初 航，盧盛文，孔 玲，韓 瑩，韓金偉，劉志東，張愛華，王喜軍

（黑龍江中醫(yī)藥大學國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥血清藥物化學重點研究室/中美中醫(yī)方證代謝組學技術(shù)合作中心 哈爾濱 150040）

基于中醫(yī)方證代謝組學的開心散干預(yù)老年癡呆癥大鼠的效應(yīng)物質(zhì)動態(tài)分析＊

初 航，盧盛文，孔 玲，韓 瑩，韓金偉，劉志東，張愛華，王喜軍＊＊

（黑龍江中醫(yī)藥大學國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學研究中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥血清藥物化學重點研究室/中美中醫(yī)方證代謝組學技術(shù)合作中心 哈爾濱 150040）

目的：本研究在開心散干預(yù)氯化鋁聯(lián)合D-半乳糖誘導老年癡呆癥大鼠模型有效性的基礎(chǔ)上，揭示開心散對老年癡呆癥（AD）不同階段干預(yù)作用的代謝物靶點，構(gòu)建開心散體內(nèi)成分與內(nèi)源性生物標記物的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，分析開心散對AD發(fā)展過程干預(yù)作用的效應(yīng)物質(zhì)的動態(tài)變化。方法：利用行為學指標評價模型復制進程以及開心散的干預(yù)作用；運用代謝組學技術(shù)和方法分析開心散對AD大鼠模型不同階段干預(yù)作用的靶點；應(yīng)用UPLC-MS技術(shù)和MSE質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集模式，分別對開心散體外化學成分和口服給藥后的血中移行成分進行表征及鑒定；利用PCMS手段，構(gòu)建復方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與內(nèi)源性生物標記物的數(shù)理模型，發(fā)掘開心散防治老年癡呆癥不同階段的效應(yīng)物質(zhì)。結(jié)果：給予AD大鼠開心散溶液治療后，模型大鼠的認知功能得到改善，其病理學進程得以延緩。代謝組學研究表明，開心散對AD模型不同階段標記物的異常表達起到恢復作用，體現(xiàn)了開心散干預(yù)老年癡呆癥多靶點、多途徑的特點。結(jié)論：基于中醫(yī)方證代謝組學方法為開心散減緩AD進程研究提供了新的思路。

老年癡呆癥 開心散 代謝組學 中醫(yī)方證代謝組學

“辨證論治”是中醫(yī)學的基本特點，“方證相應(yīng)”是中醫(yī)理論的精髓。中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是指中藥中含有的能夠表達藥物臨床療效的化學成分總稱[1]。由于中藥的化學成分復雜，而有單味中藥配伍的中藥復方（方劑）不同成分之間相互作用以及產(chǎn)生的變化更為復雜，想要揭示中藥復方中真正起效的成分成為了一道難題，而中藥復方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究成為了中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵性問題[2]。中醫(yī)方證代謝組學是將中藥血清藥物化學和代謝組學有機結(jié)合，在解決證候生物標記物的基礎(chǔ)上，建立方劑藥效生物評價體系，進而發(fā)現(xiàn)與臨床療效直接相關(guān)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，闡明作用機制的方法學體系[3]。

老年癡呆癥（Alzheimer's Disease，AD）又稱阿爾茲海默病，是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。老年癡呆癥不僅嚴重影響人類的身體健康和生活質(zhì)量，同時也給患者家庭和社會帶來沉重負擔。AD是一種復雜性疾病，其發(fā)生發(fā)展是一種連續(xù)的病理生理過程，由于其發(fā)病的不可逆性，AD基礎(chǔ)和臨床研究的時間點應(yīng)該前移[4]。開心散是中醫(yī)益智、安神定驚、治療健忘的基本方，是治療癡呆的經(jīng)典方劑?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果證明，開心散四味藥材均能在不同程度上起到益智的作用，開心散對老年癡呆癥的治療有多靶點、多方位的優(yōu)勢，但開心散治療老年癡呆癥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制仍然不清楚。因此，有必要對開心散干預(yù)老年癡呆癥的機制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進行評價及探討。

1 材料

1.1 實驗藥品與試劑

生曬參Panax ginseng C. A. Mey.、茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf、遠志Polygala tenuifolia Willd.、石菖蒲Acorus tatarinowii Schott.均購于北京同仁堂藥店。

無水氯化鋁（分析級，天津市光復精細化工研究所），D-半乳糖（合肥Biosharp生物科技公司），戊巴比妥鈉粉末（上?；瘜W試劑采購供應(yīng)站），蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司），乙腈（色譜級，德國Merck公司），甲醇（色譜級，美國Fisher公司），甲酸（色譜級，天津科密歐化學試劑有限公司），亮氨酸腦啡肽（美國Sigma公司）；實驗所用其它試劑均為分析級。

1.2 實驗動物

Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量260±20 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，許可證號：P00102004。室溫飼養(yǎng)，動物自由攝食飲水。

1.3 實驗儀器

Morris水迷宮（中國醫(yī)學科學院藥物研究所）；AcquityTMUPLC液相色譜儀（四元梯度泵-在線真空脫氣機-自動進樣器-二極管陣列檢測器-柱溫箱）；SynaptTMG2-Si 質(zhì)譜分析系統(tǒng)（高分辨四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀）。

1.4 供試品制備

1.4.1 開心散凍干粉的制備

按原方比例，即人參：茯苓：遠志：石菖蒲=3：3：2：2，稱取藥材粗粉，混勻。用6倍量70%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h，合并濾液，濃縮，并用冷凍干燥法干燥，得疏松粉末[5]。

1.4.2 開心散灌胃溶液的制備

取開心散凍干粉溶于蒸餾水中，配制成生藥濃度為0.54 g·mL-1的開心散灌胃溶液，以10 mL·kg-1的劑量灌胃治療。

1.4.3 開心散體外成分分析樣品制備

取開心散凍干粉適量，加入10倍量50%甲醇混勻，超聲10 min，在13 000 rpm、4℃條件下離心10 min，取上清液過0.22 μm的微孔濾膜。

1.4.4 開心散體內(nèi)成分分析樣品制備

取空白血清和含藥血清各2 mL，緩慢通過已活化的Waters OASIS固相萃取柱，用甲醇3 mL洗脫，收集洗脫液氮氣流吹干，殘渣以200 μL甲醇定容，混懸震蕩60 s，在13 000 rpm、4℃條件下離心10 min，取上清液。

2 實驗方法

2.1 實驗分組及設(shè)計

將Wistar大鼠隨機分為空白對照組10只，AD模型組1-4組各10只，開心散干預(yù)（KXS）組1-4組各10只。AD模型組以及KXS組大鼠每日灌胃給予氯化鋁（AlCl3）28 mg·kg-1。同時腹腔注射D-半乳糖（D-galactose，D-gal），每日注射劑量為63 mg·kg-1，共90天?？瞻讓φ战M每天給予等量生理鹽水。

空白對照組于實驗第85天，AD模型1-4組、KXS組1-4組分別于實驗第10、40、55、85天，進行6天的Morris水迷宮實驗，并于行為學實驗后進行尿液、血液的采集。

2.2 Morris水迷宮行為學評價

2.2.1 定位航行實驗

定位航行實驗用于測量大鼠的學習能力，實驗歷時5天，從第1天起，每天于同一時間訓練大鼠。首先將池水用奶粉攪拌成奶白色以便掩蓋平臺，訓練時水面高出平臺2 cm；利用軟件將水迷宮分成4個象限，每天分別在四個象限的固定位置大鼠面向池壁放入水中，記錄其尋找并爬上平臺所需的時間（潛伏期），每次學習時限60 s；若大鼠在60 s內(nèi)未找到平臺，須利用標桿將其引至平臺，此時潛伏期記為60 s。

2.2.2 空間搜索實驗

空間探索實驗用于評價大鼠學會尋找平臺后對平臺空間位置記憶的能力，于定位航行實驗后，在第6天撤除水下平臺，于4個象限內(nèi)隨機選取一入水點，記錄其在60 s內(nèi)跨過原平臺相應(yīng)位置的次數(shù)。

2.3 生物樣本采集及處理方法

尿液樣品于4℃，13 000 rpm離心15 min后取上層清液，蒸餾水稀釋一倍，振蕩，過0.22 μm的微孔濾膜。大鼠3%戊巴比妥鈉麻醉，取血清備用。

2.4 尿液代謝組學數(shù)據(jù)采集

色譜分析條件：色譜柱：ACQUITY UPLCTMHSST3 column（100 mm×2.1 mm i.d.，1.8 μm）；流動相：A為0.1%甲酸乙腈，B為0.1%甲酸水；柱溫預(yù)設(shè)：45℃；流速：0.4 mL·min-1；進樣體積：2 μL；梯度洗脫程序為：0-2.5 min，1%-11% A；2.5-4.5 min，11%-21% A；4.5-7.0 min，21%-40% A；7.0-8.5 min，40%-99% A；10.5-10.6 min，99%-1% A；再平衡1.5 min后采集下一樣品。質(zhì)譜分析條件：電噴霧離子源（ESI）；正負離子掃描模式：脫溶劑氣流量：800 L·h-1；脫溶劑氣溫度：450℃；離子源溫度：110℃；錐孔電壓：20.0 V；毛細管電壓：3.0 kV；鎖定質(zhì)量溶液：采用美國Waters公司Lockspray校正系統(tǒng)進行在線質(zhì)量校正，亮氨酸-腦啡肽（Leueine-Enkephalin，[M+H]+=556.277 1，[M-H]-=554.277 1），溶液濃度為1 ng·mL-1，流速為5 μL·min-1；質(zhì)量掃描范圍：m/z 50-1 000 Da，掃描時間0.2 s；工作站：MassLynx V4.1工作站。

2.5 開心散體內(nèi)外化學成分數(shù)據(jù)采集

色譜分析方法：色譜柱：ACQUITY UPLCTMC18 column（100 mm×2.1 mm i.d.，1.7 μm）；流動相：A為0.1%甲酸乙腈，B為0.1%甲酸水；柱溫預(yù)設(shè)：45℃；流速：0.4 mL·min-1；進樣體積：3 μL。梯度洗脫程序為：0-1 min，2%-20% A；1-4 min，20%-21% A；4-6.5 min，21%-30% A，；6.5-9.5 min，30%-35% A；9.5-14 min，35%-50% A；14-16 min，50%-52% A；16-16.5 min，52%-82% A；16.5-19min，82%-83% A；19-19.5 min，83%-100% A；19.5-20.0 min，2% A。質(zhì)譜分析方法：毛細管電壓正離子掃描為3.0 kV，負離子掃描為2.8 kV，脫溶劑溫度為350 ℃，采樣錐孔電壓為30 V，離子源溫度為110 ℃，脫溶劑氣流量為600 L·h-1。質(zhì)譜數(shù)據(jù)在全掃描方式下用MSE模式進行采集，低碰撞能為6 V，高碰撞能為20-40 V，質(zhì)量掃描范圍為50-1 500 Da，掃描時間為0.2 s。

2.6 數(shù)據(jù)處理

2.6.1 統(tǒng)計學處理

2.6.2 代謝組學數(shù)據(jù)處理

將得到的尿液UPLC-MS數(shù)據(jù)輸入Progenesis QI 軟件進行化合物鑒定和多變量統(tǒng)計分析。對各組不同時間點數(shù)據(jù)進行非監(jiān)督型主成分（Principal Components Analysis，PCA）分析。同時對各組所獲得信息數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，比較模型組和空白組各離子含量差別是否具有統(tǒng)計學意義，篩選出這些差異離子（P＜0.05）作為潛在生物標記物集合。對潛在的標記物，將得到的保留時間和質(zhì)核比數(shù)據(jù)，結(jié)合軟件中化合物鑒定功能與代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫（HMDB）搜索，對這些差異離子進行初步確認。再通過UPLC-MS/MS技術(shù)對潛在的離子進行二級數(shù)據(jù)掃描，通過碎片信息及其可能的裂解方式進行匹配，鑒定或表征各潛在生物標記物。

2.6.3 開心散體內(nèi)外化學成分分析

運用UNIFI天然產(chǎn)物整體解決方案，以UPLCMS采集的MSE數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，將高低碰撞能下獲得的準分子離子和碎片離子與UNIFI中藥數(shù)據(jù)庫進行匹配，對藥材來源及入血的開心散原型成分進行快速解析。并對其入血后的代謝成分進行表征，該軟件通過質(zhì)量短缺過濾技術(shù)（MDF）結(jié)合MassFragment TM模塊智能地進行母藥和代謝產(chǎn)物的二級碎片解析，進行結(jié)構(gòu)確認，并給出詳細的化合物可能的生物代謝轉(zhuǎn)化及化學元素組成。

2.6.4 相關(guān)性分析

運用代謝標記物與血清化學成分相關(guān)性分析方法（Plotting of Correlation Between Marker Metabolites and Serum Constituents，PCMS）對血清中外源性開心散成分與內(nèi)源性標記物兩組變量關(guān)聯(lián)度分析，提取與內(nèi)源性標記物高度關(guān)聯(lián)的開心散入血成分作為防治AD的潛在效應(yīng)物質(zhì)。將開心散入血成分群與生物標記物含量變化矩陣導入PCMS軟件。實驗設(shè)置0.7≤|r|≤0.75為高度正（負）相關(guān)，0.75≤|r|≤1為極度正（負）相關(guān)；入血成分與生物標記物相關(guān)的個數(shù)的達到6個及以上，認為該入血成分為潛在效應(yīng)物質(zhì)。

3 實驗結(jié)果

3.1 Morris水迷宮行為學評價

3.1.1 定位航行實驗評價

定位航行實驗結(jié)果顯示，在訓練第5天，與空白對照組大鼠相比，AD模型第4組大鼠的逃避潛伏期時間顯著延長（P＜0.05）。與模型組第4組大鼠相比，KXS第 4組大鼠逃避潛伏期時間顯著縮短（P＜0.05）。具體結(jié)果見圖1。

3.1.2 空間搜索實驗評價

空間搜索實驗結(jié)果顯示，與空白對照組大鼠相比，模型第4組大鼠經(jīng)過有效區(qū)域次數(shù)有顯著差異（P＜0.05）。與模型第4組大鼠相比，KXS第4組大鼠穿越平臺次數(shù)顯著增加（P＜0.01）。具體結(jié)果見圖2。

圖1 開心散對AD模型不同階段大鼠Morris水迷宮定位航行實驗的影響

圖2 開心散對AD模型大鼠Morris水迷宮空間搜索實驗的影響

3.2 代謝組學結(jié)果

圖3 空白組、AD模型組以及開心散給藥組大鼠尿液PCA分析后的Score plot圖

對各組尿液樣本數(shù)據(jù)分別進行PCA分析，發(fā)現(xiàn)在復制模型的進程中，AD模型組數(shù)據(jù)輪廓開始逐漸遠離空白組，而開心散給藥組有向正常對照組回調(diào)的趨勢。各階段PCA score-plot圖見圖3。對于所得化合物通過搜索代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫（HMDB），對差異離子（P＜0.05）進行初步確認。結(jié)合二級質(zhì)譜碎片信息，鑒定或表征各潛在生物標記物。根據(jù)以上步驟，AD造模過程第15天尿液中共鑒定出35個潛在的生物標記物（表1），開心散對其中31個具有調(diào)節(jié)作用；AD造模過程第45天尿液中共鑒定出48個潛在的生物標記物（表2），開心散對其中34個具有調(diào)節(jié)作用；AD造模過程第60天尿液中共鑒定出40個潛在的生物標記物（表3），開心散對其中29個具有調(diào)節(jié)作用；AD造模過程第90天尿液中共鑒定出 42個潛在的生物標記物（表4），開心散對其中22個具有調(diào)節(jié)作用。

續(xù)圖3 空白組、AD模型組以及開心散給藥組大鼠尿液PCA分析后的Score plot圖

3.3 開心散血中移形成分分析

利用UNIFI軟件結(jié)合中藥數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)開心入血的原型成分以及藥物代謝產(chǎn)物。確認了AD大鼠口服開心散后血中移行46個成分原型成分（表5），其中14個來源于人參的人參皂苷類成分，13個來源于茯苓的三萜酸類成分，18個來源于遠志的寡糖酯類和呫噸酮類成分，1個來源于石菖蒲。以及20個代謝產(chǎn)物（表6），其中1個來源于人參，14個來源于遠志，5個來源于茯苓。

3.4 潛在效應(yīng)物質(zhì)分析

采用PCMS分析方法計算66個血中移形成分與AD發(fā)展不同階段效應(yīng)標記物的相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見Heatmap圖（圖4）。開心散干預(yù)的尿液生物標記物與體內(nèi)顯效成分關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果顯示：第15天（圖4A）開心散的血中移行成分中，18個為高度相關(guān)成分，其中，4個來源于茯苓（包括茯苓新酸 C，25-甲氧基茯苓新酸，去氫齒孔酮酸，3β,16α-二羥基羊毛甾-7,9(11),24-三烯-21-酸），3個來源于人參（包括丙二?；藚⒃碥誖b1，人參皂苷Ra2，丙二?；藚⒃碥誖d），11個來源于遠志（包括乙酸苯酯，3-羥基-2,8-二甲氧基訕酮，6-羥基-1,2,3,7-四甲氧基訕酮，遠志訕酮Ⅰ，1,7-二甲氧基-2,3-亞甲二氧基訕酮，6,8-二羥基-1,2,3-三甲氧基訕酮，1,2,3,7-四甲氧基訕酮，西伯利亞遠志糖A6，西伯利亞遠志咕噸酮 A/B，遠志訕酮Ⅲ葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物，去乙基遠志訕酮 Ⅰ 葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物）；第45天（圖4B）的血中移行成分中，22個為高度相關(guān)成分。其中，7個來源于茯苓（包括茯苓新酸AM，茯苓新酸F，25-甲氧基茯苓新酸，去乙基茯苓新酸E代謝產(chǎn)物，去乙基茯苓新酸C代謝產(chǎn)物，去乙基土莫酸葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物，茯苓新酸F脫水代謝產(chǎn)物），9個來源于人參（包括人參皂苷Rb2，人參皂苷Rb1，人參皂苷Ra2，丙二?；藚⒃碥誖d，三七皂苷R1，20-O-葡萄糖基人參皂苷Rf，人參皂苷Rf，人參皂苷Ro，人參皂苷Rb1脫水代謝產(chǎn)物），6個來源于遠志（包括乙酸苯酯，6-羥基-1,2,3,7-四甲氧基訕酮，6,8-二羥基-1,2,3-三甲氧基訕酮，E-3,4,5-三甲氧基肉桂酸脫水代謝產(chǎn)物，遠志苷D脫水代謝產(chǎn)物，去乙基遠志訕酮Ⅱ葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物）；第60天（圖4C）的

血中移行成分中，27個為高度相關(guān)成分，其中，6個來源于茯苓（茯苓新酸G、25-羥基茯苓新酸C、茯苓新酸B、茯苓新酸D脫水代謝產(chǎn)物、25-甲氧基茯苓新酸、去乙基茯苓新酸C代謝產(chǎn)物），5個來源于人參（丙二?；藚⒃碥誖c、人參皂苷Ra2，丙二?；藚⒃碥誖d，三七皂苷R1，人參皂苷Rb1脫水代謝產(chǎn)物），16個來源于遠志（1,7-二甲氧基-2,3-亞甲二氧基訕酮、西伯利亞遠志糖A3、西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、西伯利亞遠志糖A1、西伯利亞遠志咕噸酮A/B、遠志訕酮Ⅲ、α-D-（6-O-芥子?；?吡喃葡萄糖基（1→2）-β-D-（3-O-芥子?；?呋喃果糖、遠志苷A、遠志次皂苷、去乙基E-3,4,5-三甲氧基肉桂酸、去乙基E-3,4,5-三甲氧基肉桂酸葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、遠志訕酮Ⅲ葡萄糖醛酸化產(chǎn)物、遠志訕酮Ⅰ葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、去乙基遠志訕酮Ⅱ葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、6-羥基-1,2,3,7-四甲氧基訕酮葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物）；第90天（圖4D）的血中移行成分中，31個為高度相關(guān)成分。其中，10個來源于茯苓（包括茯苓新酸C、茯苓新酸B、16-脫氧茯苓新酸B、去氫土莫酸、土莫酸、25-甲氧基茯苓新酸、茯苓新酸D脫水代謝產(chǎn)物、去乙基茯苓新酸C，去乙基土莫酸葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、去乙基茯苓新酸E），9個來源于人參（包括人參皂苷Rf，丙二?；藚⒃碥誖b1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Ra1、人參皂苷Ra2、三七皂苷R1、丙二?；藚⒃碥誖c），12個來源于遠志（包括乙酸苯酯、遠志訕酮Ⅰ、去乙基遠志訕酮Ⅰ葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、6,8-二羥基-1,2,3-三甲氧基訕酮葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、去乙基遠志苷D葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、6-羥基-1,2,3,7-四甲氧基訕酮葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、遠志訕酮Ⅰ葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、去乙基E-3,4,5-三甲氧基肉桂酸葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、去乙基遠志訕酮Ⅱ葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、遠志訕酮Ⅱ葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、E-3,4,5-三甲氧基肉桂酸葡萄糖醛酸化的代謝產(chǎn)物、1,6,7-三羥基-2,3-二甲氧基訕酮葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物、去乙基E-3,4,5-三甲氧基肉桂酸）。以上表明在伴隨給藥劑量的增加，相關(guān)性成分增加，高度相關(guān)性成分增加。

表1 開心散干預(yù)AD模型復制第15天大鼠尿液潛在生物標志物回調(diào)趨勢表

表2 開心散干預(yù)AD模型復制第45天大鼠尿液潛在生物標志物回調(diào)趨勢表

表3 開心散干預(yù)AD模型復制第60天大鼠尿液潛在生物標志物回調(diào)趨勢表

表4 開心散干預(yù)AD模型復制第90天大鼠尿液潛在生物標志物回調(diào)趨勢表

表5 AD模型大鼠口服開心散后血中移行成分（原型）

續(xù)表5

表6 AD模型大鼠口服開心散后血中代謝產(chǎn)物

續(xù)表6

4 討論

在開心散干預(yù)AD大鼠模型復制過程中，代謝物的異常表達得到回調(diào)，代謝通路的紊亂得到改善。在代謝層面驗證了開心散對AD模型疾病發(fā)展的的減緩作用[6]。現(xiàn)代藥理研究結(jié)果證明，開心散四味藥材均能在不同程度上起到益智的作用，從而使開心散起到益智、抗氧化、抗自由基損傷的效果。高度關(guān)聯(lián)的入血成分中，來源于君藥人參的人參皂苷原型成分最多，推測人參皂苷在體內(nèi)直接發(fā)揮其作用。人參皂苷Rb1對AD動物模型的學習記憶功能下降有明顯的改善[7]，并且對大腦皮層神經(jīng)元也有保護作用[8-10]。活化的小膠質(zhì)細胞可釋放大量的神經(jīng)毒素因子，導致神經(jīng)元細胞功能損傷甚至凋亡，而引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，最終導致AD。研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb2能夠降低小膠質(zhì)細胞活化對大鼠皮層神經(jīng)元的損傷，保護神經(jīng)元[11,12]。三七皂苷R1對心血管系統(tǒng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)等均具有保護作用，還有抗炎及抗癌等作用[13]。而高度相關(guān)的血中藥物代謝產(chǎn)物中，多為遠志中化學成分的代謝產(chǎn)物，推測遠志中的成分多通過機體代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)生藥效。遠志自古以來就是治療癡呆的常用藥物?，F(xiàn)代研究證明，遠志中的活性成分，如皂苷類、寡糖酯類、山酮類化合物等可以通過改善膽堿能系統(tǒng)功能[14-16]、抗氧化清除自由基[17,18]、保護神經(jīng)元[19,20]等不同途徑對AD產(chǎn)生治療作用[21]。

圖4 AD模型大鼠尿液生物標記物與血中移行成分相對峰面積關(guān)聯(lián)性分析Heatmap圖

續(xù)圖4 AD模型大鼠尿液生物標記物與血中移行成分相對峰面積關(guān)聯(lián)性分析Heatmap圖

綜上所述，本研究利用UPLC-MS技術(shù)，結(jié)合中藥血清藥物化學方法和代謝組學的研究方法，分析表征開心散體內(nèi)外成分，以及給藥后AD大鼠模型的行為學和代謝組學藥效評價，明確在干預(yù)AD模型大鼠有效性的前題下，分析發(fā)現(xiàn)入血的成分中多與造模引起的內(nèi)源性表達異常的脂類標記物表現(xiàn)出高度的關(guān)聯(lián)，推測開心散可能通過抑制氧化應(yīng)激從而改善 AD模型的疾病狀態(tài)，延緩AD的發(fā)展進程。本研究的成功實施，為從開心散體內(nèi)成分中篩選用于AD早期多靶點干預(yù)的有效成分組合奠定基礎(chǔ)，而中醫(yī)方證代謝組學是解決中藥有效性等相關(guān)科學問題的新策略。

1 王喜軍.中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的系統(tǒng)方法學——中醫(yī)方證代謝組學.中國中藥雜志,2015,40(1):13-17.

2 張愛華,孫暉,閆廣利,等.中藥有效性評價與藥效物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn).世界科學技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2016,18(5):719-723.

3 張愛華,孫暉,閆廣利,等.中醫(yī)方證代謝組學——中醫(yī)藥研究的新策略.中國中藥雜志,2015,40(04):569-576.

4 賈建平,王芬,袁泉,等.老年性癡呆早期的基因變異研究進展.生物化學與生物物理進展,2012,39(8):698-702.

5 Liu C, Zhang A, Han Y, et al. Ultra-high performance liquid chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry screening and analysis of potential bioactive compounds from traditional chinese medicine Kai-Xin-San, using a multivariate data processing approach and the MetaboLy. Rsc Advances, 2014, 5(1):85-92.

6 Chu H, Zhang A, Han Y, et al. Metabolomics approach to explore the effects of Kai-Xin-San on Alzheimer's disease using UPLC/ESI-QTOF mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2016, 1015-1016: 50-61.

7 Wang Y, Jing L, Zhang Z, et al. Anti-neuroinflammation effect of ginsenoside Rbl in a rat model of Alzheimer disease. Neurosci Lett, 2011, 487(1): 70-72.

8 曾育琦,陳曉春,朱元貴,等.人參皂苷Rb1抑制β淀粉樣蛋白25-35誘導的皮層神經(jīng)元tau蛋白過度磷酸化.藥學學報,2005,40(3):225-230.

9 黃天文,陳曉春,張靜,等. p25/cdk5可能參與人參皂苷Rb1減輕Aβ25-35誘導的tau蛋白過度磷酸化.中國藥理學通報, 2006, 22(6):688-693.

10 宋錦秋,陳曉春,張靜,等.人參皂苷Rb1通過JNK/p38 MAPK途徑減輕Aβ25-35誘導的胎鼠皮層神經(jīng)元tau蛋白過度磷酸化.藥學學報,2008,43(1):29-34.

11 王姝. 9種天然成分抑制小膠質(zhì)細胞異常活化所致大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的興奮性毒性研究.沈陽:沈陽藥科大學碩士學位論文,2008.

12 郁亮. 9種天然成分對小膠質(zhì)細胞異?；罨麓笫笃由窠?jīng)元損傷的抑制作用研究.沈陽:沈陽藥科大學碩士學位論文, 2006.

13 楊晶晶,劉英,王承瀟,等.三七皂苷R1的現(xiàn)代研究進展.中國醫(yī)院藥學雜志,2015,35(5):463-467.

14 穆俊霞,李新毅.中藥遠志對阿爾茨海默病大鼠模型學習記憶和膽堿酯酶活性的影響.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2007,2(1):18-20.

15 曹杜娟,李新毅,郭芬,等.遠志對阿爾茨海默病模型大鼠學習記憶及在體海馬LTP的影響.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2010,5(8):661-664. 16 莫微,林志宏.中藥遠志改善記憶障礙研究進展.世界科學技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2012,14(4):1913-1916.

17 閆明,李萍.遠志抗衰老作用的研究.實用藥物與臨床,2006,9(1):22-23.

18 石成男,李秀國,許青松,等.遠志水提物對阿爾茨海默病模型小鼠學習記憶的影響.中風與神經(jīng)疾病雜志,2011,28(7):620-622.

19 陳勤,李磊珂.遠志皂苷對β淀粉樣蛋白Aβ1-40誘導的體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)細胞損傷的保護作用.中國中藥雜志,2007,32(13):1336-1339.

20 姚允怡,孫黎,薛建紅,等.遠志醇提取物改善阿爾茨海默病小鼠病理學的研究.山東大學學報:醫(yī)學版,2012,50(11):11-17.

21 易東陽,閆磊,張慧,等.遠志的化學成分及治療阿爾茨海默病的藥理作用研究進展.中國藥房,2014(11):1049-1051.

Dynamic Analysis of the Effects of Pharmacodynamic Constituents of Kai Xin San on Alzheimer's Disease Rats Based on Chinmedomics

Chu Hang, Lu Shengwen, Kong Ling, Han Ying, Han Jinwei, Liu Zhidong, Zhang Aihua, Wang Xijun
(Research Center of Chinmedomics-State Administration of TCM-Laboratory of Metabolomics, National TCM Key Laboratory of Serum Pharmacochemistry, Sino-US Chinmedomics Technology Cooperation Center, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

The present study aimed at elucidating the therapeutic effects of Kai Xin San (KXS) on AD rat models induced by D-gal and AlCl3, and investigating its metabolic products of KXS and their functions using metabolomic technique by establishing the network relations between chemicals of KXS and endogenous biomarkers selected by metabolomics with the analyze of the dynamic changes of pharmacodynamic basis of KXS preventing AD. The typical behavior tests were adopted to evaluate the state of AD in model rats and the therapeutic effects of KXS. Metabolomic technologies were used to reveal the potential biomarkers of AD and the target spots after the administration of KXS. Serum pharmacochemistry of TCM was herein introduced to explore the constituents absorbed into the blood after lavage administration of KXS. The constituents, targets of the influenced metabolic pathways, can be determined as the pharmacodynamic basis at different pathogenic stages of AD. The effect of pharmacodynamic basis was verified, while multi-component and multi-target synergistic mechanism behind prevential and therapeutic effects of KXS in AD rats was elucidated in this study. AD rat models induced by AlCl3and D-gal received the intragastric administrated of KXS. As a result, the Morris water maze test showed that AlCl3and D-gal-induced learning disability and memory loss of the AD rats were mitigated within the administration of KXS. The metabonomics studies showed that the abnormal expressions of biomarkers of the rats at different stages of AD were regulated and restored featuring the multi-target and multi-path of the administration of KXS. In conclusion, Chinmedomics is an novel discipline for addressing the problem in the effects of Chinese materia medica and other related scientific issues.

Alzheimer's disease, Kai Xin San, metabonomics, Chinmedomics, biomarker

10.11842/wst.2016.10.006

R285

A

（責任編輯：朱黎婷，責任譯審：朱黎婷）

2016-09-19

修回日期：2016-10-19

＊ 國家自然科學基金委重點項目（81430093）：中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的系統(tǒng)分析方法學--中醫(yī)方證代謝組學研究，負責人：王喜軍；國家自然科學基金委青年科學基金項目（81302905）：基于藥物代謝組學的開心散防治老年癡呆癥的物質(zhì)基礎(chǔ)及機制研究，負責人：張愛華；黑龍江省科技廳自然科學基金面上項目（H2015038）：基于代謝組學策略研究開心散治療AD的藥效物質(zhì)和作用機理，負責人：張愛華。

＊＊ 通訊作者：王喜軍，本刊編委，教授，博士生導師，主要研究方向：中藥血清藥物化學及中醫(yī)方證代謝組學研究。