李德川，鮑秀琦，張德武，孫　華，戴均貴，張　丹

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京　100050)

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去氫丹參新酮對(duì)神經(jīng)炎癥的抑制作用及機(jī)制研究

李德川，鮑秀琦，張德武，孫華，戴均貴，張丹

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050)

中國(guó)圖書分類號(hào)：R284.1；R322.8；R329.24；R364.5；R745.7；R977.3；R977.6

摘要：目的研究去氫丹參新酮對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的抑制作用及其作用機(jī)制。方法不同濃度去氫丹參新酮預(yù)孵育BV2細(xì)胞后，用LPS刺激引起神經(jīng)炎癥相關(guān)反應(yīng)。Griess試劑法檢測(cè)去氫丹參新酮對(duì)活化的BV2細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮(nitric oxide, NO)的影響，ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6的釋放量，Confocal觀察小膠質(zhì)細(xì)胞表面活化標(biāo)志物MAC-1表達(dá)量的變化，Western blot檢測(cè)炎癥相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果去氫丹參新酮可明顯抑制LPS刺激BV2細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子包括NO、TNF-α和IL-6的水平，同時(shí)抑制一氧化氮合酶、環(huán)氧合酶-2等炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)和小膠質(zhì)細(xì)胞表面活化標(biāo)志物MAC-1的表達(dá)。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，去氫丹參新酮對(duì)PI3K/Akt的過度磷酸化以及NF-κB的過度活化都有明顯的抑制作用。結(jié)論去氫丹參新酮具有很好的抑制神經(jīng)炎癥活性，其作用機(jī)制可能是通過PI3K/Akt信號(hào)通路抑制NF-κB的活化而實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞：去氫丹參新酮；神經(jīng)炎癥；小膠質(zhì)細(xì)胞；NF-κB；PI3K/Akt；脂多糖

神經(jīng)炎癥是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫應(yīng)答反應(yīng)，主要由腦內(nèi)免疫細(xì)胞小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)。當(dāng)腦組織受到各種病理因素的損傷或刺激時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞可由靜息態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顟B(tài)，吞噬清除變性的神經(jīng)組織碎片，因此適度激活的膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用[1]。但是在病理?xiàng)l件下，膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)被過度激活，引起神經(jīng)炎癥，釋放大量的炎癥因子，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素(interleukin, IL)、谷氨酸鹽和一氧化氮(nitric oxide, NO)等[2]，導(dǎo)致神經(jīng)元功能喪失、變性甚至死亡，進(jìn)而引起神經(jīng)元的損傷。盡管神經(jīng)炎癥的機(jī)制還沒有完全研究清楚，但是普遍認(rèn)為神經(jīng)炎癥與多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)病密切相關(guān)[3]。如在阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease, AD)患者的大腦皮層可見β淀粉樣蛋白周圍存在有大量激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞，在帕金森疾病(Parkinson’s disease, PD)患者中腦黑質(zhì)紋狀體部位有大量多巴胺能神經(jīng)元的丟失，并伴有大量炎癥因子的存在[4]。鑒于炎癥反應(yīng)在神經(jīng)退行性疾病發(fā)病過程中的重要作用，控制疾病過程中的炎癥反應(yīng)將有助于神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防和治療。因此，從抗炎的角度研究和開發(fā)具有神經(jīng)保護(hù)作用的藥物已成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。丹參是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥，臨床上用于治療心腦血管疾病如冠心病、心絞痛等已有悠久的歷史。近年來，對(duì)丹參的研究發(fā)現(xiàn)，丹參中的丹參酮類物質(zhì)具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用，表現(xiàn)在抗炎、抗氧化、抗凋亡和抑制興奮性氨基酸毒性等多個(gè)方面[5]。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所生物合成室通過生物合成的方法從丹參的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離獲得的去氫丹參新酮(dehydromiltirone，結(jié)構(gòu)見Fig 1)，經(jīng)我們實(shí)驗(yàn)室的抗炎活性初篩后，發(fā)現(xiàn)其具有很好的抗炎活性。因此在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用經(jīng)典致炎劑脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2細(xì)胞建立體外神經(jīng)炎癥模型，進(jìn)一步評(píng)價(jià)去氫丹參新酮的抗炎作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。

1材料

1.1藥品與試劑去氫丹參新酮由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所生物合成室戴均貴教授提供，純度99.5%，用DMSO配制成10-2mol·L-1儲(chǔ)備液，分裝后于-20℃保存；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；新生胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物制品公司；LPS購(gòu)自默克密理博公司；兔抗NF-κB(p65)、兔抗p-Akt(Ser473)、兔抗Akt、兔抗p-PI3K(p85)、兔抗PI3K、小鼠抗p-IκBα、兔抗IκBα等抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；兔抗COX-2抗體購(gòu)自Abcam公司；兔抗CD11b抗體購(gòu)自ABD Serotec公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；小鼠TNF-α、IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒為欣博盛生物科技有限公司產(chǎn)品；胞核-胞質(zhì)蛋白制備試劑盒、ECL超敏發(fā)光液等購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

Fig 1　Chemical structure of dehydromiltirone

1.2儀器MQX-200酶標(biāo)儀(Bio-TeK.Instruments Inc.,USA)；Sigma 2K15離心機(jī)；垂直電泳儀和電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(北京六一儀器廠)；LAS4000化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(GE公司, USA)；FV1000MPE Multiphoton Laser Scanning Microscope(奧林巴斯，日本)。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心提供，于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔2~3天傳代，所用消化液為0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA。

2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV2細(xì)胞，經(jīng)消化計(jì)數(shù)后，以5.0×103個(gè)/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度去氫丹參新酮(1、5、10 μmol·L-1)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，小心吸去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 0.5 g·L-1的MTT，繼續(xù)37℃孵育4 h后，棄去上清液，每孔中加入200 μL DMSO，振蕩5 min以使結(jié)晶充分溶解，于酶標(biāo)儀540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。以對(duì)照組細(xì)胞存活率為100%，計(jì)算不同處理組細(xì)胞的存活率。

2.3NO測(cè)定采用Griess法測(cè)定亞硝酸鹽(NO2-)的含量來反映NO的濃度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV2細(xì)胞，經(jīng)消化計(jì)數(shù)后，以5×103個(gè)/孔接種到96孔板中，培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的去氫丹參新酮(1、5、10 μmol·L-1)預(yù)孵育1 h，然后加入LPS(1 mg·L-1)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集上清100 μL，加入等體積Griess試劑(以蒸餾水配制0.1%奈乙二胺，以5%磷酸配制1%對(duì)氨基苯磺酸，兩者在臨用前以1 ∶1等體積混合)，室溫靜置10 min，蒸餾水調(diào)零，在酶標(biāo)儀上測(cè)定540 nm處吸光度值，同時(shí)以硝酸鈉為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定吸光度值，計(jì)算亞硝酸鹽的含量。

2.4酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)BV2細(xì)胞以5.0×104個(gè)/孔接種于24孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入去氫丹參新酮(1、5、10 μmol·L-1)預(yù)孵育1 h，加入LPS(1 mg·L-1)繼續(xù)培養(yǎng)，分別在3 h和12 h后收集細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，測(cè)定細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6的含量。

2.5免疫熒光實(shí)驗(yàn)24孔板內(nèi)放置無菌玻璃片，BV2細(xì)胞以合適密度接種于24孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，加入去氫丹參新酮10 μmol·L-1預(yù)孵育1 h，再加入LPS(1 mg·L-1)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫下固定20 min，然后用0.5% Triton X-100室溫通透10 min，PBS洗3次，在玻片上滴加3%正常山羊血清，室溫下封閉2 h后，加入兔抗CD11b一抗(1 ∶250，PBS稀釋)，4℃孵育過夜。PBS洗3次，加入FITC標(biāo)記的二抗，37℃避光孵育60 min。PBS洗滌后，滴加3 mg·L-1DAPI，避光孵育5 min對(duì)標(biāo)本進(jìn)行核染，洗去多余的DAPI，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

2.6Western blot取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV2細(xì)胞，用胰酶消化后收集細(xì)胞計(jì)數(shù)，以5×107·L-1濃度接種于75 mm2培養(yǎng)瓶中，不同濃度的去氫丹參新酮(1、5、10 μmol·L-1)預(yù)孵育1h后，加入LPS(1 mg·L-1)，于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，檢測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白變化，24 h后檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路及iNOS和COX-2蛋白表達(dá)變化，收集細(xì)胞，并按照胞核-胞質(zhì)蛋白制備試劑盒說明書提取胞質(zhì)和胞核蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。制備好的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)12% SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h后，分別加入抗NF-κB(p65)、p-Akt(Ser473)、Akt、p-PI3K(p85)、PI3K、p-IκBα、IκBα、iNOS、COX-2等的一抗(1 ∶1 000, TBST稀釋)，4℃過夜，TBST洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育1 h，應(yīng)用LAS4000化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)?；叶确治霾捎肣uantity One軟件，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)。

3結(jié)果

3.1去氫丹參新酮對(duì)BV2細(xì)胞存活率的影響在確定去氫丹參新酮的給藥濃度之前，我們首先明確去氫丹參新酮在BV2細(xì)胞上的安全劑量范圍，因此我們采用MTT法觀察去氫丹參新酮對(duì)BV2細(xì)胞存活率的影響，以確定去氫丹參新酮的無毒劑量范圍。如Fig 2所示，不同劑量的去氫丹參新酮(1、5、10 μmol·L-1)與BV2細(xì)胞共孵育24 h后，細(xì)胞存活率沒有受到明顯的影響，提示去氫丹參新酮在該劑量范圍下無細(xì)胞毒性。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中去氫丹參新酮的給藥濃度為1、5、10 μmol·L-1。

Fig 2　Effects of dehydromiltirone on viability of BV2 cells

3.2去氫丹參新酮對(duì)LPS刺激的BV2細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響NO作為細(xì)胞內(nèi)重要的信使分子，參與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和重?cái)z取、神經(jīng)傳導(dǎo)和突觸可塑性等重要的生理過程，但是過量產(chǎn)生的NO也可以引起嚴(yán)重的神經(jīng)毒性[6]。Fig 3結(jié)果顯示,LPS(1 mg·L-1)與BV2細(xì)胞共同孵育24 h可激活小膠質(zhì)細(xì)胞，使NO產(chǎn)生大量增加，而去氫丹參新酮在10 μmol·L-1濃度時(shí)可明顯抑制NO的產(chǎn)生，5和1 μmol·L-1濃度時(shí)有降低NO的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.3去氫丹參新酮對(duì)LPS刺激BV2細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-6的影響激活的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放過量的炎癥因子是造成神經(jīng)元損傷、導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙的主要因素[7]。TNF-α和IL-6是兩類常見的炎癥因子，故本實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步檢測(cè)了去氫丹參新酮對(duì)LPS刺激BV2細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α和IL-6的影響。結(jié)果如Fig 4所示，對(duì)照組BV2細(xì)胞中TNF-α、IL-6的分泌量很低，與對(duì)照組相比，LPS(1 mg·L-1)刺激BV2細(xì)胞后，可使二者的釋放量明顯升高，提示LPS激活了小膠質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。同模型組相比，去氫丹參新酮給藥可明顯降低二者的釋放，表明去氫丹參新酮對(duì)LPS刺激BV2細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子具有抑制作用。

Fig 3　Effects of dehydromiltirone on nitric

3.4去氫丹參新酮對(duì)BV2細(xì)胞表面活化標(biāo)志物的影響巨噬細(xì)胞抗原復(fù)合體-1(macrophage 1 antigen, MAC-1)是表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞上的補(bǔ)體受體，由CD11b和CD18兩個(gè)亞基組成。MAC-1在活化的小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)量增加，常作為小膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志分子[8]。如Fig 5所示，LPS(1 mg·L-1)刺激BV2細(xì)胞24 h后，MAC-1蛋白表達(dá)明顯增加，表現(xiàn)為綠色熒光明顯增強(qiáng)。提前加入去氫丹參新酮預(yù)孵育1 h，能夠明顯抑制MAC-1的表達(dá)，鏡下可見綠色熒光強(qiáng)度減弱。該結(jié)果表明去氫丹參新酮對(duì)LPS引起的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化具有一定的抑制作用。

3.5去氫丹參新酮對(duì)LPS刺激BV2細(xì)胞表達(dá)iNOS、COX-2蛋白的影響小膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)的多種蛋白均參與小膠質(zhì)細(xì)胞活化后引起的炎癥反應(yīng)。誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)可由多種炎癥刺激物如LPS和細(xì)胞因子等誘導(dǎo)產(chǎn)生，其活性增強(qiáng)和表達(dá)增多常作為炎癥反應(yīng)的標(biāo)志[9]。環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)在炎癥刺激下誘導(dǎo)表達(dá)，其催化產(chǎn)生的前列腺素E2也是神經(jīng)炎癥反應(yīng)過程中的重要因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS(1 mg·L-1)刺激BV2細(xì)胞24 h后，iNOS和COX-2蛋白表達(dá)明顯增加，提示LPS刺激可引起炎癥蛋白的高表達(dá)，而提前加入去氫丹參新酮預(yù)孵育，可分別劑量依賴性地抑制LPS引起的iNOS、COX-2表達(dá)增加，表現(xiàn)出良好的抑制神經(jīng)炎癥的作用(Fig 6)。

Fig 4　Effects of dehydromiltirone on secretion of cytokines in BV2 cells stimulated by LPS

Fig 5　Effects of dehydromiltirone on

Cells were pretreated with dehydromiltirone for 1 h followed by LPS stimulation for 24 h. CD11b was probed by anti-CD11b antibody and FITC-conjugated secondary antibody. The nuclei were stained by DAPI and the images were captured by confocal microscopy. Bar=20 μm.

3.6去氫丹參新酮對(duì)LPS刺激BV2細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路激活的影響核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)信號(hào)通路是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要信號(hào)通路[10]。為了闡明去氫丹參新酮的抗炎作用機(jī)制，我們檢測(cè)了去氫丹參新酮對(duì)該信號(hào)通路的影響。Western blot結(jié)果顯示，未經(jīng)LPS處理的BV2細(xì)胞內(nèi)IκBα磷酸化水平較低，而LPS(1 mg·L-1)可引起IκBα磷酸化水平明顯增加，胞質(zhì)中IκBα蛋白的表達(dá)水平則無明顯改變，提前1h用去氫丹參新酮(1、5、10 μmol·L-1)預(yù)孵育BV2細(xì)胞，可以抑制LPS誘導(dǎo)的IκBα的磷酸化水平升高，其中5、10 μmol·L-1的去氫丹參新酮作用較為明顯。對(duì)NF-κB p65亞基的研究發(fā)現(xiàn)，LPS(1 mg·L-1)刺激BV2細(xì)胞24 h后，胞質(zhì)中NF-κB p65水平明顯降低，而胞核中NF-κB p65水平明顯提高，表明LPS可引起NF-κB信號(hào)通路的活化，使NF-κB p65亞基向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，而去氫丹參新酮可以劑量依賴性地抑制NF-κB p65亞基的核轉(zhuǎn)位，表明去氫丹參新酮抗炎作用的發(fā)揮與抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)(Fig 7)。

3.7去氫丹參新酮對(duì)LPS刺激BV2細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路的影響NF-κB作為多條炎癥信號(hào)通路的共同作用靶點(diǎn)，可被多種上游信號(hào)分子激活，其中磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)-絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(Akt)信號(hào)通路不僅在促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡的過程中發(fā)揮著重要作用，在炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮著重要的作用。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道PI3K/Akt可以調(diào)控NF-κB信號(hào)通路[11]，進(jìn)而調(diào)控神經(jīng)炎癥，因此我們也檢測(cè)了去氫丹參新酮對(duì)該信號(hào)通路的影響。Fig 8結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比，模型組PI3K和Akt的磷酸化水平明顯升高，表明PI3K/Akt信號(hào)通路在LPS的刺激下激活。同模型組相比，去氫丹參新酮可以明顯抑制PI3K和Akt的磷酸化，該結(jié)果表明去氫丹參新酮可以通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路而減少LPS刺激對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活，從而減輕炎癥反應(yīng)。

Fig 6　Effects of dehydromiltirone on LPS-induced

Fig 7　Effects of dehydromiltirone on phosphorylation

Fig 8　Effects of dehydromiltirone on phosphorylation

4討論

本研究表明， 去氫丹參新酮對(duì)LPS刺激BV2細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子NO、TNF-α和IL-6具有明顯的抑制作用，對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞表面活化標(biāo)志物MAC-1及炎癥因子蛋白合成酶iNOS和COX-2的表達(dá)具有明顯的抑制作用，去氫丹參新酮具有很好的抑制神經(jīng)炎癥的活性，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路抑制IκB的磷酸化，進(jìn)而抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位而實(shí)現(xiàn)的。

丹參在活血化瘀、改善微循環(huán)和抑制血小板聚集等方面有著明確的療效，復(fù)方丹參片和復(fù)方丹參滴丸等由丹參制成的藥物現(xiàn)廣泛應(yīng)用于臨床。大量的研究已表明丹參中的丹酚酸類物質(zhì)是其發(fā)揮心腦血管保護(hù)作用的主要成分[12]，但是丹參藥材中代表成分多達(dá)幾十種，對(duì)丹參中其他活性成分的藥理作用研究具有重要的意義。已有文獻(xiàn)報(bào)道，丹參中的丹參酮IIA、隱丹參酮和丹參酮I等均具有較好的抗炎活性[13]，具有保護(hù)神經(jīng)元的作用。去氫丹參新酮在結(jié)構(gòu)上與其他丹參酮類物質(zhì)相似，但尚未見有關(guān)其對(duì)神經(jīng)炎癥作用的報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到去氫丹參新酮對(duì)LPS刺激BV2細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子的釋放和炎癥蛋白的表達(dá)具有明顯的抑制作用，表明去氫丹參新酮具有很好的抑制神經(jīng)炎癥的作用。

NF-κB是與炎癥及凋亡有關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子，靜息狀態(tài)下與其抑制子(inhibitor of κB, IκB)結(jié)合，以二聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，激活后，IκB降解，NF-κB從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，引起相關(guān)炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要信號(hào)通路。已有大量研究表明，核內(nèi)NF-κB的增多和iNOS、IL-1β及TNF-α的表達(dá)密切相關(guān)[14]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到去氫丹參新酮能抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB p65亞基轉(zhuǎn)位入核，其變化情況與炎癥因子NO、TNF-α和IL-6及炎癥相關(guān)蛋白iNOS和COX-2的變化趨勢(shì)基本一致，提示去氫丹參新酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的抑制作用至少部分是通過抑制NF-κB的活化來實(shí)現(xiàn)的。NF-κB作為多條炎癥信號(hào)通路的共同作用靶點(diǎn)，受多種上游信號(hào)分子的調(diào)控。PI3K的活化導(dǎo)致磷脂酰激醇的磷酸化，進(jìn)而激活下游分子Akt，活化的Akt可以激活I(lǐng)κB激酶，從而使NF-κB從細(xì)胞質(zhì)中釋放出來，進(jìn)行核轉(zhuǎn)位，激活其靶基因，進(jìn)而促進(jìn)多種炎癥因子的表達(dá)。PI3K和Akt的磷酸化在LPS刺激后明顯增加，而去氫丹參新酮可以抑制PI3K和Akt的磷酸化，表明去氫丹參新酮可以通過PI3K/Akt信號(hào)通路抑制NF-κB的激活，發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，去氫丹參新酮具有很好的抗炎作用，有望成為新型的神經(jīng)保護(hù)劑，但其成藥性和作用機(jī)制尚需進(jìn)行更加深入的研究。

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The anti-neuroinflammatory effects of dehydromiltirone and related mechanisms

LI De-chuan, BAO Xiu-qi, ZHANG De-wu, SUN Hua, DAI Jun-gui, ZHANG Dan

(StateKeyLaboratoryofBioactiveSubstanceandFunctionofNaturalMedicines,InstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)

Abstract:AimTo investigate the anti-neuroinflammatory activities of dehydromiltirone and the underlying mechanisms in LPS- stimulated microglial cell line BV2 cells.MethodsBV2 cells were pre-treated with dehydromiltirone, then stimulated by LPS. The levels of nitric oxide(NO) were measured by Griess assay, and the concentrations of pro-inflammatory cytokines were measured by ELISA assay. Confocal fluorescence microscopy was used to measure the expression of MAC-1, the biomarker of activated BV2 cells. The levels ofinducible nitric oxide synthase(iNOS), cyclooxygenase-2(COX-2), NF-κB and PI3K/Akt were determined by Western blot analysis.ResultsThe treatment of dehydromiltirone significantly inhibited the production of NO, TNF-α and IL-6, attenuated the expression of iNOS and COX-2 protein, and dampened the microglial activation in LPS-stimulated BV2 cells.The mechanistic study revealed that dehydromiltirone inhibited the phosphorylation of PI3K and Akt in LPS-stimulated BV2 cells,and decreased NF-κB activation by suppressing the degradation of IκB.Conclusiondehydromiltirone shows significant anti-neuroinflammatory effects through inhibiting PI3K/Akt phosphorylation and then inhibiting NF-κB signaling pathway.

Key words:dehydromiltirone;neuroinflammation; microglia; NF-κB; PI3K/Akt;lipopolysaccharide

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2016)02-0177-07

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.007

作者簡(jiǎn)介：李德川(1988-)，男，碩士生，研究方向：神經(jīng)炎癥相關(guān)的藥物篩選及作用機(jī)制，E-mail:lidechuan@imm.ac.cn;張丹(1978-)，女，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞所介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥在多種疾病發(fā)病以及治療中的作用,通訊作者，E-mail: danzhang@imm.ac.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)資助項(xiàng)目(No 2011CB504105)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才(No 3332013128)；北京市科技新星項(xiàng)目(No 2011109)；北京市優(yōu)秀人才(No 2012D0009008000005)

收稿日期:2015-11-12,修回日期:2015-12-11

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.014.html網(wǎng)絡(luò)出版地址：2016-1-25 15:57

◇論著◇