劉志鑫，張洪雨，劉建宇

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 骨外一科,黑龍江 哈爾濱　150081)

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肌源干細(xì)胞治療周圍神經(jīng)損傷的研究進(jìn)展

劉志鑫，張洪雨，劉建宇

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 骨外一科,黑龍江 哈爾濱150081)

[摘要]周圍神經(jīng)損傷是常見的外科疾病之一，為了尋求促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的途徑，臨床醫(yī)生和科學(xué)工作者長期致力于提高外科技術(shù)和改進(jìn)手術(shù)方法，但術(shù)后功能恢復(fù)仍不如意。近年來飛速發(fā)展的組織工程學(xué)為此提供了一種新的解決途徑，其中雪旺細(xì)胞目前被認(rèn)為是周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中重要的種子細(xì)胞，但其很多方面的應(yīng)用都受到限制。所以，需尋找雪旺細(xì)胞的替代細(xì)胞。近年來被發(fā)現(xiàn)并逐漸成為研究熱點(diǎn)的新型種子細(xì)胞之一便是肌源干細(xì)胞(muscle- derived stem cell，MDSC)。在本文中作者通過大量閱讀相關(guān)文獻(xiàn)，并結(jié)合自己的相關(guān)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，對肌源干細(xì)胞誘導(dǎo)分化治療周圍神經(jīng)損傷的理論依據(jù)、實(shí)驗(yàn)方法、新突破及面臨的問題進(jìn)行綜述。

[關(guān)鍵詞]肌源干細(xì)胞； 神經(jīng)營養(yǎng)因子； 雪旺細(xì)胞； 周圍神經(jīng)損傷

周圍神經(jīng)損傷是因某些因素造成神經(jīng)軸索中斷或神經(jīng)斷裂、神經(jīng)傳導(dǎo)功能障礙，致使軀干及四肢感覺、運(yùn)動、交感功能障礙的一類臨床病癥。其病理變化為被損傷神經(jīng)遠(yuǎn)端發(fā)生Wallerian變性[1]，近端一個或多個郎飛節(jié)也發(fā)生相似的病理變化，然后雪旺細(xì)胞(Schwann cells，SCs)增殖，其在神經(jīng)膜管內(nèi)排列有序并形成一條實(shí)心的細(xì)胞索Bungner帶[2]，同時Bungner帶內(nèi)有再生的軸突長入，緊接著大多數(shù)SCs凋亡，小部分存活的SCs開始與軸突1∶1匹配并包繞軸突形成髓鞘，再生的軸突逐漸延伸至效應(yīng)器，從而重新建立新的突觸聯(lián)系[3]。

1對SCs作用的認(rèn)識及研究

SCs在周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù)中具有重要作用，為周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)特有的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。成年哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷后，極少自發(fā)地發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的再生，主要由于自身的微環(huán)境不利于再生，如少突細(xì)胞髓鞘套管的存在和膠質(zhì)瘢痕形成等[4]。而PNS被損傷后可再生，其神經(jīng)功能也可部分甚至全部恢復(fù)，這主要依賴于一個適宜神經(jīng)再生的微環(huán)境，而這個微環(huán)境正是由SCs 提供的。據(jù)文獻(xiàn)報道，當(dāng)CNS損傷后，將SCs 移植到其損傷部位可以使CNS再生[5]。因此改造CNS的微環(huán)境，使之接近于PNS，目前已成為促進(jìn)CNS再生的重要策略之一。SCs促進(jìn)神經(jīng)再生的機(jī)制主要有以下幾方面：(1) 激活免疫反應(yīng)，具有免疫吞噬作用；(2) 增殖遷移，引導(dǎo)軸突再生；(3) 分泌作用：分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)分子及細(xì)胞黏附分子等；(4) 趨化作用；(5) 神經(jīng)纖維與 SCs之間形成緊密連接；(6) 形成神經(jīng)髓鞘等。故將SCs移植到周圍神經(jīng)內(nèi)，其可存活，并通過增殖、遷移、分化及分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子等促進(jìn)軸突和髓鞘再生及形成，進(jìn)而促進(jìn)修復(fù)損傷的周圍神經(jīng)[6- 9]。

2對肌源干細(xì)胞(MDSC)的認(rèn)識及研究

MDSC是近年來的研究熱點(diǎn)，以往很多文獻(xiàn)均是報道有關(guān)于肌衛(wèi)星細(xì)胞和成肌細(xì)胞的。Asakura等[10]研究發(fā)現(xiàn)肌衛(wèi)星細(xì)胞具有自我更新和成肌、成脂肪、成骨等多向分化的能力，故有“肌肉干細(xì)胞”之稱，但其是一種向成肌系細(xì)胞定向分化的前體細(xì)胞。有文獻(xiàn)[11]報道MDSC是與肌衛(wèi)星細(xì)胞完全不同的一群細(xì)胞群,可能是一群原始的干細(xì)胞，且未向任何方向分化。研究證實(shí)，MDSCs可大量擴(kuò)增復(fù)制，其在體外傳30代后仍可保持其原有的表型特征；在體外進(jìn)行300次擴(kuò)增后仍未出現(xiàn)自我復(fù)制衰老的征象，依然可以維持較高水平的Sca- 1和CD34表達(dá)，但MDSCs的擴(kuò)增潛能并非是無限的[12]。另外，MDSCs在一般情況下，無誘導(dǎo)因素的作用時，其可定向分化為肌細(xì)胞；在特殊的誘導(dǎo)因素刺激下，MDSCs可以分化為心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等[13]。Bedair等[14]以小鼠為實(shí)驗(yàn)對象，通過小鼠骨骼肌損傷模型研究證實(shí)，MDSCs同時促進(jìn)受損肌肉及其周圍血管、神經(jīng)的再生，他們也進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在再生肌組織和體內(nèi)CD133+/CD34+MDSCs的遷移能力要比SCs更為突出。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)MDSC缺乏Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體(MHC- Ⅰ)，由于MHC- Ⅰ是導(dǎo)致移植組織的排斥反應(yīng)的重要因素之一，故MDSC具有免疫赦免特性、抗原性極低等特點(diǎn)。正是由于MDSC的這一特性使其異體甚至異種移植成為可能。而作為理想的組織工程種子細(xì)胞需要具備的條件有：(1) 可以通過培養(yǎng)擴(kuò)增等方式大量復(fù)制增殖；(2) 具有多向分化的能力，可分化為所需細(xì)胞；(3) 具有免疫赦免特性，抗原性低等。由此可見，MDSC完全具備作為理想種子細(xì)胞的條件[15- 16]。因此，目前MDSC已被廣泛研究應(yīng)用于治療壓力性尿失禁、心臟疾病、肌肉障礙疾病、神經(jīng)損傷等疾病[17- 20]。

3MDSC治療周圍神經(jīng)損傷的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)方法

3.1MDSC的分離純化、培養(yǎng)及鑒定

取新生小鼠獲取其純凈的骨骼肌組織，剪碎，應(yīng)用酶消化法對肌組織進(jìn)行消化并離心、過濾提取細(xì)胞液，然后經(jīng)改良pre- plating差速貼壁法等方法分離、純化，最后獲得小鼠的原代MDSC，并用臺盼藍(lán)染色等方法檢測所提取純化的MDSC的活性，應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變和生長狀態(tài)，定時更換新鮮培養(yǎng)液[21- 22]；MDSC的鑒定常采用檢測其表面標(biāo)志物的方法。而MDSC幾乎沒有特異性表面標(biāo)志物，國內(nèi)外大部分實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合檢測Desmin(肌源性標(biāo)志物)及 Sca- 1(干細(xì)胞標(biāo)志物)對其進(jìn)行鑒定。Sca- 1是迄今為止研究者們公認(rèn)的MDSC的表面標(biāo)志物[23]。Qu- Petersen等[11]研究發(fā)現(xiàn)90%的MDSCs表達(dá)Sca- 1。另據(jù)報道，在MDSCs中Desmin陽性率達(dá)90%；而在平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞中Desmin的陽性率僅15%[24]。有文獻(xiàn)[24]稱，MDSC表面還表達(dá)CD13、CD10、CD56等，但其不表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)志物CD45。

3.2MDSC向SCs誘導(dǎo)及鑒定

取原代提取的MDSC進(jìn)行鋪板，待其貼壁后更換混有誘導(dǎo)液的培養(yǎng)液，并定期換液，嚴(yán)密觀察。細(xì)胞有形態(tài)學(xué)上的變化時，則立即通過多種實(shí)驗(yàn)鑒定技術(shù)，如免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)等對其進(jìn)行鑒定。目前絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室通過檢測SCs特異性標(biāo)志物S- 100、GFAP和p75以確定SCs的表型[25- 27]。其中，S100蛋白僅在神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞高度特異性地表達(dá)，主要包括星形膠質(zhì)細(xì)胞(CNS內(nèi))和SCs(PNS內(nèi))[28]。GFAP是一種分子量為50~52KDa的酸性膠質(zhì)蛋白，是膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物之一，當(dāng)膠質(zhì)細(xì)胞受到各種代謝、物理刺激時其表達(dá)增強(qiáng)[29]。p75是神經(jīng)營養(yǎng)因子的低親和力受體，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)及腫瘤細(xì)胞中[30]。

3.3制造鼠周圍神經(jīng)損傷模型并移植類SCs

選取數(shù)只成年健康裸鼠麻醉后暴露一側(cè)坐骨神經(jīng)，做軸突切斷術(shù)，切除一定距離的軸突造成神經(jīng)缺損，并向缺損處注入類SCs，再應(yīng)用顯微外科縫合線縫合神經(jīng)外膜。動物清醒后放回動物室單獨(dú)飼養(yǎng)。

3.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測

通過多種直接或間接的實(shí)驗(yàn)檢測技術(shù)對術(shù)后鼠周圍神經(jīng)損傷恢復(fù)情況進(jìn)行檢測，并應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。目前主要的檢測技術(shù)有：(1) 步態(tài)分析：從行為學(xué)角度觀察大鼠觸地/抬起、步長、步頻、速度等，鑒定神經(jīng)對靶器官的控制能力。(2) 電生理：通過肌電圖、神經(jīng)電圖、誘發(fā)電位觀察周圍神經(jīng)電恢復(fù)情況。(3) 熒光顯微鏡下觀察：Dil標(biāo)記的MDSCs分布、生長情況。(4) 免疫組織化學(xué)：檢測神經(jīng)特異性蛋白，如S100、膠原纖維酸性蛋白(GFAP)、M2/M6的表達(dá)。(5) 大體及組織學(xué)檢測：通過HE染色觀察再生神經(jīng)組織細(xì)胞形態(tài)。(6) 熒光鏡逆行示蹤：觀察新生神經(jīng)軸漿流運(yùn)輸能力等[31]。

4MDSC治療周圍神經(jīng)損傷的新研究突破

目前國外內(nèi)對MDSC誘導(dǎo)分化治療周圍神經(jīng)損傷尚處于動物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)研究階段。最近，國內(nèi)研究者唐乙等[32]用ELISA等化學(xué)方法對小鼠SCs條件培養(yǎng)液進(jìn)行成分檢測分析，發(fā)現(xiàn)小鼠SCs條件培養(yǎng)液中除成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)基本檢測不到外，神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)素- 3(NT- 3)、血小板源性生長因(PDGF)、胰島素樣生長因子- 2(IGF- 2)均有不同量的表達(dá)。于是他們用以上5種因子單一、兩兩組合、三三組合分別對小鼠的MDSC進(jìn)行誘導(dǎo)。結(jié)果NT- 3、PDGF、IGF- 2組成功誘導(dǎo)其分化為類SCs，并表達(dá)了SCs的特征性標(biāo)志物Sl00、GFAP和p75。在國外，研究者將由人類的骨骼肌提取的MDSC移植到成年裸鼠的坐骨神經(jīng)缺損處，數(shù)周后裸鼠原本喪失運(yùn)動功能的后肢明顯得到恢復(fù)，他們手術(shù)暴露原來植入人MDSC的坐骨神經(jīng)缺損處，發(fā)現(xiàn)原來缺損處有了明顯的組織學(xué)恢復(fù)，而且缺損處再生的神經(jīng)經(jīng)鑒定有明顯的朗飛結(jié)等結(jié)構(gòu)再生，而且其包含的神經(jīng)纖維數(shù)量與正常的神經(jīng)基本一致，并且該裸鼠患肢受坐骨神經(jīng)支配的腓腸肌也沒有出現(xiàn)萎縮[31]。

5結(jié)語

盡管目前已有方法成功將MDSC定向誘導(dǎo)分化為類SCs，并且運(yùn)用人MDSC修復(fù)裸鼠的坐骨神經(jīng)缺損也大獲成功。但如何科學(xué)地將類SCs移入具有正常免疫功能的動物活體內(nèi)促進(jìn)神經(jīng)缺損修復(fù)，以及如何將來自動物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果應(yīng)用到臨床等等還有一系列難題均是國內(nèi)外研究者還未曾涉獵的，可謂目前的MDSC治療周圍神經(jīng)損傷的實(shí)驗(yàn)研究突破僅僅為萬里長征剛走完一步，此后還有大量的難題等待著我們科研工作者去竭力探索。但MDSC仍是目前治療周圍神經(jīng)損傷最有前景的組織工程學(xué)材料。相信隨著干細(xì)胞生物工程的飛速發(fā)展，MDSC應(yīng)用于臨床治療周圍神經(jīng)損傷的日子必然為期不遠(yuǎn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] GAO J，COGGESHALL R E，TARASENKO Y I，et al.Human neural stem cell derived cholinergic neurons innervate muscle in motoneuron deficient adult rats [J].J Neurosci，2005，131:257- 262．

[2] KRICK K,TAMMIA M,MARTIN R，et al.Signaling cue presentation and cell delivery to promote nerve regeneration [J].Curr Opin Biontechnol,2011，22(5):741- 746．

[3] VRBOVA G,MEHRA N,SHANMUGANATHAN H,et al.Chemical communication between regenerating motor axons and Schwann cells in the growth pathway [J].Eur J Neurosci,2009，30(3):366- 375．

[4] BLAKEMORE W F.The case for a central nerfvous system(CNS)origin for the Schwann cells that remyelinate CNS axons following concurrent loss of oligodendrocytes and astrocytes [J].Neuropathol Appl Neurobiol，2005，31(1):1- 10．

[5] DEZAWA M.Central and peripheral nerve regeneration by transplantation of Schwann cells and transdifferentiated bone marrow Stromal cells [J].Anat Sci Int，2002，77(1):12- 25．

[6] WAKAO S，HAYASHI T.Long- term observation of auto- cell transplantation in non- human primate reveals safety and efficiency of bone marrow stromal cell- derived Schwann cells in peripheral nerve regeneration[J].Exp Neurol，2010，223(2)：537- 547．

[7] DEZAWA M，ADACHI- USAMI E.Role of schwann cells in retinal ganglion cell axon regeneration[J].Prog Retin Eye Res，2000，19(2):171- 204．

[8] HALL S.Nerve repair:a neurobiologist’s view[J].J Hand Surg Br，2001，26(2):129- 136．

[9] NEGISHI H，DEZAWA M，OSHITAD T，et al.Optic nerve regeneration within artificial Schwann cell graft in the adult rat[J].Brain Res Bull，2001，55(3):409- 419．

[10] ASAKURA A，KOMAKI M，RUDNICKI M.Muscle satellite cells are multipotential stem cells that exhibit myogenic，osteogenic，and adipogenic differentiation[J].Differentiation，2001，68:245- 253．

[11] QU- PETERSON Z，DEASY B，JANKOWSKI R，et al.Identification of a novel population of muscle stem cells in mice:potential for muscle regeneration[J].J Cell Biol，2002，157(5):851- 864．

[12] LEE J Y，QU- PETERSON Z，CAO B，et al.Clonal isolation of muscle- derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing[J].J Cell Biol，2000，150(5)：1085- 1100．

[14] BEDAIR H S，KARTHIKEYAN T，QUINTERO A，et al.Angiotensin II receptor blockade administered after injury improves muscle regeneration and decreases fibrosis in normal skeletal muscle[J].Am J Sports Med，2008，36(8)：1548- 1554．

[15] SHIMIZU S，KITADA M，ISHIKAWA H，et al.Peripheral nerve regeneration by the in vitro differentiated.human bone marrow stromal cells with Schwann cell property[J].Biochem Biophys Res Commun，2007，359(4):915- 920．

[16] HOU S Y，ZHANG H Y，QUAN D P，et al.Tissue- engineered peripheral nerve grafting by differentiated bone marrow stromal cells[J].Neuroscience，2006，140(1)：101- 1l0．

[17] CARR L K，STEELE D，STEELE S，et al.1- year follow- up of autologous muscle·derived stem cell injection pilot study to treat stress urinary incontinence[J].Int Urogynecol J，2008，19(6)：88l- 883．

[18] PAYNE T R，OSHIMA H，SAKAI T，et al.Regeneration of dystrophin expressing myocytes in the mdx heart by skeletal muscle stem cells[J].Gene Ther，2005，12(16)：1264- 1274．

[19] CHIRIELEISON S M，F(xiàn)EDUSKA J M，SCHUGAR R C，et al.Human muscle- derived cell populations isolated by differential adhesion rates:phenotype and contribution to skeletal muscle regeneration in Mdx/SCID mice[J].Tissue Eng Part A，2012，18(3/4):232- 241．

[20] 張洪雨，馬志強(qiáng)，劉建宇.干細(xì)胞治療股骨頭壞死的相關(guān)研究[J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2015，34(2):291- 294．

[21] LI J，WANG S，HAN J，et al.Cells captured from spatium intermusculare by porous material exhibit the charactedstics of stem ceils[J].Histochem Cell Biol，2008，130(4)：741- 748．

[22] CHE X，GUO J，WANG B，et al.Rapid isolation of muscle- derived stem cells by discontinuous Percoll density gradient centrifugation[J].In Vitro Ceil Dev Biol Anita，2011，47(7)：454- 458．

[23] CAO B，ZHENG B，JANKOWSKI R J，et al.Muscle stem cells differentiation into haematopoietic lineages but retain myogenic oerential[J].Nat Cel Bi，2003，5(7)：640- 646．

[24] WEI Y，LI Y，CHEN C，et al.Human skeletal muscle- derived stem cells retain stem cell properties after expansion in myosphere culture[J].Exp Cell Res，2011，317(7)：1016- 1027．

[25] BUNNELL B A，F(xiàn)LAAT M，GAGLIARDI C，et al.Adipose- derived stem cells:Isolation，expansion and differentiation[J].Methods，2008，45(2)：115- 120．

[26] KINGHAM P J，KALBERMATTEN D F，MAHAY D，et al.Adipose- derived stem cells differentiate into a Schwann cell phenotype and promote neurite outgrowthinvitro[J].Exp Neurol，2007，207(2)：267- 274．

[27] CADDICK J,KINGHALLL P J，GARDINER N J,et al.Phenotypic and functional characteristics of mesenchymal stem cells differentiated along a Schwann cell lineage[J].Giia，2006，54(8)：840- 849．

[28] KRAMPERA M，MARCONI S，PASINI A，et al.Induction ofneural—like differentiation in human mesenchymai stem cells derived from bone marrow，fat，spleen and thymus[J].Bone JT- Bone，2007，40(2)：382- 390．

[29] GONEALVES C A，LEITE M C，NARDIN P.Biological and methodological features of the measurement of S100B，a putative marker ofbrain injury[J].Clin Biochem，2008，41(10- 11)：755- 763．

[30] HENNING J，STRAUSS U，WREE A，et al.Differential astroglial activation in 6- hydroxydopamine models of Parkinson’s disease[J].Neurosci Res，2008，62(4)：246- 253．

[31] LAVASANI M，THOMPSON S D，POLLETT J B，et al.Human muscle- derived stem/progenitor cells promote functional murine peripheral nerve regeneration[J].J Clin Invest，2014,124(4):1745- 1756．

[32] TANG Y，HE H，CHENG N，et al.PDGF，NT- 3 and IGF- 2 in combination induced transdifferentiation of muscle- derived stem cells into schwann cell- like cells[J].PLoS One，2014，9(1):e73402.

doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.01．033

[中圖分類號]R745

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)01- 0143- 04

[通信作者]劉建宇E- mail:liujianyu6@hotmail.com

[作者簡介]劉志鑫(1988-)，男，陜西安康人，在讀碩士研究生。E- mail:1025262831@qq.com

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81272015)

[收稿日期]2015- 07- 20[修回日期] 2015- 09- 18

[引文格式] 劉志鑫，張洪雨，劉建宇.肌源干細(xì)胞治療周圍神經(jīng)損傷的研究進(jìn)展[J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2016，35(1)：143- 146.

·綜述·