胡月苗,孫崇波,向　林,胡鳳榮*

(1 南京林業(yè)大學 風景園林學院,南京 210037;2 浙江省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所,杭州 310021;3 華中農(nóng)業(yè)大學,武漢 430070)

?

春蘭AGL6-3基因的克隆及實時定量表達分析

胡月苗1,孫崇波2,向林3,胡鳳榮1*

(1 南京林業(yè)大學 風景園林學院,南京 210037;2 浙江省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所,杭州 310021;3 華中農(nóng)業(yè)大學,武漢 430070)

摘要:該研究以春蘭(Cymbidium goeringii)正常花及其2枚側(cè)瓣突變成唇瓣樣的花瓣(簡稱:蝶花)為實驗材料,采用 RT-PCR結(jié)合 RACE技術從春蘭中分離出AGL6-3基因。序列分析表明,AGL6-3基因在春蘭正?；ê偷ㄖ行蛄邢嗤?該基因含有1個720 bp長的開放閱讀框(ORF),共編碼239個氨基酸。系統(tǒng)進化樹進行分析表明,該基因?qū)儆?MADS-box基因中AP1/AGL9組的AGL6同源基因,命名為CgAGL6-3(基因登錄號為KU058679)。實時熒光定量表達分析表明,CgAGL6-3在春蘭正?；ê偷ǜ骰ㄆ鞴僦斜磉_存在差異。在正常春蘭中CgAGL6-3基因在唇瓣中強烈表達,在主萼、側(cè)萼及蕊柱中表達量較低,在側(cè)瓣中則微乎其微;而在蝶花中CgAGL6-3基因在唇瓣中強表達,側(cè)瓣中的表達量次之,在主萼、側(cè)萼和蕊柱中的表達量相近且均較低。研究說明,CgAGL6-3基因可能在春蘭蝶花側(cè)瓣唇瓣化的過程中扮演重要角色。

關鍵詞:春蘭;AGL6-3基因;蝶花;實時熒光定量表達

花是被子植物特有的功能器官,在大多數(shù)被子植物中,花有4個典型的組成部分,它們分布在同心輪上。萼片組成了最外面的一輪,向內(nèi)一輪由花瓣組成,作為雄性生殖器官的雄蕊位于第三輪,雌性生殖器官雌蕊位于第四輪并占據(jù)花的中心位置[1]。在雙子葉植物中,Coen等[2]通過對擬南芥(Arabidopsisthaliana)和金魚草(Antirrhinummajus)的花器官突變體研究,提出了花器官發(fā)育的ABC基因表達模型,為花器官發(fā)育調(diào)控基因的發(fā)展奠定基礎。1995年Colombo等[3]通過對矮牽牛的研究提出了ABCD模型。隨著研究的不斷深入,有人從蛋白聚合體控制花器官的形成方面提出了四因子模型[4],該模型基于擬南芥花同源異型蛋白能夠形成多聚體,具體作用如下:2A+2SEP決定萼片;A+2B+SEP決定花瓣;2B+C+SEP 決定雄蕊;2C+2SEP決定心皮。后來在四因子模型和經(jīng)典ABC模型的基礎上Theissen等提出ABCDE模型[5]。目前所獲得的花器官發(fā)育基因中除了APETALA2(AP2)外,編碼的蛋白質(zhì)N端都包含一個保守區(qū)-MADS-box[6]。

目前主要針對雙子葉模式植物擬南芥和金魚草等進行了花器官發(fā)育的研究[7]。單子葉植物花器官發(fā)育的研究主要集中在禾本科植物,如水稻(Oryzasativa)[8]和玉米(Zeamays)[9]上。蘭花作為單子葉植物中具有奇特花結(jié)構的植物,近期吸引了不少研究人員,并取得了不錯的研究成果。

AGL6及其同源基因都屬于MADS-box家族中E類基因的AP1/AGL9組。目前已從多種植物中克隆到了AGL6-like基因,如文心蘭(Oncidiumhybridum)的OMADS1[10-11]、麻竹(Dendrocalamuslatiflorus)的OMADS18[12]、風信子(Hyacinthusorientalis)的HoAGL6[13]、水稻的OsMADS6和OsMADS17[14]、玉米的ZAG3和ZAG5[15-16]和中國水仙的NtMADS3[17]等。研究表明,在植物文心蘭中AGL6類基因OMADS1在花分生組織、唇瓣和心皮中表達,但在營養(yǎng)葉、雄蕊、萼片和花瓣中并未檢測到其表達[10],矮牽牛(Petuniahybrida)中AGL6亞家族基因PMADS4在萼片、花瓣、心皮中表達量高,在雄蕊中無表達?？傮w來說,由于缺少相關基因功能缺失突變體,因此對確定這類基因具體功能還有待研究。蘭科植物是現(xiàn)今植物界中包含植物種類最多的科之一,含有超過20 000種蘭花,蘭花具有復雜的花型結(jié)構。春蘭(Cymbidiumgoeringii)是蘭科蘭屬植物,正常的春蘭花由3枚萼片、2枚側(cè)瓣和1枚唇瓣,以及處于中心部位的蕊柱組成(圖1,A)。蝶花一般指2枚側(cè)瓣或者2枚側(cè)萼發(fā)生變異,質(zhì)變成唇瓣樣的花瓣,屬于蘭花花瓣的一種‘唇瓣化’現(xiàn)象(圖1,B)。本研究采用RT-PCR及RACE技術獲得了1個與花發(fā)育相關的CgAGL6-3基因,并對其進行了表達分析。通過本研究,為揭示AGL6類基因在蘭花花器官發(fā)育過程中對側(cè)瓣特化的機理奠定理論基礎。

1材料和方法

1.1材料

取種植于浙江省農(nóng)業(yè)科學院園藝所花卉中心溫室內(nèi)的春蘭正?；ê偷閷嶒灢牧?分別采集2 cm≤花芽≤3 cm時期的花瓣、萼片、唇瓣、蕊柱立即用液氮凍存,并放入-70 ℃的冰箱中備用。

1.2總RNA的提取和AGL6-3基因的克隆

用試劑盒(本實驗室使用的是北京天恩澤基因公司RNAout 2.0試劑盒)分別提取春蘭正常花和蝶花花芽的RNA,再用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(美國Clontech公司所生產(chǎn))進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈,以合成的第1鏈作為模板進行PCR擴增。根據(jù)AGL6類基因保守區(qū)域來設計引物,設計的引物為上游引物AGL6-3A(5′-ACGATCACGAAACCCTGAAC-3′)和下游引物AGL6-3B(5′-GCTGGTACCTCCCAATTTGA-3′)。根據(jù)設計的引物進行PCR擴增,PCR擴增條件為:94 ℃變性3 min,94 ℃變性30 s,60～50 ℃復性30 s(每進行5個循環(huán)退火溫度下降2 ℃),72 ℃延伸1 min,總共進行35個循環(huán)后再72 ℃延伸5 min。用質(zhì)量分數(shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳進行切膠回收,連接到pEASY-Blunt Zero Cloning Kit載體上,42 ℃熱激轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans5α化學感受態(tài)細胞,Amp抗性篩選和X-gal/IPTG藍白斑篩選。選取白色菌落進行PCR檢測,陽性克隆并送去測序。

圖1　正常的春蘭(A)及蝶花(B)

根據(jù)擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果設計3′-RACE引物AGL6-3C(5′-GGCAAAAGAGGACGCAGCTAA-TG-3′)和5′-RACE引物AGL6-3D(5′-GCTCTCAT-TGATCCACCATCTGC-3′)。

采用Clontech公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒進行3′端和5′端的RACE反應。將3′端和5′端的RACE反應產(chǎn)物分別回收,連接pEASY-Blunt Zero Cloning Kit載體,轉(zhuǎn)化測序。拼接后獲得基因全長。

1.3AGL6-3基因序列分析

將獲得的基因全長cDNA序列,首先進行開放閱讀框的分析(在http://au.expasy.org/tools/dna.htmL進行分析);之后用ProtParam軟件來分析相關蛋白的基本性質(zhì),再用ClustalX 1.83軟件進行氨基酸水平的序列比對。接下來構建系統(tǒng)進化樹,首先在NCBI網(wǎng)頁上用Blast 搜索CgAGL6-3基因的同源基因,使用ClustalX 1.83軟件對搜索得到的基因進行多重序列比對,最后使用MEGA 6軟件中的NJ法構建系統(tǒng)發(fā)育樹,并進行Boot-strap檢測[18]。

1.4CgAGL6-3基因的實時熒光定量表達分析

根據(jù)試劑盒(采用北京天恩澤基因公司RNAout 2.0試劑盒)說明書分別提取春蘭正常花和蝶花的側(cè)瓣、主萼、側(cè)萼、唇瓣和蕊柱的RNA,用KAPA SYBR FAST qPCR Kit(天根生化科技(北京)有限公司)反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA,之后用熒光染料法進行實時熒光定量表達分析。根據(jù)已克隆出的CgAGL6-3基因序列設計1對特異性引物,用18SrRNA基因作為內(nèi)標。

18SrRNA基因上游引物為5′-GGTCCTATTGTGTTGGCT-3′,下游引物為5′-TCGCAGTGGTTCGTCTTT-3′。AGL6-3基因引物序列上游引物AGL6-3E(5′-TAACTTAGACGCAGAGCCCA-3′)和下游引物AGL6-3F(5′-GCCCATCCTGATATGAAACCG-3′)。qPCR-PCR反應在羅氏LightCycler 2.0熒光定量PCR儀上進行。反應條件為:95 ℃ 3 min,95 ℃ 3 s,60 ℃ 30 s,循環(huán)40次,每個處理重復3次。數(shù)據(jù)輸出的結(jié)果用Microsoft Excel軟件進行分析。

2結(jié)果與分析

2.1CgAGL6基因全長cDNA的克隆

用RT-PCR技術從春蘭花芽中獲得部分基因片斷,測序并在NCBI上分析表明,該片段為目的片段,即為CgAGL6-3基因的部分片段。根據(jù)所得序列設計3′-RACE和5′-RACE特異引物,按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit的說明書進行cDNA末端擴增,獲得了3′和5′的擴增片段,測序后將兩端拼接得到基因全長cDNA序列(圖2)。Blastx的結(jié)果顯示,全長cDNA與其他植物AGL6類基因有較高的同源性,該基因含有1個720 bp長的開放閱讀框,共編碼239個氨基酸,將基因命名為CgAGL6-3,Gen-Bank登錄號為KU058679。CgAGL6-3分子量為27.5 kD,預測等電點為9.56。

2.2CgAGL6-3基因序列分析

氨基酸序列比對結(jié)果(圖3)顯示,CgAGL6-3蛋白與從春石斛(Dendrobiumhybrid)中克隆的DAGL6基因蛋白有較高的同源性,其中氨基酸序列具有92%的一致性。與AP1/AGL9組扇葉文心蘭(Erycinapusilla)的EPMADS5以及文心蘭(Oncidiumhybrid)OMADS1的蛋白也具有較高的同源性,且與兩者的氨基酸序列都為90%的一致性。與粉花六出花(Alstioemerialigtu)的AlMADS和石刁柏(Asparagusofficinalis)的AoMADS分別有 71%和72%的一致性,春蘭的CgAGL6-1與CgAGL6-3氨基酸序列的相似性為64.9%(圖 3)。此為在該氨基酸的C端發(fā)現(xiàn)了典型的SEP/AGL6保守結(jié)構域(圖3)。

系統(tǒng)進化樹分析(圖5)表明AP1/AGL9亞族分為AGL6、SEP和AP1三個分支,CgAGL6-3基因?qū)儆贏GL6分支,與春石斛的DAGL6和文心蘭的OMADS1關系最近,與其它植物AGL6類基因的相似性也較高,表明CgAGL6-3為AGL6的同源基因。

2.3CgAGL6-3基因在不同器官的表達分析

為了解CgAGL6-3基因的功能及確定CgAGL6-3基因在春蘭正?；ê偷ú煌ㄆ鞴俚谋磉_差異,提取了春蘭正?；ê偷ǖ闹鬏?、側(cè)萼、側(cè)瓣、唇瓣和蕊柱的RNA,并進行實時熒光定量表達分析。將基因在正?；ㄈ镏谋磉_量設定為1,結(jié)果表明(圖4),在正?；ㄖ蠧gAGL6-3基因表達主要集中在唇瓣中,在主萼、側(cè)萼及蕊柱中表達較少,在側(cè)瓣中幾乎不表達。而在蝶花中CgAGL6-3基因表達量在唇瓣中最高,側(cè)瓣中的表達量次之,在主萼、側(cè)萼和蕊柱中的表達量都很低。綜合來看,蝶花中唇瓣的表達量最高,正?；ㄖ写桨甑谋磉_量次之,約為蝶花中唇瓣表達量的45%,蝶花中側(cè)瓣的表達量為蝶花唇瓣的19%,而正?；▊?cè)瓣中CgAGL6-3基因表達量僅占蝶花唇瓣表達量的0.001%。

1.DL2000;2.AGL6-3

扇葉文心蘭.EpMADS5(AHM92081);文心蘭.OMADS1(ADJ67237);春石斛.DAGL6(AHA42267);

圖4　春蘭CgAGL6-3在各花器官中的表達

除了圖2中用于多序列比對的部分基因序列外,其它序列來源為:蕙蘭.CfAGL6(ADI58465);建蘭.CeAGL6(AFM97201)、

3討論

目前,MADS-box基因是研究最多的植物轉(zhuǎn)錄因子之一,這一類基因廣泛存在于真核生物中[18],通過對擬南芥和金魚草突變體的遺傳和分子特性研究揭露MADS-box基因盒對花器官發(fā)育起著很重要的作用[1]。之前對單子葉植物花發(fā)育研究主要以經(jīng)濟作物水稻和玉米等為主,但這些植物的花結(jié)構高度特化不適合用來研究花器官發(fā)育,因此對于揭開單子葉植物花發(fā)育的各個謎團蘭科植物特化的花結(jié)構是非常合適的研究對象[19]。本研究采用同源序列法和RACE技術從春蘭正常花以及側(cè)瓣唇瓣化的蝶花中都克隆出了一個E類基因。該基因?qū)儆谔m科植物AP1/AGL9組的AGL6-like類基因,命名為CgAGL6-3。

研究表明,蘭花唇瓣的形成原因并無法單純的由B類基因來解釋,并提出蘭花唇瓣的形成受蛋白復合物的調(diào)控,B類基因的蛋白必須與一群AGL6的蛋白形成蛋白四聚體,在蘭花中這種復合物有兩種,一種是‘唇瓣復合物’(L complex),另一種是‘花萼/花瓣復合物’(SP complex)。在蘭花中這兩種復合物相互競爭,當‘唇瓣復合物’占優(yōu)勢花器就發(fā)育成唇瓣,當‘花萼/花瓣復合物’占優(yōu)勢時花器就往花萼/花瓣發(fā)展,若兩者同時等量存在就會產(chǎn)生唇瓣與花萼/花瓣的中間型產(chǎn)物[20]。

孫崇波等[21]研究表明,CgAGL6-1基因在春蘭的不同部位表達量不同,在花器官中表達量從高到低的部位順序為唇瓣、側(cè)瓣、萼片和蕊柱,這與春蘭蝶花的CgAGL6-3基因表達相似,說明春蘭CgAGL6-1和CgAGL6-3基因可能存在部分功能冗余。目前對CgAGL6-3基因在花器官的不同組織上的表達分析可知,在春蘭正?；ㄖ蠧gAGL6-3基因在唇瓣中強烈表達,在主萼、側(cè)萼、及蕊柱中表達量較低,在側(cè)瓣中則微乎其微。而在蝶花中CgAGL6-3基因表達量在唇瓣中最高,側(cè)瓣中的表達量次之,在主萼、側(cè)萼和蕊柱中的表達量相近且都較低。這些說明CgAGL6-3基因可能在春蘭側(cè)瓣特化成唇瓣過程中起到一定的作用,而這與Hsu等[10]研究發(fā)現(xiàn)文心蘭AGL6類基因OMADS1有相似之處,OMADS1基因在2 mm和10 mm的花芽中均有表達,且在10 mm的花芽中表達較強,研究表明在10 mm的花芽中,OMADS1基因在唇瓣和心皮中表達,且在唇瓣中表達較強,但OMADS1基因與Chang等[22]發(fā)現(xiàn)的文心蘭OMADS7基因在萼片、側(cè)瓣、唇瓣和心皮中都有表達不同。綜合來看春蘭CgAGL6-3基因在蝶花唇瓣中如此高的表達量可推測CgAGL6-3基因?qū)Υ禾m唇瓣的形成起一定的推動作用。至于CgAGL6-3基因在春蘭中如何行使其功能今后我們將對其做進一步研究。

參考文獻:

[1]WEN C T,ChANG S K,MING H C,etal.Four DEF-like MADS box genes displayed distinct floral morphogenetic roles inPhalaenopsisorchid[J].Plant&CellPhysiology,2004,45(7):831-844.

[2]COEN E S,MEYEROWITZ E M.The war of the whorls:genetic interactions controlling flower development[J].Nature,1991,353(6 339):31-37.

[3]COLOMBO L,FRANKEN J,KOETJE E,etal.The petunia MADS box geneFBP11 determines ovule identity[J].PlantCell,1995,7:1 859-1 868.

[4]HONMA T,GOTO K.Complexes of MADS-box proteins are sufficient to convert leaves into floral organs[J].Nature,2001,409:525-529.

[5]THEISSEN G.Development of floral organ identity:stories from the MADS house[J].CurrentOpinioninPlantBiology,2001,4:75-85.

[6]SCHWARZ S Z,HUIJSER P,NACKEN W,etal.Genetic control of flower development by homeotic genes inAntirrhinummajus[J].Science,1990,250(4 983):931-936.

[7]THEISSEN G,BECKER A,DI R A,etal.A short history of MADS-box genes in plants[ J].PlantMol.Bio.,2000,42(1):115-149.

[8]MOON Y H,JUNG J Y,KANG H G,etal.Identification of a rice APETALA3 homologue by yeast two-hybrid screening[J].PlantMolecularBiology,1999,40:167-177.

[9]AMBROSE B A,LERNER D R,CICERI P,etal.Molecular and genetic analyses of the silky1 gene reveal conservation in floral organ specification between eudicots and monocots[J].MolecularCell,2000,5:569-579.

[10]HSU H F,HUANG C L,YANG C H.Ectopic expression of an orchid (OncidiumGowerRamsey) AGL6-like gene promotes flowering by activating flowering time genes inArabidopsisthaliana[J].Plant&CellPhysiology,2003,44(8):783-794.

[11]CHANG Y Y,CHIU Y F,WU J W,etal.Four orchid (OncidiumGowerRamsey) AP1/AGL9-like MADS box genes show novel expression patterns and cause different effects on floral transition and formation inArabidopsisthaliana[J].Plant&CellPhysiology,2009,50(8):1 425-1 438.

[12]FRANKLIN D C,SYNCHRONY,ASYNCHRONY:Observations and hypotheses for the flowering wave in a long-lived semelparous bamboo[J].JournalofBiogeography,2004,31(5):773-786.

[13]FAN J,LI W,DONG X,etal.Ectopic expression of a hyacinth AGL6 homolog caused earlier flowering and homeotic conversion inArabidopsis[J].ScienceinChina,2007,37(4):676-689.

[14]SHINNOSUKE O,MAYUMI K,MAIKO S,etal.MOSAIC FLORAL ORGANS1,an AGL6-Like MADS box gene,regulates floral organ identity and meristem fate in rice[J].PlantCell,2009,21(10):3 008-3 025.

[15]MENA M,MANDEL,MALEMER D R,YANOFSKY M F,etal.A characterization of the MADS-box gene family in maize[J].PlantJournalforCell&MolecularBiology,1995,8(6):845-854.

[16]THOMPSON B E,BARTLING L,WHIPPLE C,etal.Bearded-ear encodes a MADS box transcription factor critical for maize floral development[J].PlantCell,2009,21(9):2 578-2 590.

[17]高志民,陳段芬,彭鎮(zhèn)華.中國水仙NtMADS3基因全長的克隆與表達分析[J].北京林業(yè)大學學報,2009,(2):96-101.

GAO Z M,CHEN D F,PENG Z H.Cloning and expression analysis ofNtMADS3 full-length gene fromNarcissustazettaL.var.chinensis[J].JournalofBeijingForestryUniversity,2009,(2):96-101.

[18]PAVAN P A,KUMAR P P.PkMADS1 is a novel MADS box gene regulating adventitious shoot induction and vegetative shoot development inPaulowniakawakamii[J].PlantJournalforCell&MolecularBiology,2002,29(2):141-151.

[19]SAITOU N,NEI M,The neighbor-joining method:a new method for reconstructing phylogenetic trees[J].MolecularBiologyEvolution,1987,4(4):406-425.

[20]HSU H F,HSU W H,LEE Y I,MAO W T,etal.Model for perianth formation in orchids[J].NaturePlants,2015,46(15 046):1-8.

[21]孫崇波,向林,施季森,等.春蘭AGL6基因的克隆及實時定量表達分析[J].分子植物育種,2010,8(5):939-944.

SUN C B,XIANG L,SHI J S,etal.Cloning and real-time expression analysis ofAGL6 gene fromCymbidiumgoeringii[J].Mol.PlantBreeding,2010,8(5):1-6.

[22]CHANG Y Y,CHIU Y F,WU J W,etal.Four orchid (OncidiumGowerRamsey) AP1/AGL9-like MADS box genes show novel expression patterns and cause different effects on floral transition and formation inArabidopsisthaliana[J].Plant&CellPhysiology,2009,50(8):1 425-1 438.

(編輯:宋亞珍)

Cloning and Real-time Expression ofAGL6-3 Gene fromCymbidiumgoeringii

HU Yuemiao1,SUN Chongbo2,XIANG Lin3,HU Fengrong1*

(1 College of Landscape Architecture,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,China;2 Institute of Horticulture,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310021,China;3 Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China)

Abstract:The study used Cymbidium goeringii wild type and peloric mutant (two lateral petals mutated into lips) as experiment materials.In this research,a novel AGL6-3 gene was isolated from C.goeringii by RT-PCR and RACE-PCR techniques.Sequence analysis showed AGL6-3 gene sequences are same in the wild type and peloric mutant of C.goeringii.The gene contained an open reading frame of 720 bp encoding a putative protein of 239 amino acids.Phylogenetic tree analysis indicated that CgAGL6-3 belongs to AGL6 clade of AP1/AGL9 subfamily,named CgAGL6-3 (GenBank accession No.KU058679).Real-time quantitative PCR demonstrated that,in wild type CgAGL6-3 was highly expressed in lips,lower in dorsal sepal,lateral sepal,column,and very little in lateral petal.Whereas expression of CgAGL6-3 in peloric mutant was the highest in lip,lateral petal comes second,lower and close in dorsal sepal,lateral sepal and column.These results indicated that CgAGL6-3 play a important role in the process that lateral petals specialized into lips.

Key words:Cymbidium goeringii;AGL6 gene;peloric mutant;real-time quantitative PCR

*通信作者:劉虎岐,博士,副教授,碩士生導師,主要從事植物發(fā)育生物學及分子生物學的研究。E-mail:liuhuqi@nwsuaf.edu.cn

中圖分類號:Q785;Q786

文獻標志碼:A

作者簡介:胡月苗(1990-),女,碩士研究生,主要從事園林植物遺傳育種方面研究。E-mail:281171089@qq.com*通信作者:胡鳳榮,副教授,主要從事園林植物遺傳育種方面研究。E-mail:hufengrong2003@sina.com 張婷(1989-),在讀碩士研究生,主要從事花發(fā)育基因研究。E-mail:yuerzt@163.com

基金項目:林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201304117);國家青年自然科學基金(31300583,31400593);浙江省公益技術研究農(nóng)業(yè)項目(2014C32100) 中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(201207002);中醫(yī)藥公共衛(wèi)生專項(財社[2011]76號)

收稿日期:2015-12-26;修改稿收到日期:2016-01-25 2015-10-28;修改稿收到日期:2016-01-06

文章編號:1000-4025(2016)02-0225-06 1000-4025(2016)02-0231-10

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.02.0225 10.7606/j.issn.1000-4025.2016.02.0231