鄒雪艷，何曉鋒，王　朋，郭靜玉，劉　錦*

( 1．河南大學(xué)納米材料工程研究中心，河南開封475004; 2．河南大學(xué)民生學(xué)院，河南開封475004; 3．河南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，河南開封475004)

?

生物功能化中空納米二氧化硅微球的構(gòu)建及其對(duì)蛋白質(zhì)的分離純化

鄒雪艷1，何曉鋒2，王朋2，郭靜玉3，劉錦3*

( 1．河南大學(xué)納米材料工程研究中心，河南開封475004; 2．河南大學(xué)民生學(xué)院，河南開封475004; 3．河南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，河南開封475004)

摘要:本文作者通過水熱法合成了中空SiO2-SH納米微球，然后直接用其吸附Ni2+，從而形成SiO2-SH-Ni2+復(fù)合材料，以此材料為載體，可以將以組氨酸為標(biāo)簽的( His-tagged)的融合蛋白直接從細(xì)胞裂解液中進(jìn)行分離純化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該微球適合于His-tagged融合蛋白的分離純化．

關(guān)鍵詞:中空;二氧化硅;組氨酸;親和分離

納米SiO2是一種生物相容性材料，通過表面基團(tuán)修飾［1－3］可以賦予納米SiO2新的表面特性，從而提高其在納米藥物輸運(yùn)與控釋，蛋白質(zhì)分離與純化等方面的應(yīng)用［4－8］．蛋白質(zhì)的分離純化［9－10］，特別是低豐度蛋白質(zhì)的純化，在蛋白組學(xué)領(lǐng)域是一個(gè)重要課題．許多純化方法采用的分離步驟是基于特定配體之間的相互作用和親和標(biāo)記蛋白，最常見的親和標(biāo)記蛋白是以六聚組氨酸為標(biāo)簽的His-tagged蛋白［11－13］，His-tagged重組質(zhì)體被植入大腸桿菌體內(nèi)，并用常規(guī)的方法進(jìn)行蛋白的表達(dá)［14］．然而，這些合成方法仍有一定的局限性［15－16］，如預(yù)處理需要?jiǎng)h除細(xì)胞碎片和膠體污染物，致使操作時(shí)間較長．隨著納米材料的發(fā)展，納米微球或顆粒［17］作為一種新興的載體被用于蛋白質(zhì)的分離．例如Au/Fe3O4納米粒子改性后與Ni2+-NTA結(jié)合，并應(yīng)用于Histagged蛋白的分離［18］，當(dāng)前這種方法的主要限制是微粒的表面積有限以及表面金屬粒子密度較低，從而導(dǎo)致純化效率較低．中空納米SiO2微球具有較大的比表面積，并且通過水熱法一步制得SiO2-SH納米微球克服了接枝率低的弊端，因此以SiO2-SH中空納米微球作為載體可以有效的提高表面螯合金屬離子的密度，從而提高分離目標(biāo)蛋白的能力．本文作者采用水熱法制備了中空SiO2-SH納米微球，將其吸附Ni2+形成SiO2-SH-Ni2+微球，用于Histagged蛋白的分離純化．

1　實(shí)驗(yàn)部分

1．1試劑與儀器

正硅酸四乙酯( TEOS，天津市福晨化學(xué)試劑廠) ;巰基丙基三甲氧基硅烷( MPS，95%)購自Alfa-Aesar公司;十六烷基三甲基溴化銨( CTAB，≥98．0%)購自化學(xué)試劑國藥控股有限公司;γ-( 2．3環(huán)氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷( GPTMS)購自阿拉丁化學(xué)有限公司;三乙基胺( TEA)天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司．

樣品的形貌及組成用透射電子顯微鏡( TEM，JEOL JEM-2010型)、熱重分析儀( TG，TGA/SDTA851e型)及傅立葉變換紅外光譜儀( IR，AVATAR360型)進(jìn)行檢測．捕獲的His-tagged蛋白用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測( SDSPAGE，Poer PAC 300，鄭州寶賽科貿(mào)有限公司)，穩(wěn)壓電壓是70 V，分離電壓是120 V．

1．2實(shí)驗(yàn)過程

1．2．1 SiO2-SH微球的制備

在50 mL三頸瓶中分別加入17 mL水、2．8 mL無水乙醇和0．03 g CTAB，攪拌15 min;逐滴加入1．1 mL TEA，室溫下攪拌;升溫至60℃，攪拌下緩慢滴入1．4 mL TEOS和0．14 mL MPS，攪拌反應(yīng)3 h;將溶液轉(zhuǎn)入高溫反應(yīng)釜中，在110℃反應(yīng)48 h，自然冷卻至室溫;離心分離，固體產(chǎn)物用無水乙醇和鹽酸分別洗滌數(shù)次，在60℃烘干24 h，得到SiO2-SH樣品．

1．2．2 SiO2-SH-Ni2+的制備

取3 mg SiO2-SH樣品加入50 mL試管中，然后加入50 mL 2 mol/L NiCl2溶液，超聲分散，于25℃水浴振蕩反應(yīng)24 h，使其充分吸附Ni2+;離心分離，將固體產(chǎn)物用去離子水超聲洗滌數(shù)次，然后分散于25%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇溶液中，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

1．2．3 His-tagged LOV蛋白的分離純化

十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳( SDSPAGE)是蛋白質(zhì)分析中最常用的技術(shù)，可用于定性測定和分析蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量、種類和數(shù)量．十二烷基磺酸鈉可將蛋白質(zhì)大分子變性，并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合形成帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合體．在電場作用下，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合體沿著聚丙烯酰胺凝膠形成的分子篩向電場的正極方向移動(dòng)，從而可根據(jù)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小將其分開［19］，分開后的具有不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)在凝膠上呈現(xiàn)對(duì)應(yīng)的條帶，與Marker呈現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)條帶相對(duì)比就可判斷目標(biāo)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量．

His-tagged LOV蛋白分離純化的步驟如下:首先用將SiO2-SH-Ni2+樣品用破菌buffer( 20 mmol/L Tris-HCl，含0．2 mol/L NaCl)超聲洗滌3次;然后將這些樣品加入到1 500 μL細(xì)胞裂解液中，在搖床上( 90 r/min，4℃)孵化2 h;接著將捕獲了目標(biāo)蛋白的SiO2-SH-Ni2+樣品進(jìn)行離心，并將沉淀用破菌buffer洗滌數(shù)次以去除表面殘留的蛋白;最后將捕獲的His-tagged LOV蛋白用300 μL咪唑( 1 mol/L)進(jìn)行洗脫，離心后上清液即為純化的His-tagged LOV蛋白，對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析．剩余的SiO2-SH-Ni2+樣品用EDTA和NiCl2溶液處理后重復(fù)分離目標(biāo)蛋白3次．

2　SiO2　-SH微球的表征

2．1 TEM圖分析

圖1為制備的SiO2-SH和SiO2-SH-Ni2+樣品的TEM．由圖1a和1b可以看出，制備的SiO2-SH樣品為中空納米微球，粒徑均一，分散性較好．微球的平均粒徑約為45 nm，殼層厚度約為10 nm．從圖1c可以看出，表面吸附Ni2+后，制備的微球形貌保持不變，仍為中空納米微球．

圖1　SiO2-SH( a，b)和SiO2-SH-Ni2+( c)樣品的TEM圖Fig．1 TEM images of the as-prepared SiO2-SH( a，b) and SiO2-SH-Ni2+( c)

2．2 FT-IR圖分析

圖2為制備SiO2-SH樣品的FT-IR圖，從圖中可以看出，1 097、941、797、460 cm－1處的吸收峰分別對(duì)應(yīng)Si－O－Si的反對(duì)稱伸縮吸收、對(duì)稱伸縮吸收及彎曲振動(dòng)吸收; 1 652 cm－1處為H－O－H的彎曲振動(dòng)峰，這是由于納米SiO2表面吸附水所致［20］; 3 426 cm－1的寬峰是結(jié)構(gòu)水－OH反對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰; 2 953 和2 876 cm－1處分別出現(xiàn)了甲基、亞甲基的伸縮振動(dòng)峰; 1 472 cm－1處出現(xiàn)了與硫相連的亞甲基的特征吸收峰［21］，間接說明了二氧化硅表面修飾了－SH基團(tuán)．

圖2　SiO2-SH樣品的FT-IR圖Fig．2 FT-IR spectrum of the prepared SiO2-SH sample

2．3 TG圖分析

圖3為制備SiO2-SH樣品的熱重圖，從圖中可以看出，室溫～800℃有明顯的失重．其中，室溫～250℃，失重率為4．7%，這主要是由于樣品表面吸附水高溫下脫水所致; 300～700℃樣品失重率約為15．0%，主要來自于表面修飾劑的熱分解所致，間接說明制備的SiO2-SH微球表面修飾了－SH基團(tuán)．

圖3　制備SiO2-SH樣品的熱重曲線Fig．3 TG curve of the as-prepared SiO2-SH

2．4 SDS-PAGE電泳分析

圖4為制備SiO2-SH-Ni2+樣品分離His-tagged LOV融合蛋白的SDS-PAGE電泳圖，其中泳道1為Marker，泳道2為混合蛋白，泳道3為樣品分離Histagged LOV蛋白的電泳條帶．從圖4泳道1可以看出混合蛋白中既含有His-tagged LOV蛋白，也有其他雜質(zhì)蛋白．通過樣品純化后，制備的樣品可以特異性的分離純化His-tagged LOV蛋白，因而未出現(xiàn)其他非特性條帶(圖4泳道3)，說明制備的樣品對(duì)目標(biāo)蛋白具有較好的選擇性．

圖4　SiO2-SH-Ni2+樣品分離His-tagged LOV融合蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig．4 SDS-PAGE of separated His-tagged LOV proteins by the as-prepared SiO2-SH-Ni2+

圖5為制備SiO2-SH-Ni2+樣品分離連續(xù)4次分離純化His-tagged LOV融合蛋白的SDS-PAGE電泳圖，其中泳道1為混合蛋白，泳道2為Marker，泳道3為SiO2-SH第1次分離，泳道4為SiO2-SH第2次分離，泳道5為SiO2-SH第3次分離，泳道6為SiO2-SH第4次分離．從圖中可以看出，制備的樣品循環(huán)使用4次均對(duì)His-tagged LOV具有較好的分離效果，說明制備的樣品可應(yīng)用于目標(biāo)蛋白的分離純化，特異性較好．

圖5　SiO2-SH-Ni2+樣品連續(xù)4次分離純化His-tagged LOV融合蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig．5 SDS-PAGE of separated His-tagged LOV proteins by the as-prepared SiO2-SH-Ni2+for four times

3　結(jié)論

本文作者合成了SiO2-SH-Ni2+中空納米微球，并用其分離His-tagged LOV蛋白，實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證制備的SiO2-SH-Ni2+材料對(duì)目標(biāo)蛋白的分離效果好，再生能力強(qiáng)，非常適合于His-tagged融合蛋白的親和分離．

參考文獻(xiàn):

［1］SALMIO H，BRüHWILER D．Distribution of amino groups on a mesoporous silica surface after submonolayer deposition of aminopropylsilanes from an anhydrous liquid phase ［J］．J Phys Chem C，2007，111( 2) : 923－929．

［2］鄒雪艷，趙彥保，李賓杰．不同形貌納米二氧化硅的制備及形成機(jī)理研究［J］．化學(xué)研究，2011，22( 4) : 7－10．

［3］SAYARI A，HAMOUDI S．Periodic mesoporous silicabased organic-inorganic nanocomposite materials ［J ］．Chem Mater，2001，13( 10) : 3151－3168．

［4］JOVANOVIC A V，F(xiàn)LINT J A，VARSHNEY M，et al．Surface modification of silica core-shell nanocapsules: biomedical implications ［J］．Biomacromolecules，2006，7 ( 3) : 945－949．

［5］GERION D，PINAUD F，WILLIAMS S C，et al．Synthesis and properties of biocompatible water-soluble silica-coated CdSe/ZnS semiconductor quantum dots ［J］．J Phys Chem B，2001，105( 37) : 8861－8871．

［6 ］SALIS A，MELONI D，LIGAS S，et al．Physical and chemical adsorption of mucor javanicus lipase on SBA-15 mesoporous silica．Synthesis，structural characterization，and activity performance ［J ］．Langmuir，2005，21 ( 12) : 5511－5516．

［7］KISLER J M，D?HLER A，STEVENS G W，et al．Separation of biological molecules using mesoporous molecular sieves ［J ］．Micropor Mesopor Mat，2001，44/45( 6) : 769－774．

［8］MOELANS D，COOL P，BAEYENS J，et al．Using mesoporous silica materials to immobilise biocatalysis-enzymes ［J］．Catal Commun，2005，6( 4) : 307－311．

［9］QIN W D．Silica nanoparticles as pseudostationary phase for protein separation ［J ］．Electrophoresis，2007，28 ( 17) : 3017－3023．

［10］KATIYAR A，PINTO N G．Visualization of size selective protein separations on spherical mesoporous silicates ［J］．Small，2006，2( 5) : 644－648．

［11 ］BARKLIS E，MCDERMOTT J，WILKENS S，et al．Structural analysis of membrane-bound retrovirus capsid proteins ［J］．Embo J，1997，16( 6) : 1199－1213．

［12］PALACIO H J，MATHIEU C．A facile method for reversibly linking a recombinant protein to DNA ［J ］．Chembiochem，2009，10( 9) : 1551－1557．

［13］鄒雪艷，董爍，李賓杰，等．納米材料在蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用［J］．化學(xué)研究，2014，25( 5) : 544－550．

［14］SAMBROOK J，RUSSELL D W．Molecular cloning: a laboratory manual ［M］．New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001: 1252－1255．

［15］阮建兵，梅艷珍．多聚組氨酸融合標(biāo)簽在蛋白藥物開發(fā)中的應(yīng)用［J］．生物技術(shù)通報(bào)，2012( 6) : 49－53．［16］MERKENS H，SIELKER S，F(xiàn)ETZNER K R．A new monocupin quercetinase of streptomyces sp．FLA: identification and heterologous expression of the qued gene and activity of the recombinant enzyme towards different flavonols ［J］．Arch Microbiol，2007，187( 6) : 475－487．

［17］楊玉東，徐菁華，楊林梅，等．金納米棒表面修飾技術(shù)及其功能化的研究進(jìn)展［J］．化工進(jìn)展，2010，29 ( 3) : 389－396．

［18］謝海燕，甄蕊，王博，等．Ni2+-氮川三乙酸修飾的Fe3O4/Au核/殼納米材料對(duì)組氨酸融合蛋白簡便有效的分離［J］．分析化學(xué)，2009，A02: 13－13．

［19］牛瑞，秦勝利．蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)研究進(jìn)展［J］．化工科技市場，2010，33( 4) : 16－18．

［20］謝根生．等徑納米SiO2粉料的制備及其表征［J］．涂料工業(yè)，2006，36( 3) : 23－25．

［21］安悅，朱再明，胡皆漢，等．α，α'-二氧代烯酮環(huán)二硫代縮酮類化合物的特征紅外光譜(Ⅲ) ［J］．光譜學(xué)與光譜分析，2001，21( 6) : 775－777．

［責(zé)任編輯:毛立群］

Construction of biofunctional hollow silica nanospheres for separating proteins

ZOU Xueyan1，HE Xiaofeng2，WANG Peng2，GUO Jingyu3，LIU Jin3*

( 1．Engineering Research Center for Nanomaterials，Henan University，Kaifeng 475004，Henan，China;

2．Minsheng College，Henan University，Kaifeng 475004，Henan，China;

3．College of Chemistry and Chemical Engineering，Henan University，Kaifeng 475004，Henan，China)

Abstract:Hollow SiO2-SH nanospheres were synthesized through the hytrodthermal method，then these microspheres were used to adsorb directly Ni2+ions to form SiO2-SH-Ni2+composite materials．In the end，the His-tagged fusion proteins can be separated from the mixture proteins by the SiO2-SH-Ni2+composite materials．The experimental results show that it is suitable for these prepared microspheres to separate the His-tagged proteins．

Keywords:hollow; silica; histidine; affinity separation

作者簡介:鄒雪艷( 1981―)，女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事復(fù)合納米材料的制備．*通訊聯(lián)系人，E-mail: zouxy182838@ 163．com．

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( 21271062)和河南省教育廳科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)研究項(xiàng)目( 14B150003)．

收稿日期:2015－05－23．

中圖分類號(hào):TB34

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1008－1011( 2016) 01－0112－04