為創(chuàng)傷性KOA者；2)妊娠或哺乳期婦女；3)過敏體質(zhì)者或不能接受本調(diào)查者；4)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎及患有嚴(yán)重膝關(guān)節(jié)疾病者；5)合并有嚴(yán)重的內(nèi)臟病變者或其他嚴(yán)重代謝異常疾病及骨腫瘤者；6)精神病患者、智力障礙者；7)正在參加其他臨床實(shí)驗(yàn)者。

1.5 病例剔除和脫落標(biāo)準(zhǔn) 剔除和脫落：1)依從性差，未能按要求填寫者；2)采集項(xiàng)目不完整，缺項(xiàng)多于20%者；3)體質(zhì)分型判定為兼夾體質(zhì)者。

1.6 中醫(yī)體質(zhì)分類及判定標(biāo)準(zhǔn) 采用中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)于2009年4月9日頒布的《中醫(yī)體質(zhì)分類與判定》標(biāo)準(zhǔn)，判定陽虛質(zhì)KOA的中醫(yī)體質(zhì)類型。

1.7 指標(biāo)檢測(cè)

1.7.1 HE染色觀察關(guān)節(jié)軟骨 將手術(shù)臺(tái)上切取的關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本，修剪成約1.5 cm×1 cm×0.2 cm大小，迅速置于10%中性甲醛溶液內(nèi)固定48小時(shí)，流水沖洗2～3小時(shí)，脫水，透明，石蠟包埋。冷凍切片，采用HE染色法觀察軟骨退變情況。

1.7.2 免疫組化法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨中Sox9、Col2al蛋白表達(dá) 關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本處理方法同“1.7.1”項(xiàng)，免疫組化法檢測(cè)Sox9及Col2al表達(dá)水平。

1.7.3 RT-PCR法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨中Sox9、Col2al基因表達(dá) 1)軟骨標(biāo)本RNA提取，-80℃冰箱保存；2)合成cDNA第一鏈；3)RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)：采用二步法PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴(kuò)增曲線和溶解曲線。

采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Ct值是指每個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)熒光強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。ΔCt=目的基因Ct值-管家基因GAPDH Ct值，ΔΔCt=(目的基因Ct-GAPDH Ct)病例組-(目的基因Ct-GAPDH Ct)對(duì)照組。相對(duì)基因表達(dá)RGE(relative gene expression)=2-ΔΔCt，2-ΔΔCt表示的是實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組基因的變化倍數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，定量資料用表示，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果 陽虛質(zhì)KOA組Sox9陽性染色率為20%(2/10)，其中陰性8例，弱陽性(+)1例，中度陽性(++)1 例。平和質(zhì)KOA組Sox9 染色陽性率為 40%(4/10)，其中陰性(-)6 例，弱陽性(+)2 例，中度陽性(++)1例，強(qiáng)陽性(+++)1例。陽虛質(zhì)非KOA組Sox9染色陽性率為80%(8/10)，其中陰性(-)2例，弱陽性(+)2例，中度陽性(++)3例，強(qiáng)陽性(+++)3例。3組間染色陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 3組Sox9染色陽性率對(duì)比分析

陽虛質(zhì)KOA患者關(guān)節(jié)軟骨，Sox9表達(dá)相對(duì)較高，核仁明顯，呈棕黃色，軟骨組織基質(zhì)有不規(guī)則排列的稀疏的膠原纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成；平和質(zhì)KOA患者關(guān)節(jié)軟骨，可見軟骨組織內(nèi)膠原纖維增多，軟骨細(xì)胞明顯減少，偶可見空泡征；陽虛質(zhì)非KOA患者關(guān)節(jié)軟骨HE染色鏡下表現(xiàn)，軟骨基質(zhì)內(nèi)膠原纖維增多，細(xì)胞染色變淺，大量細(xì)胞核仁消失，細(xì)胞呈現(xiàn)空泡征。見圖1。

圖1 不同體質(zhì)KOA患者軟骨組織HE染色形態(tài)圖(×200)

2.2 免疫組化染色結(jié)果 退變關(guān)節(jié)軟骨中Sox9及Col2al均有不同程度的表達(dá)，但是程度不一樣，Sox9定位于細(xì)胞核中，Col2al定位于細(xì)胞外基質(zhì)中，在不同的組別均有不同表達(dá)。陽虛質(zhì)KOA組中Sox9及Col2al呈現(xiàn)低表達(dá)，平和質(zhì)KOA組相對(duì)陽虛質(zhì)呈現(xiàn)高表達(dá)，但是相對(duì)于陽虛質(zhì)非KOA中變達(dá)略低，且Sox9與Col2al的表達(dá)呈正相關(guān)表達(dá)一致。平和質(zhì)KOA患者Sox9位于胞核內(nèi)，表達(dá)強(qiáng)度+2；Col2al蛋白陽性表達(dá)相對(duì)較多，表達(dá)強(qiáng)度+4。平和質(zhì)KOA患者，Sox9蛋白產(chǎn)物陽性表達(dá)較少，表達(dá)強(qiáng)度+1，弱陽性；Col2al位于胞核基質(zhì)內(nèi)，表達(dá)強(qiáng)度+2。陽虛質(zhì)非KOA患者，Sox9蛋白陽性表達(dá)相對(duì)較多，表達(dá)強(qiáng)度+3；Col2al蛋白產(chǎn)物陽性表達(dá)較少，表達(dá)強(qiáng)度+1，弱陽性。見圖2—3。

圖2 Sox9在不同體質(zhì)KOA患者軟骨中的表達(dá)(×200)

圖3 Col2al在不同體質(zhì)KOA患者軟骨中的表達(dá)(×200)

2.3 Sox9、Col2al和內(nèi)參基因GAPDH在膝關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)的表達(dá) 陽虛質(zhì)、平和質(zhì)和陽虛質(zhì)非KOA3組之間CT值均數(shù)及線性比較見圖4—5。

圖4 CT值均數(shù)比較

圖5 CT值線性比較

3 討論

KOA是一種老年性、慢性退行性骨關(guān)節(jié)?。?-4］。前期研究結(jié)果表明，陽虛質(zhì)體質(zhì)仍是KOA的最常見體質(zhì)［5］。目前軟骨退變的分子機(jī)理仍不完全清楚，但軟骨調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)異?？赡芘c退行性改變相關(guān)［6］，從而證明Sox9是調(diào)控軟骨形成的重要基因。本研究結(jié)果表明，陽虛質(zhì)KOA患者關(guān)節(jié)軟骨中Sox9表達(dá)下降，表明體質(zhì)變化也是其中的一個(gè)不容忽視的因素。Ⅱ型膠原(Col2al)是關(guān)節(jié)軟骨構(gòu)成的主要成分，是軟骨的空間構(gòu)架［7］，在軟骨的應(yīng)力和應(yīng)變中，Col2al和蛋白多糖(PG)共同完成。在KOA病變過程中，Col2al的缺失、退變，影響膝關(guān)節(jié)的正常生理活動(dòng)。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，Sox9基因是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，與人類性別基因SPY緊密相連，參與軟骨細(xì)胞中Col2al的細(xì)胞特異性激活作用，控制Col2al在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)，在Sox5和Sox6的協(xié)助下，其作用進(jìn)一步加強(qiáng)［8］，在KOA患者病變處，炎性因子抑制Sox9的軟骨生成作用，間接導(dǎo)致Col2al的表達(dá)降低，軟骨細(xì)胞再生和修復(fù)能力減弱，成為KOA患者疾病難愈的重要原因［9］。本研究中，Sox9基因與Col2al蛋白基因均處于低表達(dá)狀態(tài)，而Sox9與Col2al的正相關(guān)表達(dá)，說明二者可能處于同一信號(hào)通路。位于細(xì)胞核的Sox9直接結(jié)合Col2al的增強(qiáng)子、或與其他蛋白結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體調(diào)控Col2al的表達(dá)［10-12］與本次實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明，陽虛質(zhì)KOA組Col2al的表達(dá)隨Sox9的表達(dá)的減少而減少，說明二者有正比關(guān)系，在平和質(zhì)KOA組Sox9和Col2al的含量總體小于陽虛質(zhì)非KOA組，相對(duì)于陽虛質(zhì)非KOA組，因其關(guān)節(jié)軟骨未發(fā)生病理性的退化、改變，Sox9和Col2al的表達(dá)均高于前2組。本研究將中醫(yī)體質(zhì)與現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)相結(jié)合，探討陽虛質(zhì)KOA與Sox9、Col2al的相關(guān)性，從而為中醫(yī)藥利用體質(zhì)辨識(shí)、調(diào)體干預(yù)并防治KOA提供理論依據(jù)及治療靶點(diǎn)。

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Study on Expression of Sox9 and Col2al Genes in Cartilage Tissue of Knee Osteoarthritis with Yang Deficiency Constitution

Li Shenghua1,Zhou Mingwang1,Pan Wen2,Wang Xiaoping1,Jing Pingfu1,Qiao Bin1,Chen Wei1,Chen Xian11 Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730050,China; 2 Gansu Provincial Academy of Chinese Medicine

Objective: To discuss the internal relations and rules of Sox9, Col2al and traditional Chinese medicine constitutions in knee osteoarthritis through detecting the expression level of Sox9 and Col2al genes in the patients of Yang deficiency and constitution. Methods: From October 20th, 2012 to December 27th, 2014, the TCM constitution questionnaire for patients in outpatient and inpatient in joint department of orthopedics of Gansu Provincial Hospital of traditional Chinese medicine with diagnosis of knee osteoarthritis was conducted, at the same time, the general information of non knee osteoarthritis and normal people were investigated and collected. The cartilaginous pathological changes of KOA patients in different constitutions under the microscope was observed, and the expressions of Sox9 gene and Col2al in mRNA of knee cartilage cells and the protein of Yang deficiency patients with osteoarthritis were detected with the methods of immunohistochemistry and Real-Time RT-PCR. Results: After the analysis of the experimental results, it was found that in the KOA patients with different physical constitutions, the arrangement of the chondrocytes were disordered in KOA patients with Yang deficiency, and the cells were aggregated into clusters or local degeneration and disappearance. Sox9 was expressed in the nucleus of cartilage while Col2al was expressed in the extracellular matrix. They were highly expressed within the cartilage cells in KOA patients with Yang deficiency and non KOA patients with Yang deficiency, and the expression of KOA patients with normal constitution was relatively lower than that of KOA patients with Yang deficiency. There was a significant difference between the two expressions (P＜0.05). Conclusion: The main risk factors of the morbidity of knee osteoarthritis is Yang deficiency constitution. At the molecular expression level, Sox9 and Col2al are both highly expressed, and there is a certain intrinsic correlation with TCM constitution. This shows that the constitution factors are the high risk factors which can induce knee osteoarthritis. People's constitution is relatively constant, the induction of a disease is a matter of time. Therefore, Yang deficiency constitution is one of the main factors which induce Sox9 and Col2al high expression in knee osteoarthritis.

knee osteoarthritis; Sox9; Col2al; constitution of traditional Chinese medicine; Yang deficiency constitution骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)高發(fā)于中老年人，臨床主要以關(guān)節(jié)晨起僵硬、疼痛并活動(dòng)時(shí)加劇，導(dǎo)致活動(dòng)受限，在日?；顒?dòng)中可聞及關(guān)節(jié)“咔咔”摩擦聲。近年來，國內(nèi)骨關(guān)節(jié)炎患病率逐年上升，高達(dá)9.56%，60歲以上可高達(dá)78.5%［1］。膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(Knee Osteoarthritis，KOA)病因復(fù)雜，病程相對(duì)較長(zhǎng)，許多患者病程可長(zhǎng)達(dá)20年，近年來大量臨床研究顯示，關(guān)節(jié)軟骨變性或損傷后出現(xiàn)皸裂、退變等，是引起患者身心受損、關(guān)節(jié)疼痛的主要原因之一。

R684.3

A

1004-6852(2016)12-0001-04

2016-06-24

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)81260546)；甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)1208RJYA041)；甘肅省中醫(yī)藥管理局科研項(xiàng)目(編號(hào)GZK-2015-10)。

李盛華(1959—)，男，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，享受國務(wù)院特殊津貼專家，衛(wèi)生部突出貢獻(xiàn)中青年專家，甘肅省優(yōu)秀專家，甘肅省名中醫(yī)，甘肅省領(lǐng)軍人才第一層次，甘肅省“555”創(chuàng)新人才，甘肅省“333”科技人才，甘肅省衛(wèi)生廳跨世紀(jì)學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人，甘肅省中醫(yī)院首席主任醫(yī)師，國家級(jí)重點(diǎn)學(xué)(專)科——骨科學(xué)科帶頭人，中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)理事，中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)骨傷分會(huì)副主任委員，中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)骨科微創(chuàng)專業(yè)委員會(huì)主任委員，中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)脊柱醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會(huì)常務(wù)理事，甘肅省中醫(yī)藥學(xué)會(huì)副會(huì)長(zhǎng)，甘肅省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)副會(huì)長(zhǎng)，甘肅省康復(fù)學(xué)會(huì)副會(huì)長(zhǎng)，甘肅省中醫(yī)藥學(xué)會(huì)骨傷專業(yè)委員會(huì)主任委員，甘肅省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)骨傷科專業(yè)委員會(huì)主任委員，《中國中醫(yī)骨傷科》雜志副主編，《西部中醫(yī)藥》雜志編委會(huì)副主任，《中國骨傷》《中醫(yī)正骨》雜志編委。隴中正骨學(xué)術(shù)流派傳承工作室負(fù)責(zé)人。研究方向：骨與關(guān)節(jié)疾病的中西醫(yī)結(jié)合治療。