張 婷，廖金龍，柴晶黨，葉 丹，歐陽(yáng)婧

(江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌 330013)

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仔豬抗大腸桿菌性F4ac腹瀉病分子遺傳機(jī)理研究進(jìn)展

張 婷，廖金龍，柴晶黨，葉 丹，歐陽(yáng)婧*

(江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌 330013)

摘要產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F4ac(ETEC F4ac)是引發(fā)新生和斷奶前仔豬腹瀉病的最主要致病菌，分離和鑒別豬ETEC F4ac受體目的基因及因果突變位點(diǎn)成為豬ETEC F4ac腹瀉抗病育種的關(guān)鍵。對(duì)仔豬抗大腸桿菌性腹瀉病分子遺傳機(jī)理研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為培育種豬抗腹瀉病新品系奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞仔豬；ETEC F4ac；遺傳機(jī)理

新生及斷奶仔豬腹瀉病是養(yǎng)豬生產(chǎn)中的一種常見(jiàn)疾病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)報(bào)道，在一些養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家，新生仔豬腹瀉的發(fā)病率高達(dá)75.0%[1]。我國(guó)仔豬的腹瀉發(fā)病率也很高，全年平均發(fā)病率為46.5%[2]。研究表明，引發(fā)新生仔豬腹瀉病的致病菌主要是產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F4ac(ETEC F4ac)[3]。ETEC F4ac的致病性取決于該致病菌是否與豬小腸上皮細(xì)胞表面刷狀緣的受體特異性結(jié)合。當(dāng)該致病菌與小腸上皮細(xì)胞表面刷狀緣結(jié)合后，ETEC F4ac大量繁殖產(chǎn)生腸毒素，所產(chǎn)生的腸毒素致使腸上皮細(xì)胞分泌功能亢進(jìn)，大量水和電解質(zhì)進(jìn)入腸腔，造成腸腔中大量液體積蓄，超過(guò)了腸壁重吸收能力從而引起腹瀉。由此可見(jiàn)，仔豬小腸上皮細(xì)胞有無(wú)ETEC F4ac受體是仔豬被ETEC F4ac感染時(shí)是否發(fā)病的關(guān)鍵。無(wú)受體豬表現(xiàn)為抵抗型，有受體豬則表現(xiàn)為易感型[4]。分離和鑒別豬ETEC F4ac受體目的基因及因果突變位點(diǎn)成為豬ETEC F4ac腹瀉抗病育種的關(guān)鍵。筆者對(duì)仔豬抗大腸桿菌性腹瀉病分子遺傳機(jī)理研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為培育種豬抗腹瀉病新品系奠定理論基礎(chǔ)。

1產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)亞型

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)根據(jù)其侵染特點(diǎn)可分為5種亞型，分別為F4、F18、F5、F6和F41，在這5種亞型病原體中，F(xiàn)4和F18是斷奶仔豬腹瀉的主要致病菌[5]。F18主要引發(fā)斷奶仔豬水腫病和腹瀉病，而F4主要引發(fā)新生仔豬及早期斷奶仔豬腹瀉病[6]。研究表明，ETEC F18的受體基因?yàn)镕UT1，F(xiàn)UT1基因在307位點(diǎn)處發(fā)生了A>G突變，該位點(diǎn)的突變決定了F18能否與受體結(jié)合從而導(dǎo)致腹瀉[7]。根據(jù)免疫學(xué)特征將ETEC F4分為ab、ac和ad 3種亞型[8]，在這3種亞型中，F(xiàn)4ac是最主要的致病菌[4]。F4ac有2個(gè)分子量分別為210和240 ku的分泌型糖蛋白受體[9]，這2種糖蛋白所含的β-連接的半乳糖是F4ac識(shí)別受體分子的重要組成部分。鑒別ETEC F4ac受體基因及其因果突變是目前國(guó)際上仔豬抗大腸桿菌性腹瀉研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

2ETEC F4ac受體基因的定位研究

Gibbons等[10]研究表明，豬ETEC F4ac受體為單基因控制，呈顯隱性遺傳模式。攜帶顯性基因S的仔豬對(duì)ETEC F4ac的黏附易感，隱性基因s純合仔豬則表現(xiàn)為抵抗型。F4ac受體基因的定位和鑒別得到了國(guó)內(nèi)外的重視。

1995年，Edfors-Lilja等[11]利用歐洲野豬×大白豬資源家系群體為材料，經(jīng)過(guò)三代系譜的連鎖分析，將ETEC F4ac受體定位于13號(hào)染色體，與Tf基因緊密連鎖，發(fā)現(xiàn)F4ab和F4ac受體位點(diǎn)緊密連鎖，但這2個(gè)受體卻位于不同的位點(diǎn)。2002年，Python等[12]以大白豬和大白×長(zhǎng)白三代家系為材料，利用13號(hào)染色體的微衛(wèi)星標(biāo)記信息，將ETEC F4ac受體進(jìn)一步定位于S0068和Sw1030之間，與其中的S0075和Sw225高度連鎖(θ=0.00)。該研究結(jié)果在1年后J?rgensen等[13]開展的基因定位研究中得到了驗(yàn)證，他們還利用FISH和輻射雜種細(xì)胞克隆板技術(shù)揭示ETEC F4ac受體位于13號(hào)染色體q41區(qū)(SSC13q41)，分別與人3號(hào)染色體的q28～q29和q21區(qū)同源。2009～2011年，Joller等[14]、Jacobsen等[15]和Rampold等[16]先后將ETEC F4ac受體進(jìn)一步定位于5.7～3.1 cM，通過(guò)進(jìn)一步的區(qū)間定位最終定位到LMLN-S0283較小區(qū)間。

李玉華等[17]利用松遼黑豬和長(zhǎng)白豬雜交群為試驗(yàn)群體，開展了ETEC F4黏附表型分布等研究，Niu等[18]利用松遼黑豬和長(zhǎng)白豬雜交群，采用增加微衛(wèi)星標(biāo)記密度，開展基于家系不平衡檢測(cè)的精細(xì)定位，將F4ac受體基因定位于豬13號(hào)染色體S0283和SW1876區(qū)域約1.6 cM區(qū)間。

Ren等[19]利用自身構(gòu)建的大規(guī)模白色杜洛克×二花臉資源家系群體，通過(guò)183個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)和具有ETEC F4ac體外黏附表型的755個(gè)F2個(gè)體和390個(gè)F3個(gè)體開展了全基因組連鎖分析、IBD分析及斷點(diǎn)重組分析，將ETEC F4ac受體基因精細(xì)定位于13號(hào)染色體q41區(qū)(SSC13q41)臨近S0283的約3.5 cM區(qū)域。通過(guò)全基因組連鎖定位分析和目的區(qū)域的重組斷點(diǎn)事件分析，將目標(biāo)區(qū)域縮小至UMNp595與 ALGA0072095之間2.3 Mb區(qū)域。以上工作推動(dòng)了仔豬ETEC F4ac受體基因的研究進(jìn)展。

3ETEC F4ac受體位置候選基因研究

鑒別SSC13q41區(qū)域的位置候選基因是目前ETEC F4ac受體研究的重點(diǎn)。大量免疫生化特性研究表明，黏蛋白型唾液糖蛋白(IMTGP)、74 ku的轉(zhuǎn)鐵蛋白(GV74)和小腸中性糖鞘H(mLad)符合ETEC F4ac受體的理化特征，其中黏蛋白型唾液糖蛋白與F4ab 和F4ac結(jié)合，但不與F4ad結(jié)合，且該糖蛋白的存在與新生仔豬對(duì)ETEC F4ab或F4ac的敏感性高度相關(guān)[5]，因而成為ETEC F4ac受體候選基因選擇的重要依據(jù)。Kreuzev等[20]在獲得ETEC F4ac受體基因染色體定位信息后，選擇黏附素糖蛋白編碼基因(MUC基因家族)和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因(TFRC)進(jìn)行研究，Python等[12]對(duì)TFRC、B3GnT5、B4GALT4和B4GALT4 4個(gè)基因進(jìn)行了研究，但未發(fā)現(xiàn)與F4ac黏附表型顯著相關(guān)的候選基因和標(biāo)記。

J?rgensen等[13]在歐洲野豬×大白豬資源家系群體中，發(fā)現(xiàn)了Mucin4基因內(nèi)含子7的一個(gè)SNP標(biāo)記與ETEC F4ac的黏附表型共分離。Peng等[21]與J?rgensen等[13]就該位點(diǎn)的影響效應(yīng)開展了合作科研，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記在所構(gòu)建的白色杜洛克×二花臉資源家系始祖動(dòng)物中無(wú)多態(tài)性，而Peng等[21]的家系F2個(gè)體中有充分分離的ETEC F4ac黏附表型，這表明該SNP標(biāo)記只與ETEC F4ac受體基因因果突變(causative mutation)呈一定連鎖不平衡的分子標(biāo)記，不能解釋所有群體的ETEC F4ac受體遺傳基礎(chǔ)。

在精細(xì)定位基礎(chǔ)上，Ren等[19]構(gòu)建了包括20個(gè)功能基因座位的SSC13q41人-豬高分辨率比較基因圖譜，并先后對(duì)該區(qū)域內(nèi)的黏附素13(MUC13)、黏附素20(MUC20)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(TFRC)3個(gè)位置候選基因開展了研究，雖獲得了一些可喜的結(jié)果，但未鑒別到與ETEC F4ac易感/抗性表型共分離的多態(tài)位點(diǎn)。Huang等[22]利用比較基因組法在該區(qū)域的黏附素4(MUC4)基因中開發(fā)了一個(gè)STS(sequence tagged site)，并在位于內(nèi)含子區(qū)鑒別到一個(gè)與ETEC F4ac易感/抗性雖非共分離但呈強(qiáng)相關(guān)的SNP位點(diǎn)。

筆者采用豬60K芯片，利用其中39720個(gè)有效SNPs開展全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)合連鎖與連鎖不平衡分析，揭示MUC13基因?yàn)樽羁赡艿哪康幕颉Ｔ诎∕UC13基因的2.3 Mb區(qū)域進(jìn)一步搜尋和鑒別了193個(gè)SNPs標(biāo)記，利用這些標(biāo)記在已經(jīng)黏附表型測(cè)定的分布于10省(市)12個(gè)中國(guó)地方豬種和3個(gè)西方商業(yè)豬種共292個(gè)無(wú)相關(guān)個(gè)體中開展關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果支持MUC13基因?yàn)槟康幕?。針?duì)MUC13基因進(jìn)一步試驗(yàn)表明，MUC13基因編碼2個(gè)轉(zhuǎn)錄本(MUC13A 和MUC13B)，2個(gè)轉(zhuǎn)錄本對(duì)應(yīng)的等位基因MUC13A和MUC13B之間的差別在于其第2外顯子所含的高度串聯(lián)重復(fù)區(qū)和側(cè)翼的內(nèi)含子68 bp缺少，利用內(nèi)含子68 bp缺少差異作為標(biāo)簽標(biāo)記，在大樣本無(wú)相關(guān)個(gè)體中進(jìn)行分析，結(jié)果表明，所有124 頭對(duì)F4ac抗性個(gè)體均為MUC13A純合子，而所有對(duì)F4ac易感的594頭豬至少含有一個(gè)MUC13B等位基因，進(jìn)一步支持了MUC13為目的基因[23]。

Ren等[19]進(jìn)一步通過(guò)qRT-PCR試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MUC13基因的表達(dá)量與黏附表型無(wú)關(guān)，由此推斷MUC13基因的因果突變屬于引起MUC13基因功能改變的編碼突變。進(jìn)一步對(duì)除MUC13基因高GC含量、高度串聯(lián)重復(fù)的PTS區(qū)(富含脯氨酸、蘇氨酸和絲氨酸的區(qū)域)外的所有基因區(qū)域進(jìn)行SNPs搜尋，鑒別到22個(gè)cSNPs和55個(gè)內(nèi)含子突變，將這些SNPs在遠(yuǎn)緣群體中開展關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果無(wú)一個(gè)與表型共分離SNP。由此推斷MUC13基因的因果突變極有可能位于高度串聯(lián)重復(fù)的PTS區(qū)。另外根據(jù)MUC型家族其他成員的研究，高度串聯(lián)重復(fù)的PTS區(qū)構(gòu)成MUC的糖基化結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)賦予MUC重要的生物功能，因此，串聯(lián)重復(fù)的數(shù)目、長(zhǎng)度及序列變異都將影響到糖基化的程度及類型，由此影響MUC蛋白的功能。由此可以判斷MUC13基因的因果突變位于高度串聯(lián)重復(fù)的PTS區(qū)。

Fu等[24]開展了基于GWAS分析的ETEC F4ac受體基因精細(xì)定位，將目標(biāo)區(qū)域定位至2.6 Mb區(qū)域，進(jìn)一步確定該區(qū)域中的TNK2、ZNF148、HEG1、MUC13 和ITGB5 為最有可能的位置候選基因。Zhou等[25]將ETEC F4ac受體最重要的候選基因ITGB5和MUC13采用基因沉默策略開展功能分析，進(jìn)一步證實(shí)了ITGB5和MUC13基因在ETEC 黏附過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。

Goetstouwers等[26]以大白、比利時(shí)長(zhǎng)白以及大白與比利時(shí)長(zhǎng)白的雜交豬種為研究對(duì)象，通過(guò)體外ETEC的鞭毛黏附性試驗(yàn)以及全基因組關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)ETEC F4ac 的受體可能位于MUC13基因的鄰近區(qū)域。

4展望

雖然目前仔豬抗ETEC F4ac腹瀉目的基因鑒別取得了重大突破，對(duì)多個(gè)位置候選基因尤其是MUC13基因也開展了許多卓有成效的試驗(yàn)，仍有以下尚未解決的關(guān)鍵問(wèn)題：①真正的目的基因及其因果突變位點(diǎn)(causative mutation)尚未鑒別到；②因果突變位點(diǎn)功能分析尚未進(jìn)行；③因果突變位點(diǎn)的遺傳起源進(jìn)化也有待研究。因而對(duì)于真正解析豬F4ac腹瀉病分子機(jī)理而言，尚需開展大量深入的研究?？梢圆捎矛F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)如通過(guò)目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序或長(zhǎng)片段擴(kuò)增子測(cè)序等技術(shù)結(jié)合功能分析策略鑒別到目的基因及其因果突變位點(diǎn)，深入解析其分子機(jī)理及遺傳進(jìn)化，進(jìn)而全面揭示豬F4ac侵染腹瀉的抗病分子遺傳機(jī)理，為培育種豬抗腹瀉病新品系奠定理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] NIELSON N C，HOGH P，BILLE N.Proceedings of the 1980 international pig veterinary society congress[R].Proceedings of the International Pig Veterinary Society Congress，1980.

[2] 王紅寧.仔豬腹瀉成因及綜合防治技術(shù)措施[J].中國(guó)畜牧雜志，2006，42(6)：58-60.

[3]DONES，THOMSONJ，VARLEY.Proceedingsofthe15thinternationalpigveterinarysocietycongress[R].UniversityPress，1998.

[4]MOONHW，HOFFMANLJ，CORNICKNA，etal.PrevalencesofsomevirulencegenesamongEscherichia coliisolatesfromswinepresentedtoadiagnosticlaboratoryinIowa[J].JournalofveterinarydiagnosticinvestigationofficialpublicationoftheAmericanAssociationofVeterinaryLaboratoryDiagnosticiansInc，1999，11(6)：557-560.

[5]SHIG，SONGN.EnterotoxigenicEscherichia coli(K88)induceproinflammatoryresponsesinporcineintestinalepithelialcells[J].Developmental&comparativeimmunology，2010，34(11)：1175-1182.

[6]NGELEKAM.IsolationandassociationofEscherichia coliAIDA-I/STb，ratherthanEAST1pathotype，withdiarrheainpigletsandantibioticsensitivityofisolates[J].VetDiagnInvest，2003，15(3)：242-252.

[7]KREUZERS，REISSMANNM，BROCKMANNGA.Newfastandcost-effectivegenetesttogettheETECF18receptorstatusinpigs[J].Veterinarymicrobiology，2013，163(3/4)：392-394.

[8]VANDBW，COXE，OUDEGAB，etal.TheF4fimbrialantigenofEscherichia colianditsreceptors[J].Veterinarymicrobiology，2000，71(3/4)：223-244.

[9]GRANGEPA，ERICKSONAK，ANDERSONTJ，etal.Characterizationofthecarbohydratemoietyofintestinalmucin-typesialoglycoproteinreceptorsfortheK88acfimbrialadhesinofEscherichia coli[J].Infection&immunity，1998，66(4)：1613-1621.

[10]GIBBONSRA，SELLWOODR，BURROWSM，etal.InheritanceofresistancetoneonatalE.colidiarrhoeainthepig：Examinationofthegeneticsystem[J].Theoretical&appliedgenetics，1977，51(2)：65-70.

[11]EDFORS-LILJAI，GUSTAFSSONU，DUVAL-IFLANY，etal.TheporcineintestinalreceptorforEscherichia coliK88ab，K88ac：Regionallocalizationonchromosome13andinfluenceofIgGresponsetotheK88antigen[J].Animalgenetics，1995，26(4)：237-242.

[12]PYTHONP，JORGH，NEUENSCHWANDERS，etal.Fine-mappingoftheintestinalreceptorlocusforenterotoxigenicEscherichia coliF4aconporcinechromosome13[J].Animalgenetics，2002，33(6)：441-447.

[13]J?RGENS?NCB，CIRERAS，ANDERSONSI，etal.LinkageandcomparativemappingofthelocuscontrollingsusceptibilitytowardsE.coilF4ab/acdiarrhoeainpigs[J].Cytogenetic&genomeresearch，2003，102(1/2/3/4)：157-162.

[14]JOLLERD，JORGENSONCB，BERTSCHINGERHU，etal.RefinedlocalizationoftheEscherichia coliF4ab/F4acreceptorlocusonpigchromosome13[J].Animalgenetics，2009，40(5)：749-752.

[15]JACOBSENM，KRACHTSS，ESTESOG，etal.RefinedcandidateregionspecifiedbyhaplotypesharingforEscherichia coliF4ab/F4acsusceptibilityallelesinpigs[J].Animalgenetics，2010，41(1)：21-25.

[16]RAMPOLDIA，JACOBSENMJ，BERTSCHINGERHU，etal.ThereceptorlocusforEscherichia coliF4ab/F4acinthepigmapsdistaltotheMUC4-LMLNregion[J].Mammaliangenomeofficialjournaloftheinternationalmammaliangenomesociety，2011，22(1/2)：122-129.

[17] 李玉華，邱小田，李何君，等.大腸桿菌F4在3個(gè)品種豬中的黏附模式[J].遺傳學(xué)報(bào)，2007，34(7)：591-599.

[18]NIUX，LIY，DINGX，etal.RefinedmappingoftheEscherichia coliF4ab/F4acreceptorgene(s)onpigchromosome13[J].Animalgenetics，2011，42(5)：552-555.

[19]RENJ，TANGH，YANX，etal.Apig-humancomparativeRHmapcomprising20genesonpigchromosome13q41thatharbourstheETECF4acreceptorlocus[J].Journalofanimalbreeding&genetics，2009，126(1):30-36.

[20]KREUZERS，REISSMANNM，BROCKMANNGA.Newfastandcost-effectivegenetesttogettheETECF18receptorstatusinpigs[J].Veterinarymicrobiology，2013，163(3/4)：392-394.

[21]PENGQL，RENJ，YANXM，etal.Theg.243A>Gmutationinintron17ofMUC4issignificantlyassociatedwithsusceptibility/resistancetoETECF4ab/acinfectioninpigs[J].Animalgenetics，2007，38(4)：397-400.

[22]HUANGX，RENJ，YANXM，etal.Polymorphismsofthreegene-derivedSTSonpigchromosome13q41areassociatedwithsusceptibilitytoenterotoxigenicEscherichia coliF4ab/acinpigs[J].ScienceinChina，2008，51(7):614-619.

[23]JUNR,XUEMINGY,HUASHUIA,etal.SusceptibilitytowardsenterotoxigenicEscherichia coliF4acdiarrheaisgovernedbytheMUC13geneinpigs[J].PlosOne, 2012, 7(9):44573.

[24]FUWX,LIUY,LUX，etal.Agenome-wideassociationstudyidentifiestwonovelpromisingcandidategenesaffectingEscherichia coliF4ab/F4acsusceptibilityinswine[J].PlosOne，2012，7(3)：32127-32127.

[25]ZHOUCL，LIUZZ，LIUY，etal.GenesilencingofporcineMUC13andITGB5：CandidategenestowardsEscherichia coliF4acadhesion[J].PlosOne，2012，158(1/2)：477-512.

[26]GOETSTOUWERST，VANPOUCKEM，COPPIETERSW，etal.RefinedcandidateregionforF4ab/acenterotoxigenicEscherichia colisusceptibilitysituatedproximaltoMUC13inpigs[J].PlosOne，2014，9(8)：105013.

基金項(xiàng)目江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20143ACB21006 )；江西省教育廳科技項(xiàng)目(GJJ14571)；江西科技師范大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)業(yè)、科研基金項(xiàng)目(20140801007，20140804075)。

作者簡(jiǎn)介張婷(1988- )，女，山東泰安人，碩士研究生，研究方向：分子遺傳學(xué)。*通訊作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事分子抗病遺傳育種研究。

收稿日期2016-03-22

中圖分類號(hào)S 852.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)13-144-02

Research Progress of the Molecular Genetic Mechanism Resistant to ETEC Diarrhea Disease in Piglet

ZHANG Ting, LIAO Jin-long, CHAI Jing-dang, OUYANG Jing*et al

(College of Life Science, Jiangxi Science & Technology Normal University, Nanchang, Jiangxi 330013)

AbstractEnterotoxigenic Escherichia coli F4ac (ETEC F4ac) were major causes of diarrhea in piglets. Therefore, identification and isolation of piglet ETEC F4ac Receptor genes and causal mutations were the keys to diarrhea disease resistance breeding of piglet ETEC F4ac. In this research, the research progress on the molecular genetic mechanism resistant to ETEC diarrhea disease in piglet was reviewed, aiming at providing references for the research on new lines cultivation of anti-diarrhea piglet.

Key wordsPiglet; ETEC F4ac; Genetic mechanism