翟芳，宋田青，肖文海，丁明珠，喬建軍，元英進(jìn)

（系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津大學(xué)化工學(xué)院制藥工程系，天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300072）

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產(chǎn)5α羥化紫杉二烯醇人工酵母的組合設(shè)計(jì)構(gòu)建

翟芳，宋田青，肖文海，丁明珠，喬建軍，元英進(jìn)

（系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津大學(xué)化工學(xué)院制藥工程系，天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300072）

摘要：利用工程化微生物生產(chǎn)天然藥物如紫杉醇在近年來受到研究者廣泛關(guān)注。本工作研究如何設(shè)計(jì)和構(gòu)建人工酵母以生產(chǎn)紫杉醇生物合成途徑中第一個由細(xì)胞色素P450酶催化的羥化產(chǎn)物——5α羥化紫杉二烯醇（taxadien-5α-ol）。利用組合設(shè)計(jì)原理，選用3種不同紅豆杉來源的紫杉二烯5α羥化酶和2種不同植物源的細(xì)胞色素P450還原酶，分別對其進(jìn)行N端穿膜區(qū)域的預(yù)測和截短，并對還原酶使用2種不同強(qiáng)度啟動子進(jìn)行調(diào)控，所得羥化酶模塊和還原酶模塊之間分別表達(dá)共產(chǎn)生72種組合方式。然后將其分別整合入紫杉二烯生產(chǎn)菌株基因組中，最終在72個組合中篩選到48個可以生產(chǎn)5α羥化紫杉二烯醇的菌株，最高產(chǎn)量67.3 μg·L-1，在釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)紫杉二烯C5位羥化產(chǎn)物的從頭合成。研究結(jié)果表明，利用組合設(shè)計(jì)策略研究模塊間相互作用及其與底盤間適配性將為在微生物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)細(xì)胞色素P450酶系介導(dǎo)的催化反應(yīng)過程提供重要參考。

關(guān)鍵詞：合成生物學(xué)；5α羥化紫杉二烯醇；組合設(shè)計(jì)；釀酒酵母；生物催化；發(fā)酵

2015-06-26收到初稿，2015-08-10收到修改稿。

聯(lián)系人：肖文海。第一作者：翟芳（1990—），女，碩士研究生。

Received date: 2015-06-26.

引 言

近年來利用合成生物學(xué)構(gòu)建工程化人工細(xì)胞成為生產(chǎn)稀缺植物源的具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)及獨(dú)特性質(zhì)的化合物的重要手段。研究者通過對已有的生物系統(tǒng)進(jìn)行改造、設(shè)計(jì)并構(gòu)建全新的功能模塊，進(jìn)行天然化合物的異源生物合成和生產(chǎn)[1]，目前已在很多研究方向取得突破性進(jìn)展[2-15]。Keasling等[2-5]通過系統(tǒng)的模塊化構(gòu)建及合成路徑調(diào)控成為抗瘧疾藥物青蒿素前體生產(chǎn)研究的典范；Ajikumar等[11]開發(fā)利用多元模塊代謝工程方法（multivariate-modular approach），使紫杉醇前體紫杉二烯在大腸桿菌中的產(chǎn)量提高了15000倍。

在紫杉醇的生物合成途徑中，5α羥化紫杉二烯醇是紫杉醇母核紫杉二烯下游第一個由細(xì)胞色素P450酶催化的羥化產(chǎn)物[16]。該過程是在紫杉二烯5α羥化酶（taxadiene 5α-hydroxylase，T5αOH）和細(xì)胞色素P450還原酶（cytochrome P450 reductase，CPR）的共同作用下，催化底物紫杉二烯C5位雙鍵發(fā)生遷移并同時引入羥基而完成。隨后5α羥化紫杉二烯醇在?；D(zhuǎn)移酶的作用下乙?；?，再在10β、13α、7β、2α羥化酶的作用下依次進(jìn)行羥化[9,17]。DeJong 等[14]在釀酒酵母細(xì)胞中成功表達(dá)了5α羥化酶（T5αOH），5α?；D(zhuǎn)移酶（TAT）和10β羥化酶（T10βOH），并且完成了這些酶類的表征，但沒有實(shí)現(xiàn)從IPP到taxdiene-5α-acetate-10β-ol生物合成路徑的表達(dá)；Ajikumar等[11]在高產(chǎn)紫杉二烯的研究基礎(chǔ)上，利用穿膜工程在大腸桿菌中融合表達(dá)T5αOH和細(xì)胞色素P450還原酶，實(shí)現(xiàn)5α羥化紫杉二烯醇產(chǎn)量達(dá)到58 mg·L-1；最近，Zhou等[15]利用微生物混合培養(yǎng)策略，在大腸桿菌與釀酒酵母中對紫杉醇前體生物合成路徑進(jìn)行分工，在共培養(yǎng)條件下成功實(shí)現(xiàn)氧化紫杉烷化合物的生物合成，其產(chǎn)量達(dá)到33 mg·L-1。

目前的研究對細(xì)胞色素P450酶催化系統(tǒng)中氧化酶（CYP）和還原酶主要采用分別表達(dá)和融合表達(dá)兩種方式。分別表達(dá)的方式可以實(shí)現(xiàn)對氧化酶和還原酶表達(dá)強(qiáng)度的分別調(diào)控，從而使兩者在轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平上達(dá)到協(xié)調(diào)和相互適配[5]；而融合表達(dá)策略能夠縮短氧化酶和還原酶的空間距離，從而在一定程度上促進(jìn)氧化還原電子傳遞反應(yīng)的高效進(jìn)行[11]。然而，細(xì)胞色素P450酶系介導(dǎo)的生物催化反應(yīng)過程由于機(jī)理較為復(fù)雜[17-19]，因而如何更有效地選擇氧化酶和還原酶的表達(dá)方式和后續(xù)優(yōu)化仍是現(xiàn)階段研究者所面臨的一個難題。

為了解決在釀酒酵母中P450催化5α羥化紫杉二烯醇生物合成這一難題，同時為了對羥化酶和還原酶的表達(dá)進(jìn)行精確調(diào)控，本研究將利用組合設(shè)計(jì)原理，選取3種不同來源的紫杉二烯5α羥化酶和2種不同來源的細(xì)胞色素P450還原酶，對其進(jìn)行跨膜區(qū)域不同長度截短，并采用分別表達(dá)方式，使用不同強(qiáng)度啟動子進(jìn)行調(diào)控，并將所得羥化酶模塊和還原酶模塊進(jìn)行組合，以釀酒酵母紫杉二烯生產(chǎn)菌為出發(fā)菌株，對上述功能模塊進(jìn)行基因組特定位點(diǎn)整合，以篩選得到最佳適配的5α羥化紫杉二烯醇生產(chǎn)菌株。本研究以真核細(xì)胞釀酒酵母為底盤，相比于原核系統(tǒng)，釀酒酵母具備完整的內(nèi)膜系統(tǒng)以及與植物細(xì)胞類似的電子傳遞系統(tǒng)，是適合作為包含細(xì)胞色素P450酶反應(yīng)過程的復(fù)雜天然產(chǎn)物異源合成的宿主平臺；將5α羥化紫杉二烯醇與紫杉二烯生物合成路徑進(jìn)行整合，能夠避免采用混菌培養(yǎng)系統(tǒng)可能存在的競爭等諸多復(fù)雜相互作用關(guān)系，同時這也符合后續(xù)潛在工業(yè)發(fā)酵應(yīng)用對單菌培養(yǎng)偏好的要求；組合設(shè)計(jì)原理的應(yīng)用與基因組整合相結(jié)合，在基因表達(dá)水平上進(jìn)行微調(diào)，有助于實(shí)現(xiàn)最佳羥化酶和還原酶的高效篩選和代謝通路優(yōu)化，可為后續(xù)紫杉醇前體生物合成的研究奠定基礎(chǔ)。該研究對構(gòu)建其他天然化合物的生物合成途徑或由細(xì)胞色素P450酶系介導(dǎo)的催化反應(yīng)過程提供重要的參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 基因元件載體和基因表達(dá)盒的構(gòu)建

設(shè)計(jì)特異性引物，以釀酒酵母單敲菌株YNL280C （erg24Δ::kanMX4）（購自O(shè)pen Biosystems ，Huntsville，AL）的基因組為模板擴(kuò)增得到KanMX基因的上游部分片段kmx1、組氨酸營養(yǎng)標(biāo)記基因his3和終止子eno2t，通過重疊延伸PCR（OE-PCR）將3個片段連接，用限制性內(nèi)切酶Pst I/Bam HI酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后連接到載體pRS425K[20]的相應(yīng)位點(diǎn)，得到元件載體pRS425K-kmx1-his3-eno2t。用相同的方法構(gòu)建載體pRS425K-eno2t-tef1p-gpm1t、pRS425K-gpm1t-pgi1p-gpdt-kmx2和pRS425K-gpm1t-tdh3pgpdt-kmx2，且其中啟動子和第二個終止子之間留有Pme I酶切位點(diǎn)，用于紫杉二烯5α羥化酶或還原酶基因的連接，圖1(a)所示為以zf11為例，說明元件載體的構(gòu)建過程。

圖1 基因表達(dá)盒zf11-T5αOH的構(gòu)建過程Fig.1 Construction of gene cassette zf11-T5αOH

紫杉二烯5α羥化酶基因Tw5αOH（Taxus wallichiana var. chinensis）、Tm5αOH（Taxus x media）、Tc5αOH（Taxus cuspidata）和P450還原酶基因TcCPR （Taxus cuspidata）、AtCPR（Arabidopsis thaliana）均由金唯智公司依照釀酒酵母密碼子偏好性對序列進(jìn)行優(yōu)化后合成。在http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/網(wǎng)站中預(yù)測上述基因的穿膜區(qū)域。設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增不同長度基因片段，用CPEC方法[21]將基因片段分別連入相應(yīng)的元件載體中得到完整的基因表達(dá)盒［圖1(b)］。所有模塊均經(jīng)過測序驗(yàn)證堿基序列的正確性。表1所示為本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的質(zhì)粒。

表1 實(shí)驗(yàn)中涉及的質(zhì)粒Table 1 Plasmids involved in this study

圖2 5α羥化紫杉二烯醇合成模塊的基因組整合Fig.2 Genomic integration of taxadien-5α-ol modules

1.2 酵母轉(zhuǎn)化和篩選

用限制性內(nèi)切酶Pst I/Bam HI對元件載體zf01以及所有基因表達(dá)盒進(jìn)行酶切，凝膠回收得到元件模塊和基因表達(dá)盒模塊。將相應(yīng)的羥化酶基因模塊與還原酶基因模塊組合，同元件模塊zf01按等物質(zhì)的量混合，采用醋酸鋰法轉(zhuǎn)化釀酒酵母紫杉二烯生產(chǎn)菌株SyBE_001051[13]。模塊之間以終止子片段作為同源臂連接，兩端通過KanMX位點(diǎn)同源序列與基因組該位點(diǎn)發(fā)生雙交換同源重組（圖2）。使用SD-ura-leu固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，于30℃培養(yǎng)2～3d，挑取單菌落在SD-ura-leu固體培養(yǎng)基上劃線分純，挑取分純后的單菌落進(jìn)行酵母菌落PCR，通過驗(yàn)證目的片段存在且大小正確，從而確定完整組裝的陽性克隆。

1.3 人工酵母菌株的發(fā)酵

將100 μl液體甘油菌接入5 ml SD-ura-leu液體培養(yǎng)基中，30℃、220 r·min-1培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接入5 ml SD-ura-leu液體培養(yǎng)基中，使其初始OD600為0.2，在30℃、220 r·min?1條件下培養(yǎng)至菌體對數(shù)生長中期（OD600約為5），接入50 mlYPD培養(yǎng)基中，使其初始OD600為0.1，在30℃、220 r·min-1條件下發(fā)酵，10 h時加入5%（體積）正十二烷進(jìn)行兩相培養(yǎng)，70 h結(jié)束發(fā)酵，將發(fā)酵液于11000 r·min-1離心5 min，收集上層有機(jī)相，除水過濾后備用GC-MS測定產(chǎn)物。

1.4 5α羥化紫杉二烯醇的檢測與定量

使用三重四極氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（Agilent公司）測定產(chǎn)物。色譜條件：HP-5ms 30 m×0.25 μm×0.25 mm硅膠毛細(xì)管色譜柱（Agilent公司）；恒流模式，載氣氦氣流速為1 ml·min-1；進(jìn)樣量10 μl。柱溫起始溫度100℃，保持1 min，以15℃·min-1升至175℃；再以4℃·min-1升至220℃，保持2 min；最后以50℃·min-1升至290℃，保持1 min；進(jìn)樣口溫度與色譜-質(zhì)譜接口溫度均為250℃。質(zhì)譜條件：電子轟擊電離EI+；電子束能量70 eV；離子源溫度250℃；溶劑延遲時間7 min；質(zhì)量掃描方式：全離子掃描與SIM選擇離子掃描。

采用與5α羥化紫杉二烯醇結(jié)構(gòu)最為相近的化合物紫杉二烯的純品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過外標(biāo)法對5α羥化紫杉二烯醇進(jìn)行半定量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 5α羥化紫杉二烯醇生物合成中組合設(shè)計(jì)原理的應(yīng)用

在紫杉醇生物合成途徑中，5α羥化紫杉二烯醇是紫杉二烯下游第一個由細(xì)胞色素P450單加氧酶催化的羥化產(chǎn)物，該催化反應(yīng)由紫杉二烯5α羥化酶與細(xì)胞色素P450還原酶通過一系列電子傳遞過程共同完成。由于P450酶在異源宿主中都是通過膜結(jié)合而表達(dá)并發(fā)揮功能，因此相比于原核生物大腸桿菌，具有與植物細(xì)胞類似的細(xì)胞色素P450電子傳遞系統(tǒng)和完整內(nèi)膜系統(tǒng)的真核生物釀酒酵母更加適合作為5α羥化紫杉二烯醇及其下游一系列細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的氧化催化產(chǎn)物合成的宿主細(xì)胞，圖3所示為在釀酒酵母紫杉二烯生物合成模塊基礎(chǔ)上，引入5α羥化紫杉二烯醇相關(guān)基因模塊的生物合成路徑。

圖3 工程釀酒酵母中5α羥化紫杉二烯醇生物合成路徑Fig.3 Biosynthesis pathway of taxadien-5α-ol in engineered S. cerevisiaeHMG-CoA—3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A; DMAPP—dimethylallyl diphosphate; IPP—isopentenyl pyrophosphate; GPP—geranyl diphosphate; FPP—farnesyl diphosphate; GGPP—geranylgeranyl diphosphate; tHMGR—HMG-CoA reductase (truncated version); GGPPSsa—GGPP synthase of Sulfolobus acidocaldarius; BTS1-ERG20—fusion gene of BTS1 (GGPP synthase of yeast) and ERG20 (FPP synthase of yeast); tTS—taxadiene synthase of Taxus brevifolia (truncated version); T5αOH—taxadiene 5α-hydroxylase of Taxus; CPR—cytochrome P450 reductase

為了研究紫杉二烯5α羥化酶和還原酶的協(xié)同表達(dá)，選擇3種不同紅豆杉品種來源的羥化酶，分別是中國紅豆杉源、曼地亞紅豆杉源和東北紅豆杉源，以及兩種不同物種來源的還原酶，分別是東北紅豆杉源和擬南芥源。Croteau等[22]的研究表明，紅豆杉來源的不同P450單加氧酶間序列相似性很高，而與其他植物來源羥化酶序列差異較大，推斷其可能具有較高底物專一性和特殊催化特性，因此本研究僅選取紅豆杉源的羥化酶進(jìn)行研究；此外，釀酒酵母中雖然具備細(xì)胞色素P450氧化還原系統(tǒng)，但其還原酶（CPR）的表達(dá)量低且與植物P450的電子傳遞效率不匹配[23-24]，因此外源CPR的引入是必要的，它作為電子傳遞體與羥化酶之間發(fā)生電子傳遞作用，而不直接作用于底物，因此選取了2種不同物種來源的還原酶進(jìn)行研究。

通過http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/網(wǎng)站預(yù)測得到不同來源羥化酶的穿膜區(qū)均為N端42個氨基酸，對其進(jìn)行穿膜區(qū)24個氨基酸的部分截短以及全部截短，共得到9個羥化酶基因片段：Tw5αOH、t24Tw5αOH、t42Tw5αOH、Tm5αOH 、t24Tm5αOH、t42Tm5αOH、Tc5αOH、t24Tc5αOH、t42Tc5αOH；而紅豆杉源和擬南芥源還原酶的穿膜區(qū)分別為N端74個和46個氨基酸，對其進(jìn)行全部截短，共得到4個還原酶基因片段：TcCPR、t74TcCPR、AtCPR、t46AtCPR。此外，有研究還指出，紫杉二烯5α羥化酶的活性和催化效率較低是造成紫杉二烯向下游代謝物轉(zhuǎn)化的代謝瓶頸[14]，因此本研究對羥化酶基因使用釀酒酵母組成型強(qiáng)啟動子tef1p進(jìn)行調(diào)控以獲得其高表達(dá)量，對還原酶基因使用強(qiáng)啟動子tdh3p和弱啟動子pgi1p分別進(jìn)行調(diào)控，以研究并獲得與羥化酶相匹配的還原酶表達(dá)水平。利用組合設(shè)計(jì)原理，如圖4所示，將所述羥化酶與還原酶模塊進(jìn)行組合，共得到72種不同組合的5α羥化紫杉二烯醇生物合成模塊。

圖4 紫杉二烯5α羥化酶與細(xì)胞色素P450還原酶的組合設(shè)計(jì)Fig.4 Combinatorial design of taxadiene 5α-hydroxylase and CYP450 reductase

2.2 產(chǎn)5α羥化紫杉二烯醇人工酵母的構(gòu)建與發(fā)酵

本研究所采用的出發(fā)菌株為SyBE_001051，它是以釀酒酵母單敲菌株YNL280C（敲除麥角固醇合成途徑中關(guān)鍵基因erg24，從而有效降低競爭支路的代謝通量）為底盤，整合入含有紫杉二烯生物合成途徑關(guān)鍵基因tHMGR、GGPPSsa、BTS1-ERG20、tTS的著絲粒質(zhì)粒，所構(gòu)建的紫杉二烯生產(chǎn)菌株，其搖瓶發(fā)酵紫杉二烯產(chǎn)量達(dá)75 mg·L-1[13]。本研究將組合設(shè)計(jì)中相應(yīng)的羥化酶模塊和還原酶模塊進(jìn)行基于該出發(fā)菌株基因組Kan位點(diǎn)的整合共表達(dá)，分別從每個組合中選取3個陽性克隆進(jìn)行發(fā)酵與GC-MS測定。

發(fā)酵樣品的總離子流檢測結(jié)果如圖5(a)所示，可以看出，發(fā)酵產(chǎn)物種類較復(fù)雜，對其中具有離子特征峰m/z 288[272（紫杉二烯）+16（氧原子）]的色譜峰進(jìn)行質(zhì)譜分析，并依據(jù)其特征峰進(jìn)行SIM模式下的選擇離子掃描，結(jié)果如圖5(b)所示，保留時間為17.03 min的色譜峰，其離子特征峰[圖6(a)]與文獻(xiàn)報道的5α羥化紫杉二烯醇[16]完全吻合，判斷為目標(biāo)產(chǎn)物；保留時間為16.50 min的色譜峰，其離子特征峰[圖6(b)]與文獻(xiàn)報道的5(12)-oxa-3(11)-cyclotaxane（OCT）[16]完全吻合，判斷為副產(chǎn)物OCT；其他3個同樣具有離子m/z 288的色譜峰，可能為其他紫杉烷化合物或氧化產(chǎn)物[圖6(c)～(e)]，產(chǎn)量很低，未能進(jìn)行分離純化，因此目前不能對其定性。

圖5 菌株t24Tc5αOH-zf22t74TcCPR的發(fā)酵GC-MS檢測Fig.5 GC-MS profile for strain t24Tc5αOH-zf22t74TcCPR

利用紫杉二烯標(biāo)準(zhǔn)曲線對5α羥化紫杉二烯醇進(jìn)行半定量，全部菌株的產(chǎn)量如表2所示。

5α羥化紫杉二烯醇產(chǎn)量最高的菌株為62號，它是通過N端截短24個氨基酸的東北紅豆杉源羥化酶與N端截短74個氨基酸的東北紅豆杉源還原酶組合并構(gòu)建而得，且還原酶與羥化酶基因均為強(qiáng)啟動子調(diào)控，由此推斷，雖然不同來源還原酶均可在該體系中發(fā)揮電子傳遞作用，但紅豆杉源羥化酶與同一來源的還原酶適配性優(yōu)于異源還原酶，且與羥化酶相當(dāng)?shù)倪€原酶轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平在此體系中更優(yōu)，因而更能發(fā)揮其最佳催化效力。

2.3 羥化酶的不同來源和截短形式對5α羥化紫杉二烯醇生物合成的影響

對5α羥化紫杉二烯醇進(jìn)行產(chǎn)量比較發(fā)現(xiàn)，使用不同來源的羥化酶，目標(biāo)產(chǎn)物含量差異較為明顯，東北紅豆杉源羥化酶的效果優(yōu)于另外兩者（圖7）。經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)，3種羥化酶的氨基酸序列相似性在98%以上，而曼地亞紅豆杉源和東北紅豆杉源羥化酶只有一個氨基酸差異，為N端31位，位于所預(yù)測的蛋白穿膜區(qū)域，曼地亞紅豆杉源蛋白序列中該位點(diǎn)為絲氨酸，而東北紅豆杉源蛋白序列中該位點(diǎn)為丙氨酸，推斷不同極性氨基酸的差異可能會導(dǎo)致蛋白空間結(jié)構(gòu)的不同，進(jìn)而影響了酶的催化活性，有待對蛋白結(jié)構(gòu)及其與底物間相互作用進(jìn)行模擬以進(jìn)一步揭示其催化作用機(jī)制。

圖6 紫杉烷化合物的質(zhì)譜檢測圖Fig.6 Mass spectra of taxanes

此外，使用未截短或截短N(yùn)端24個氨基酸的羥化酶，均有不同程度C5位羥化產(chǎn)物的產(chǎn)出，而羥化酶N端42個氨基酸被截短后，均不能合成羥化產(chǎn)物，推斷植物源P450酶可由其本身的N端跨膜區(qū)定位于酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上而表達(dá)并發(fā)揮功能，這是酵母作為真核細(xì)胞用于表達(dá)異源蛋白相對于原核宿主的優(yōu)勢之一[25]；而截短42個氨基酸可能使其不能進(jìn)行膜定位，影響了蛋白的正確折疊和催化活性區(qū)域空間結(jié)構(gòu)的形成，從而導(dǎo)致其功能遭到破壞。

3 結(jié) 論

（1）利用組合設(shè)計(jì)策略將不同來源、不同截短形式以及不同啟動子調(diào)控的紫杉二烯5α羥化酶和P450還原酶進(jìn)行組合和分別表達(dá)，在72種組合中篩選得到48個產(chǎn)5α羥化紫杉二烯醇的釀酒酵母菌株，產(chǎn)量最高為67.3 μg·L-1，其對應(yīng)的最佳組合為東北紅豆杉源羥化酶（t24）與東北紅豆杉源還原酶（t74）組合，且羥化酶基因和還原酶基因均為強(qiáng)啟動子調(diào)控。因而在后續(xù)的研究中，可以嘗試在釀酒酵母中對羥化酶和還原酶采取融合表達(dá)策略，對兩者進(jìn)行統(tǒng)一調(diào)控，通過酶的空間距離的調(diào)節(jié)來研究其對催化目標(biāo)產(chǎn)物合成的影響。

表2 本研究所構(gòu)建菌株5α羥化紫杉二烯醇產(chǎn)量Table 2 Titer of taxadien-5α-ol of all strains constructed in this study

（2）在產(chǎn)紫杉二烯的釀酒酵母底盤中共表達(dá)紫杉二烯5α羥化酶和P450還原酶，得到的氧化產(chǎn)物并不單一，除目標(biāo)產(chǎn)物5α羥化紫杉二烯醇外，還包含副產(chǎn)物OCT以及多個（本研究中為3個）未知的紫杉二烯羥化物，統(tǒng)稱為紫杉烷類化合物。

（3）在所選用的3種不同來源的紫杉二烯5α羥化酶中，東北紅豆杉源羥化酶催化活性最高，其次為曼地亞紅豆杉源羥化酶，而中國紅豆杉源羥化酶活性較差。

圖7 不同來源羥化酶對5α羥化紫杉二烯醇產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of different taxadien 5α-hydroxylase on taxadien-5α-ol production

（4）在釀酒酵母中表達(dá)全長或N端截短24個氨基酸殘基的紫杉二烯5α羥化酶，均可以得到5α羥化紫杉二烯醇及其他羥化產(chǎn)物，而表達(dá)N端截短42個氨基酸殘基的羥化酶，則不能得到任何羥化產(chǎn)物。后續(xù)可借助分子模擬等手段分析羥化酶的膜結(jié)合及其與底物紫杉二烯的相互作用方式，用于指導(dǎo)對羥化酶的定向進(jìn)化等改造，提高其催化效率和產(chǎn)物專一性，進(jìn)而提高該催化過程的轉(zhuǎn)化率，提高5α羥化紫杉二烯醇產(chǎn)量。

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Foundation item: supported by the National High Technology Research and Development Program of China (2012AA02A701) and the Foundation for the Author of National Excellent Doctoral Dissertation of China (201456).

Combinatorial design and construction of artificial yeast for production of taxadien-5α-ol

ZHAI Fang, SONG Tianqing, XIAO Wenhai, DING Mingzhu, QIAO Jianjun, YUAN Yingjin
(Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education; Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University; Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering (Tianjin), Tianjin 300072, China)

Abstract:Producing natural drugs such as Taxol by engineered microbes have attracted extensive attention in recent years. This work focused on how to design and construct artificial yeast for the production of taxadien-5α-ol, which was the first hydroxylated product catalyzed by cytochrome P450 enzymes in Taxol biosynthesis pathway. Based on combinatorial design, three hydroxylase genes derived from different yew subspecies and two reductase genes from different organisms with N-terminal truncatd with various length were tested simultaneously to investigate the fitness between the genes and the chassis. Two kinds of promoters were used for regulating the cytochrome P450 reductase genes. In total, 72 kinds of combinations were constructed and then integrated into the chromosome of the taxadiene producing strain. 48 taxadine-5α-ol producing strains were obtained out of 72 combinations by co-expression of the hydroxylase and the reductase. The highest titer was 67.3 μg·L-1. This was the first time to realize the biosynthesis of taxadine-5α-ol form glucose in Saccharomyces cerevisiae. The result provided a good reference for the research of the catalytic reaction mediated by cytochromebook=316,ebook=324P450 enzymes in microbes through the interactions between modules and chassis by combinatorial design.

Key words:synthetic biology; taxadien-5α-ol; combinatorial design; Saccharomyces cerevisiae; biocatalysis; fermentation

Corresponding author:XIAO Wenhai, wenhai.xiao@tju.edu.cn

基金項(xiàng)目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA02A701)；高等學(xué)校全國優(yōu)秀博士學(xué)位論文作者專項(xiàng)基金（201456）。

中圖分類號：Q 819

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0438—1157（2016）01—0315—09

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20150992