郭　霞，榮　毅，張　亮，葉金翠

浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所制劑室，杭州 310013

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·論著·

手性促進(jìn)劑芳樟醇對(duì)萘普生經(jīng)皮滲透的促透效果

郭霞，榮毅，張亮，葉金翠

浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所制劑室，杭州 310013

摘要：目的研究dl-芳樟醇、d-芳樟醇、l-芳樟醇對(duì)模型藥物經(jīng)離體大鼠皮膚滲透促透效果的差異及芳樟醇對(duì)角質(zhì)層類脂神經(jīng)酰胺的作用。方法采用Valia-Chien雙室滲透池進(jìn)行離體皮膚滲透實(shí)驗(yàn)，手性固定相HPLC法測(cè)定皮膚滲透液中藥物含量，紅外光譜法考察芳樟醇對(duì)角質(zhì)層類脂特征吸收峰峰位的影響。結(jié)果加入1%dl-芳樟醇、1%d-芳樟醇、1%l-芳樟醇時(shí)的穩(wěn)態(tài)滲透速率分別為(2.47±0.63)、 (1.53±0.54)、 (1.73±0.48)μg·cm-2·h-1，分別是對(duì)照組[(0.99±0.42)μg·cm-2·h-1]的2.49、1.55、1.75倍，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。dl-芳樟醇對(duì)萘普生的促透作用顯著大于d-芳樟醇和l-芳樟醇(P均<0.05)。與未經(jīng)芳樟醇處理的角質(zhì)層相比，經(jīng)dl-芳樟醇處理過的角質(zhì)層在亞甲基不對(duì)稱振動(dòng)吸收峰位上向高波數(shù)移動(dòng)2.09 cm-1，而經(jīng)d-芳樟醇和l-芳樟醇處理的角質(zhì)層在波數(shù)上無變化。結(jié)論不同構(gòu)型的芳樟醇對(duì)同一藥物促透效果的差異與其對(duì)角質(zhì)層脂質(zhì)神經(jīng)酰胺的擾亂程度有關(guān)。

關(guān)鍵詞：芳樟醇；萘普生；手性促進(jìn)劑；經(jīng)皮給藥

ActaAcadMedSin，2016,38(1)：55-61

經(jīng)皮給藥系統(tǒng)(transdermal drug delivery system，TDDS)系指藥物以一定速率透過完整皮膚，到達(dá)皮下組織或經(jīng)毛細(xì)血管吸收進(jìn)入體循環(huán)而發(fā)揮局部或全身療效的緩控釋給藥系統(tǒng)，已成為重要的給藥途徑，但由于角質(zhì)層的屏障作用，只有極少數(shù)活性強(qiáng)、理化性質(zhì)適中的藥物可能開發(fā)成經(jīng)皮給藥制劑?；瘜W(xué)促進(jìn)劑法是目前主要采用的藥物經(jīng)皮促透法，化學(xué)促進(jìn)劑的開發(fā)、應(yīng)用及其機(jī)制研究對(duì)TDDS的發(fā)展具有重要意義。

萜烯類經(jīng)皮滲透促進(jìn)劑主要從天然植物中提取，具有促透效果強(qiáng)、毒性低、對(duì)皮膚刺激性小[1]等優(yōu)點(diǎn)，一般具有手性中心，其主要促透機(jī)制為擾亂脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)脂質(zhì)流動(dòng)，產(chǎn)生新的滲透通道[2- 3]。芳樟醇是一種典型的萜烯類手性促進(jìn)劑，能促進(jìn)拉莫三嗪[4]、疊氮胸苷[5]、纈沙坦[6]等藥物的經(jīng)皮滲透。因芳樟醇結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)手性中心，故分為d-和l-兩個(gè)對(duì)映異構(gòu)體。不同構(gòu)型的芳樟醇物理性質(zhì)基本相同，只是由于結(jié)晶結(jié)構(gòu)的差異，手性化合物單對(duì)映體可能擁有不同于消旋體的熔點(diǎn)。藥物經(jīng)皮滲透的主要屏障是角質(zhì)層，其主要由手性物質(zhì)角蛋白和神經(jīng)酰胺組成(角質(zhì)層細(xì)胞間類脂中神經(jīng)酰胺所占比例>50%)，制劑處方中的手性輔料(如手性促進(jìn)劑)可能與皮膚中的手性物質(zhì)產(chǎn)生對(duì)映體選擇性相互作用[7]，進(jìn)而引起手性促透劑的對(duì)映體選擇性促透作用。因此，皮膚的手性環(huán)境可能會(huì)引起不同構(gòu)型芳樟醇對(duì)相同藥物促透效果的差異。所以，有必要研究手性促透劑的構(gòu)型對(duì)藥物的促透效果差異及其產(chǎn)生機(jī)制，以期為更好地開發(fā)利用手性促透劑提供理論指導(dǎo)。

萘普生(naproxen，NP)屬于2-芳基丙酸類非甾體抗炎藥，主要用于治療風(fēng)濕性和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)等引起的疼痛等癥狀。NP對(duì)關(guān)節(jié)炎及其他各種炎癥所致疼痛的治療是通過抑制炎癥局部前列腺素合成和釋放來緩解炎癥反應(yīng)，因此通過皮膚給藥能提高其在患處局部的療效，并減少全身不良反應(yīng)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，月桂氮卓酮、二乙醇乙基醚和磷脂等能促進(jìn)NP的經(jīng)皮吸收[8- 9]。本研究以NP的消旋體(RS-NP)作為模型藥物，評(píng)估了不同構(gòu)型手性促進(jìn)劑芳樟醇對(duì)其經(jīng)離體大鼠皮膚滲透促透效果的差異，以及對(duì)于同為手性藥物的模型藥物NP是否具有對(duì)映體選擇性促透作用，并通過衰減全反射-傅里葉變換紅外光譜法(attenuated total reflection-Fourier transform infrared spectroscopy，ATR-FTIR)檢測(cè)經(jīng)dl-芳樟醇、d-芳樟醇和l-芳樟醇分別處理的皮膚角質(zhì)層亞甲基伸縮振動(dòng)吸收峰峰位的變化，來探究對(duì)映體選擇促透與角質(zhì)層手性類脂神經(jīng)酰胺的相關(guān)性。ATR-FTIR能測(cè)定角質(zhì)層中分子的振動(dòng)，已有研究對(duì)每個(gè)振動(dòng)峰的來源進(jìn)行了歸屬[10]。因此，可以通過ATR-FTIR的檢測(cè)來觀察角質(zhì)層結(jié)構(gòu)微小的變化，研究芳樟醇的對(duì)映體選擇性促透差異與其對(duì)角質(zhì)層類脂神經(jīng)酰胺作用的相關(guān)性，從而探討手性促透劑的對(duì)映體選擇性促透作用機(jī)制。

材料和方法

材料Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀(美國Agilent公司，含G1311B四元泵，G1316A柱溫箱，G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器，G1314F VWD紫外檢測(cè)器)，Valia-Chien透皮擴(kuò)散儀(S=0.65 cm2，V=4 ml，浙江大學(xué)玻璃儀器廠)，Mettler Toledo XS205DU型電子分析天平(梅特勒托利多，瑞士)，Bruker Vector 22 FT-IR光譜儀(德國Bruker公司)，電動(dòng)剃須刀(科德士寵物用電推剪 CP- 8000，飛科電動(dòng)剃須刀 FS620)；dl-芳樟醇、l-芳樟醇(美國Sigma-Aldrich公司)，S-NP(江蘇八巨藥業(yè)有限公司)，d-芳樟醇(福建三明列香料廠)，PEG- 400(上海浦東高南化工廠)，甲醇(德國Merck公司，色譜純)，氯仿(汕頭市西隴化工廠有限公司)，冰乙酸(成都市科龍化工試劑廠)，0.25%胰蛋白酶(杭州吉諾生物技術(shù)有限公司)；水為純化水，其余所使用分析試劑均為分析純。

標(biāo)準(zhǔn)液的配制精密稱取25 mg RS-NP至25 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，配制成1.0 mg·ml-1的貯備液，儲(chǔ)存于冰箱中(4℃)備用，使用前恢復(fù)至室溫。

供給液的配制由于RS-NP在水中的溶解度較小，因此改用無水乙醇-水(2∶8，v/v)作為供給液溶劑，精密稱取一定量的RS-NP配制成濃度為0.1 mg·ml-1的供給液供皮膚滲透實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)大鼠及其皮膚處理健康雌性SD大鼠(浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重(280±10)g，動(dòng)物合格證編號(hào)為SYXK(浙) 2011- 0166。大鼠頸部脫臼法處死后立即用電動(dòng)剃刀剃去背部皮膚毛發(fā)，背部皮膚去除皮下脂肪組織后用生理鹽水洗凈，濾紙吸干，剪成2.0 cm × 2.0 cm大小，用鋁箔包封，于-20℃冰箱凍存?zhèn)溆?，操作過程避免損傷角質(zhì)層。

供FTIR檢測(cè)角質(zhì)層的制備將離體大鼠背部皮膚放入0.25%胰蛋白酶溶液中，37℃消化24 h[11]，用棉簽分離出角質(zhì)層，超純水洗凈濾紙吸干后，分別浸泡于含1%手性促透劑(dl-、d-、l-芳樟醇)的無水乙醇-水(2∶8，v/v)皮膚滲透供給液中和不含芳樟醇的無水乙醇-水(2∶8，v/v)供給液中，以勻速500 r·min-1(r=4 mm)，在32℃水浴中攪拌6 h后，用超純水洗凈，濾紙吸干，置于真空干燥器中供檢測(cè)。

離體皮膚滲透實(shí)驗(yàn)將離體大鼠皮膚從-20℃冰箱冷凍處取出，恢復(fù)室溫后，在生理鹽水中浸泡30 min，濾紙吸干，置Valia-Chien雙室滲透池兩個(gè)池口之間，角質(zhì)層面向供給室，兩個(gè)池口對(duì)準(zhǔn)并用夾子固定，每個(gè)池內(nèi)加入攪拌子，在供給室中分別加入4 ml RS-NP供給液(n=5)，接收室加入4 ml接收液(含40% PEG- 400的生理鹽水)，循環(huán)水浴恒溫(32℃)，磁力攪拌轉(zhuǎn)速為500 r·min-1(r=4 mm)。在規(guī)定時(shí)間(4、6、8、10、12 h)從接收池取樣0.5 ml，及時(shí)加入等量同溫度的空白接收液。樣品置于4℃冰箱冷藏保存，采用HPLC測(cè)定接收液藥物含量。

不同構(gòu)型芳樟醇對(duì)NP離體皮膚促透實(shí)驗(yàn)向以無水乙醇-水(2∶8，v/v)為溶劑的RS-NP溶液中(藥物濃度為0.1 mg·ml-1)分別加入1%dl-芳樟醇、d-芳樟醇或l-芳樟醇作為供給液，其余步驟同離體皮膚滲透實(shí)驗(yàn)操作。

ATR-FTIR測(cè)定IR光譜檢測(cè)采用配備有ATR附件的Bruker Vector 22 FT-IR光譜儀，在4000 cm-1~600 cm-1的波數(shù)下采集，分辨率為4 cm-1。將完整角質(zhì)層、經(jīng)不同構(gòu)型芳樟醇處理的角質(zhì)層樣品分別進(jìn)行ATR-FTIR檢測(cè)，每個(gè)樣品平行做3份。

皮膚滲透液中的藥物濃度檢測(cè)模型藥物為手性藥物NP的消旋體，以手性固定相高效液相色譜法檢測(cè)皮膚滲透液中的藥物對(duì)映體，考察芳樟醇是否引起手性藥物的對(duì)映體選擇性經(jīng)皮滲透。色譜柱：Chiralpak AD-RH(150 × 4.6 mm，5 μm)；保護(hù)柱：Chiralpak AD-RH(10 × 4.0 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.05%三氟乙酸水溶液-乙腈(60∶40，v/v)；流速：0.6 ml·min-1；進(jìn)樣量：20 μl；柱溫：30℃；檢測(cè)波長：232 nm。

結(jié)果

分析方法學(xué)驗(yàn)證

專屬性：將大鼠皮膚置于空白接收液即40% PEG-生理鹽水中浸泡24 h，接收液采用0.22 μm濾膜過濾，按照皮膚滲透液中的藥物濃度檢測(cè)項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果表明，經(jīng)皮滲透空白接收液對(duì)NP對(duì)映體的檢測(cè)無干擾(圖1)。

線性關(guān)系：以皮膚滲透空白接收液作為溶劑，將1 mg·ml-1RS-NP的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成200、100、50、25、10、5、3和1 μg·ml-1的系列溶液，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。以對(duì)映體峰面積(A)對(duì)其濃度(C)進(jìn)行線性回歸，回歸方程分別為R-NP：A=530.3C+430.6(r=0.9996)，S-NP：A=540.9C+354.0(r=0.9997)(圖2)。

檢測(cè)限與定量限：采用信噪比法，檢測(cè)限(limit of detection，LOD)和定量限(limit of quantification，LOQ)分別根據(jù)基線噪音的3倍和10倍進(jìn)行測(cè)定。LOD為0.005 μg·ml-1(S/N=3)，LOQ為0.02 μg·ml-1(S/N=10)，LOQ檢測(cè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.67%(n=5)。

精密度：通過配制高、中、低3個(gè)不同濃度的RS-NP溶液進(jìn)行研究，每個(gè)濃度平行配制3份，按皮膚滲透液中的藥物濃度檢測(cè)項(xiàng)下的色譜條件，每份測(cè)定3次。1、50、200 μg·ml-1濃度下R-NP峰面積的RSD分別為1.79%、0.54%、0.19%，S-NP峰面積的RSD分別為1.43%、0.57%、0.35%。

回收率：通過在空白接收液中加入已知量的RS-NP，配制成3種不同濃度的溶液，每個(gè)濃度平行配制3份，按皮膚滲透液中的藥物濃度檢測(cè)項(xiàng)下的色譜條件每份測(cè)定3次，計(jì)算藥物質(zhì)量，以測(cè)得質(zhì)量除以加入的已知質(zhì)量，再乘以100%得加樣回收率，結(jié)果顯示3個(gè)濃度的NP對(duì)映體回收率在98.7%～100.9%間(表1)。

NP：萘普生

NP：naproxen

A. 大鼠皮膚浸泡空白接收液；B. RS-NP對(duì)照品溶液；C. RS-NP經(jīng)皮滲透樣品溶液

A.blank receptor solution soaking mouse skin；B. reference substance solution of RS-NP；C. sample solution of RS-NP in transdermal permeation studies

圖1NP對(duì)映體分離的HPLC色譜圖

Fig1HPLC of NP enantiomers

A.R-NP；B.S-NP

圖2NP線性關(guān)系圖

Fig2The linear relationship of NP

m：質(zhì)量；RSD：相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

m：mass；RSD：relative standard deviation

不同構(gòu)型的芳樟醇對(duì)NP促透效果的差異當(dāng)供給溶劑中加入1%dl-芳樟醇、1%d-芳樟醇、1%l-芳樟醇時(shí)NP的滲透速率分別為(2.47±0.63)、(1.53±0.54)、(1.73±0.48)μg·cm-2·h-1，分別是對(duì)照組[(0.99±0.42)μg·cm-2·h-1]的2.49、1.55、1.75倍，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。dl-芳樟醇對(duì)RS-NP的促透作用顯著大于d-芳樟醇和l-芳樟醇(P均<0.05)(圖3)，d-芳樟醇和l-芳樟醇間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)皮膚滲透液即接收液中的藥物RS-NP進(jìn)行手性拆分，結(jié)果表明R-NP與S-NP的滲透速率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

ATR-FTIR檢測(cè)結(jié)果在 32℃條件下，對(duì)照組，經(jīng)1%dl-芳樟醇、1%d-芳樟醇、1%l-芳樟醇處理后的角質(zhì)層皮膚的亞甲基對(duì)稱和不對(duì)稱振動(dòng)吸收峰位移分別為(2850.2721±0.0000)和(2918.4147±0.0000)cm-1、(2850.2721±0.0000)和(2920.5074± 0.0000)cm-1、(2850.2721±0.0000)和(2918.4147±0.0000)cm-1、(2850.2721±0.0000)和(2918.4147±0.0000)cm-1。與未經(jīng)芳樟醇處理的角質(zhì)層相比，經(jīng)dl-芳樟醇處理過的角質(zhì)層在亞甲基不對(duì)稱振動(dòng)吸收峰位上向高波數(shù)移動(dòng)2.09 cm-1，而經(jīng)d-芳樟醇和l-芳樟醇處理的角質(zhì)層在波數(shù)上無變化(圖5)。

討論

皮膚的角質(zhì)層主要由手性物質(zhì)角蛋白和神經(jīng)酰胺組成，潛在為藥物皮膚滲透提供了一個(gè)手性環(huán)境[11]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，皮膚角質(zhì)層的紅外光譜圖中亞甲基伸縮振動(dòng)吸收峰峰位的變化與細(xì)胞間脂質(zhì)的無序排列程度有關(guān)，在促進(jìn)劑作用下，細(xì)胞間脂質(zhì)排列被打亂，亞甲基伸縮振動(dòng)吸收峰向高波數(shù)移動(dòng)，藥物透過量提高[12- 13]，并且峰位移動(dòng)越大，促進(jìn)劑擾亂角質(zhì)層脂質(zhì)有序排列的作用越強(qiáng)。因此，本研究評(píng)估了不同構(gòu)型的芳樟醇對(duì)角質(zhì)層脂質(zhì)特征吸收峰位移變化的影響，以期為不同構(gòu)型芳樟醇對(duì)相同藥物的促透效果差異提供理論支持。ATR-FTIR檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)dl-芳樟醇處理過的角質(zhì)層在亞甲基不對(duì)稱振動(dòng)吸收峰位上與對(duì)照組相比向高波數(shù)移動(dòng)2.09 cm-1，而經(jīng)d-芳樟醇和l-芳樟醇處理的角質(zhì)層則無變化，與本課題組以往研究結(jié)果相一致[3]，即不同構(gòu)型芳樟醇對(duì)角質(zhì)層脂質(zhì)的擾亂程度不同，體現(xiàn)為對(duì)相同藥物的促透作用差異，與本研究離體皮膚滲透結(jié)果一致，即dl-芳樟醇對(duì)RS-NP的促透作用顯著大于d-芳樟醇和l-芳樟醇。此外，本研究對(duì)皮膚滲透液即接收液中的藥物RS-NP進(jìn)行手性拆分，結(jié)果顯示，R-NP與S-NP的滲透速率沒有顯著性差異，表明芳樟醇對(duì)同為手性的模型藥物RS-NP沒有對(duì)映體選擇性促透作用。

圖3RS-NP離體皮膚滲透實(shí)驗(yàn)累積滲透量-時(shí)間曲線

Fig3Permeation profiles of RS-NP across excised rat skin from donor vehicles

圖4RS-NP中R-NP和S-NP在含1%dl-芳樟醇(A)、1%d-芳樟醇(B)和1%l-芳樟醇(C)供給液中經(jīng)離體大鼠皮膚累積滲透量-時(shí)間曲線

Fig4Permeation profiles of R-NP and S-NP across excised rat skin from donor solutions containing RS-NP with 1%dl-linalool(A)，1%d-linalool(B)，or 1%l-linalool(C)

A.對(duì)照組；B.經(jīng)dl-芳樟醇處理的角質(zhì)層；C.經(jīng)d-芳樟醇處理的角質(zhì)層；D.經(jīng)l-芳樟醇處理的角質(zhì)層

A.control group；B.stratum corneum treated withdl-linalool；C.stratum corneum treated withd-linalool；D.stratum corneum treated withl-linalool

圖5角質(zhì)層經(jīng)不同構(gòu)型芳樟醇處理后紅外光譜圖

Fig5The infrared spectrum of the rat stratum corneum

藥物經(jīng)皮滲透的主要屏障角質(zhì)層主要由手性物質(zhì)神經(jīng)酰胺和角蛋白組成，而角質(zhì)層細(xì)胞間類脂中神經(jīng)酰胺所占比例大于50%[14]，對(duì)維持角質(zhì)層屏障結(jié)構(gòu)起著重要作用。芳樟醇的促透機(jī)制是提取和打亂角質(zhì)層類脂[15]，本課題組以往研究也證實(shí)了這一點(diǎn)[3]。在神經(jīng)酰胺極性頭部分有多個(gè)手性中心，是潛在的對(duì)映體選擇性作用位點(diǎn)，可與外來手性物質(zhì)產(chǎn)生對(duì)映體選擇性相互作用。例如，Heard等[16]已證實(shí)了神經(jīng)酰胺與麻黃素存在對(duì)映體選擇性結(jié)合，本課題組也報(bào)道了dl-芳樟醇對(duì)消旋十八甲基炔諾的對(duì)映體選擇性促透作用，以及這種作用與角質(zhì)層類脂(神經(jīng)酰胺)的相關(guān)性。本研究并未觀察到芳樟醇對(duì)模型藥物RS-NP的對(duì)映體選擇性促透作用，而dl-芳樟醇對(duì)角質(zhì)層脂質(zhì)的擾亂程度不同于d-芳樟醇和l-芳樟醇，對(duì)RS-NP的促透作用更顯著，這種作用產(chǎn)生的機(jī)制并不清楚。后續(xù)需要開展更深入的研究探討手性藥物與手性促進(jìn)劑、皮膚手性物質(zhì)間的對(duì)映體選擇性相互作用及其影響因素。

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Enhancing Effect of Chiral Enhancer Linalool on Skin Permeation of Naproxen

GUO Xia，RONG Yi，ZHANG Liang，YE Jin-cui

Department of Pharmaceutics，Institute of Materia Medica，Zhejiang Academy of Medical Sciences，Hangzhou 310013，China Corresponding author：YE Jin-cuiTel：0571- 88215573，E-mail：yejincui@163.com

ABSTRACT：ObjectiveTo investigate the permeation-enhancing effect of dl-linalool，d-linalool，and l-linalool on model drugs across excised rat skin and the effect of linalool on the ceramides in stratum corneum lipids. MethodsIn vitro skin permeation studies were performed with Valia-Chien diffusion cells，and the permeation samples were analyzed by high performance liquid chromatography with chiral stationary phase. Infrared spectroscopy was used to investigate the effect of linalool on stratum corneum lipids. ResultsWhen the donor vehicles added with 1% dl-linalool，1% d-linalool，or 1% l-linalool，the steady-state skin permeation rate of naproxen was(2.47±0.63)，(1.53±0.54)，(1.73±0.48) μg·cm-2·h-1，respectively，which is 2.49，1.55，and 1.75 times(all P<0.05) compared with control group [(0.99±0.42)μg·cm-2·h-1]，and the differences were statistically significant(all P<0.05). The permeation-enhancing effect of dl-linalool on naproxen was found significantly greater than that of d-linalool and l-linalool(both P<0.05). Compared with the control group，the stratum corneum treated with dl-linalool shifted to higher wave number on 2.09 cm-1of asymmetric CH2stretching vibrations in attenuated total reflection-fourier transform infrared spectroscopy analysis. However，stratum corneum treated with d-linalool and l-linalool did not display this phenomenon. ConclusionThe disturbing degree of dl-linalool on stratum corneum lipids(ceramides) is different from that of linalool enantiomers，suggesting their different enhancing effect on the same drug.

Key words：linalool；naproxen；chiral enhancer；transdermal drug delivery

(收稿日期：2015- 03- 23)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.01.010

中圖分類號(hào):R94

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào)：1000- 503X(2016)01- 0055- 07

通信作者：葉金翠電話：0571- 88215573，電子郵件：yejincui@163.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(30901871)、浙江省科技廳項(xiàng)目(2014F10034)、省部共建項(xiàng)目(201231507)和浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項(xiàng)目Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(30901871)，Zhejiang Provincial Science and Technology Fund of China(2014F10034)，Zhejiang Provincial Joint Construction Project(201231507)，and Zhejiang Provincial Program for the Cultivation of High-level Innovative Health Talents