李天芝，于新友，謝金文，沈志強(qiáng)

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

豬細(xì)小病毒分子生物學(xué)診斷技術(shù)及基因工程疫苗的研究進(jìn)展

李天芝1，于新友1，謝金文2，沈志強(qiáng)2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

文章論述了豬細(xì)小病毒分子生物學(xué)診斷方法，包括常規(guī)PCR方法、多重PCR方法、熒光定量PCR方法、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)、基因芯片等，并就其基因工程疫苗方面的研究進(jìn)行了著重闡述。

豬細(xì)小病毒；分子生物學(xué)診斷；基因工程疫苗

豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus,PPV）可引起母豬發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、產(chǎn)畸形胎、胎兒木乃伊化和不孕等，初產(chǎn)母豬受到的危害最為嚴(yán)重[1]。PPV為細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬成員，只有一個血清型，為單股線狀負(fù)鏈DNA病毒，基因組大小約為5 000 bp，共編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和3種非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2、NS3。1966年Mary和Mahnel首次發(fā)現(xiàn)該病毒，后來證實了其致病作用[2]，PPV在世界各地廣泛流行[3]，1983年，我國首次發(fā)現(xiàn)該病，隨后在四川、浙江、吉林和上海等地均有相關(guān)報道[4]。一旦PPV傳入陰性豬場，可在3個月內(nèi)感染豬場所有豬，在本病發(fā)生后，豬場可能連續(xù)幾年不斷地出現(xiàn)母豬繁殖失敗[5]。PPV常和豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）、乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）、豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）等混合感染而加重了其危害，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。近年來，各國專家學(xué)者對PPV分子生物學(xué)診斷技術(shù)及基因工程疫苗進(jìn)行了大量的研究，本文就研究進(jìn)展情況綜述如下。

1 分子生物學(xué)診斷

1.1 常規(guī)PCR方法

PCR方法是根據(jù)目的片段序列設(shè)計引物，借助儀器和DNA聚合酶體外大量擴(kuò)增部分或全部目的片段，是一種快速、簡便、特異的診斷方法。劉業(yè)兵等[7]建立了PPV PCR檢測方法，可成功擴(kuò)增出1 980 bp預(yù)期片段，該法特異性好，對其他豬病毒的檢測結(jié)果均為陰性，敏感性強(qiáng)，可檢測到0.9 TCID50、0.001個HA的病毒。崔宇超等[8]根據(jù)PPV VP2基因的保守區(qū)域設(shè)計1對擴(kuò)增472 bp片段的特異性引物，建立了PPV納米PCR檢測方法，該法檢測敏感性是普通PCR的1 000倍，最低核酸檢出量為4拷貝/μL。對其他相關(guān)病毒核酸檢測結(jié)果均呈陰性。分別采用納米PCR和普通PCR對3個省份送檢的43份臨床樣品進(jìn)行檢測，PPV陽性率分別為95%（41/43）和75.6%（31/41），表明該納米PCR檢測方法具有更高的敏感性，適用于PPV低含量臨床樣品的檢測。

1.2 多重PCR方法

多重PCR是一種特殊的PCR技術(shù)，它在同一PCR體系中，加入多對引物，同時檢測2種或2種以上的病毒DNA，它具有快速、靈敏度高、高效、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而廣泛用于臨床的快速診斷。岳豐雄等[9]建立了一種能夠同時檢測PCV2、PPV、PRV、PRRSV的多重PCR方法，分別可擴(kuò)增PCV2 ORF2基因353 bp片段、PPV NS1基因271 bp片段、PRRSV MN基因美洲型434 bp片段、PRV gB基因194 bp片段。該方法具有很好的特異性，對豬瘟病毒、大腸桿菌和雙蒸水的PCR擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，敏感性高，對PPV、PRV、PRRSV和PCV2的最低檢測量分別為8.64×10-3、2.36×10-3、3.68×10-3、2.90×10-4μg。朱向博等[10]根據(jù)GenBank中PPV VP2基因和豬源腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus,EMCV）3D基因，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計出PPV和EMCV的特異性引物。通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了能同時特異性檢測PPV和EMCV的二重PCR方法，PPV和EMCV的敏感性檢測極限分別達(dá)7.62和1.22× 10-1pg/μL。謝燕婷等[11]利用DNAstar軟件對PRV gB基因、PCV2 ORF2基因和PPV VP2基因的保守區(qū)設(shè)計引物，對PRV、PCV2和PPV擴(kuò)增片段的大小分別為373、430和495 bp，對PRV、PCV2和PPV核酸檢測的敏感性分別為1.62×10-6、1.47×10-6和1.28×10-4ng，對滅菌雙蒸水、豬繁殖與呼吸綜合征病毒cDNA和豬瘟病毒cDNA的mPCR擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。于新友等[12]根據(jù)GenBank中登錄的PCV2和PPV核苷酸序列，分別設(shè)計2對引物，在建立各病毒單項PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化雙重PCR反應(yīng)條件，建立了2種病毒的雙重PCR檢測方法，用這2對引物對同一樣品中的PCV2和PPV核酸模板進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，結(jié)果可同時擴(kuò)增PCV2的245 bp、PPV的475 bp的特異性片段，而對其他4種病原的PCR擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。敏感性測定結(jié)果表明，該雙重PCR技術(shù)能檢出1 pg的PCV2和1 pg的PPV模板。

1.3 熒光定量PCR方法

熒光定量PCR技術(shù)是指采用SYBR GreenⅠ熒光染料或熒光探針通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強(qiáng)弱的變化來測定特異性產(chǎn)物的量，不需要分離PCR產(chǎn)物，即能準(zhǔn)確定量起始模板數(shù)。黃律等[13]根據(jù)Gen－Bank中發(fā)表的PPV4型全基因組序列，針對其結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因的保守序列，設(shè)計1對引物，建立了PPV4的Taq Man熒光定量PCR。該法在6.73×109copies/μL至6.73×101copies/μL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.998，對PPV4的最低檢測限為6.73×101copies/μL。特異性試驗結(jié)果顯示，用該方法檢測其他基因型PPV、PRRSV、豬瘟病毒及PCV2等臨床常見病毒，結(jié)果均為陰性，批內(nèi)及批間變異系數(shù)均低于2%。沈志強(qiáng)等[14]根據(jù)GenBank登錄的PPV VP2基因序列設(shè)計1對引物，建立了檢測PPV的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR方法，結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)閾值與模板濃度呈良好的線性關(guān)系，R2=0.997 6，產(chǎn)物Tm為82.3～82.9℃，檢測靈敏度為72.1拷貝/μL，特異性和重復(fù)性良好。容新宗等[15]根據(jù)PPV的VP2基因保守序列，設(shè)計并合成引物，對目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增的PPV VP2基因片段克隆入PMD19-T載體，重組質(zhì)粒PMD19-T-VP2經(jīng)測序鑒定正確后，作為標(biāo)準(zhǔn)品模板，建立了以EvaGreen為染料的實時熒光定量PCR檢測PPV的方法，結(jié)果顯示，用重組質(zhì)粒PMD19-T-VP2制作的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線循環(huán)閾值與模板濃度具有良好的線性關(guān)系，該方法檢測靈敏度的下限能達(dá)到102copies/μL，與其他DNA病毒和同種屬的細(xì)小病毒無明顯的交叉反應(yīng)，連續(xù)重復(fù)檢測高、中、低濃度樣品，批內(nèi)批間變異系數(shù)小，重復(fù)性好。鄭蘭蘭等[16]根據(jù)GenBank中登錄的基因序列，分別設(shè)計了2對針對PRV gH和PPV NS1基因的引物，建立一種能快速、靈敏、同時檢測出PPV與PRV的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法。結(jié)果顯示，PPV與PRV熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線的Tm值分別為80.9℃和86.5℃，熔解曲線特異，靈敏度分別可達(dá)248拷貝/μL和160拷貝/μL，是普通PCR檢測方法的100倍。余波等[17]根據(jù)GenBank中PPV VP2基因序列設(shè)計特異性的引物，PCR擴(kuò)增獲得PPV VP2基因片段，并克隆到pMD-18T載體上作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。通過對SYBR GreenⅠ熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了PPV的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR診斷方法，以此為基礎(chǔ)研制出試劑盒。試劑盒擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線分析只出現(xiàn)1個單特異峰，無引物二聚體，對PRV、PCV2、E.coli、豬瘟病毒、PRRSV均無陽性信號擴(kuò)增，可重復(fù)性好，測靈敏度可達(dá)1.0×101拷貝/μL。

1.4 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplication,LAMP）是在等溫條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)?；虻臄U(kuò)增和產(chǎn)物的檢測可一步完成，擴(kuò)增效率和特異性高，可在15～60 min擴(kuò)增109～1010倍，可只通過擴(kuò)增產(chǎn)物的有無來判別。劉業(yè)兵等[18]據(jù)GenBank公布的PPV序列，在其保守序列區(qū)域設(shè)計了多套LAMP引物，建立了對PPV LAMP檢測方法，結(jié)果顯示，該法在63℃恒溫下作用45 min，PPV DNA獲得了高效率的特異性擴(kuò)增，其檢出限量為0.23 TCID50，敏感性高，在反應(yīng)結(jié)束后加入SYBR GreenⅠ肉眼判斷結(jié)果，與Real Time Turbidimeter LA-320儀監(jiān)測結(jié)果一致。黃書林等[19]針對PPV NS1基因保守區(qū)域設(shè)計6條特異引物，建立了一種靈敏、特異、快速的PPV LAMP檢測方法，該法在63℃的等溫條件下45 min即可完成反應(yīng)。最低檢測限量為10拷貝的PPV目的基因，比常規(guī)PCR法敏感100倍，具有良好的特異性。以鈣黃綠素和Mn2+作為熒光指示劑，可快速、直觀判定反應(yīng)結(jié)果。陳星瑤等[20]建立了快速檢測PPV的LAMP方法，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，擴(kuò)增溫度60℃、62℃、64℃和66℃均可以，最佳擴(kuò)增時間為45 min，最低可檢測10拷貝的PPV核酸模板量，特異性良好，對豬鏈球菌、PRRSV、豬水皰病病毒、PRV、豬瘟病毒、豬流感病毒、O型口蹄疫病毒、豬藍(lán)耳病病毒和水?dāng)U增結(jié)果均為陰性，不需要電泳檢測反應(yīng)結(jié)果，只需向產(chǎn)物管內(nèi)加SYBR GreenⅠ熒光染料，肉眼觀察，陽性反應(yīng)管顏色立刻變?yōu)辄S綠色，且模板濃度不同顏色有深淺變化，結(jié)果容易判定，適于臨床推廣。

2 基因工程疫苗

2.1 核酸疫苗

構(gòu)建含有外源抗原基因的重組質(zhì)粒，免疫動物后，表達(dá)的特異性抗原蛋白通過與MHC-Ⅰ類或MHC-Ⅱ類抗原分子結(jié)合，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，該類疫苗稱為核酸疫苗，又名DNA疫苗。王印等[21]構(gòu)建了含有PPV VP2基因核酸疫苗pcDNAVP2，肌注BALB/c小鼠，作間接ELISA抗體檢測試驗，并采用淋巴細(xì)胞增殖試驗（MTT法）和流式細(xì)胞儀（FACS）法對小鼠的細(xì)胞免疫進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，pcDNA-VP2能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。梅淼等[22]構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCI-IFN-γ.ORF2. VP2和pCI-ORF2.VP2，分別將重組質(zhì)粒肌肉注射免疫小鼠，并設(shè)pCI-neo、PBS、PPV滅活苗和豬圓環(huán)病毒亞單位疫苗免疫組做對照，檢測小鼠不同時期的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能、T淋巴細(xì)胞亞群動態(tài)變化情況以及PPV、PCV2抗體水平。結(jié)果顯示，pCI-IFN-γ. ORF2.VP2免疫組從第7天開始脾淋巴細(xì)胞對ConA有明顯反應(yīng)，顯著高于對照組和pCI-ORF2.VP2免疫組，CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量高于或顯著高于對照組和pCI-ORF2.VP2免疫組，在免疫后第14天檢測到PPV、PCV抗體。說明pCI-IFN-γ. ORF2.VP2能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫。孫彥欣等[23]將PCV2編碼T細(xì)胞表位P21多肽的序列連接于PPV VP2基因的5'端克隆于pcDNA3.1（+）中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-P21-VP2，將其肌肉注射BALB/c小鼠后，檢測免疫相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒能夠有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生明顯的抗體反應(yīng)，并且對淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)有明顯促進(jìn)作用。

2.2 活載體疫苗

采用弱毒或無毒病原微生物作為表達(dá)載體，對其導(dǎo)入外源抗原基因，制成疫苗后，接種動物，誘導(dǎo)機(jī)休產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，這類新型疫苗稱為活載體疫苗。徐義剛等[24]將構(gòu)建的重組PPV VP2基因的細(xì)胞表面表達(dá)型載體pPG-VP2電轉(zhuǎn)化干酪乳桿菌L.casei393，獲得陽性重組菌pPG-VP2/L.casei393。將重組菌及空質(zhì)粒菌株分別口服接種BALB/c小鼠，收集糞便及腸黏液樣品測定小鼠產(chǎn)生抗VP2的特異性sIgA，采集血液樣品測定小鼠產(chǎn)生抗VP2的特異性IgG，并對獲得的抗體進(jìn)行PPV中和活性的測定。結(jié)果顯示，該重組菌能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的抗PPV sIgA和IgG抗體水平，其對PPV的中和效價分別為1∶24和1∶128。王林青等[25]將PPV VP2基因和豬IL-18基因分別插入到PRV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒PG中，得到重組質(zhì)粒PG18-VP2。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒PG18-VP2與豬PRV弱毒株DNA共轉(zhuǎn)染豬睪丸細(xì)胞，以EGFP熒光標(biāo)記，通過5輪蝕斑篩選純化，成功獲得表達(dá)PPV VP2蛋白和豬IL-18且?guī)GFP標(biāo)記的重組偽狂犬病病毒IL18-VP2-rPRV。用重組病毒感染ST細(xì)胞，12 h后在熒光顯微鏡下可見明亮的綠色熒光，通過RT-PCR證實感染細(xì)胞中含有PPV VP2和豬IL-18 mRNA，Western-blot試驗結(jié)果顯示，重組病毒能表達(dá)具有生物活性的PPV VP2蛋白和豬IL-18。重組病毒經(jīng)連續(xù)20次傳代后感染細(xì)胞仍能發(fā)出綠色熒光，PCR檢測表明VP2及IL-18基因在重組病毒中能穩(wěn)定遺傳。為進(jìn)一步研究表達(dá)PPV VP2蛋白和豬IL-18的重組豬偽狂犬病病毒的免疫效力奠定了基礎(chǔ)。

2.3 病毒樣顆粒疫苗

病毒樣顆粒又稱偽病毒或假病毒，是由病毒的一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白自動組裝而成的空心顆粒，外形與天然病毒粒子相似，不含病毒核酸，不能復(fù)制，具有很強(qiáng)的免疫原性，可作為免疫源，安全性好，無感染性，能誘導(dǎo)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)，是研制安全高效的預(yù)防病毒病的潛在候選疫苗。Martínez等[26]將PPV VP2基因克隆到桿狀病毒系統(tǒng)中，并成功地在昆蟲細(xì)胞中高效表達(dá)，表明VP2多肽能夠自我裝配成VLPs，該研究為PPV新型亞單位疫苗的研究提供了新思路，而且PPV VLPs不僅自身可以作為疫苗，在外源多肽的轉(zhuǎn)運(yùn)及多價疫苗的研制中也發(fā)揮重要作用。Antonis等[27]用昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的PPV VP2基因產(chǎn)物制備VLPs疫苗，在添加免疫佐劑的情況下，VLPs疫苗可在豬體內(nèi)產(chǎn)生高滴度的血清抗體。潘群興等[28]將O型口蹄疫病毒（FMDV）VP1中編碼T細(xì)胞表位肽（aa 21-aa 40）序列連接于PPV VP2的5'端，并插入到桿狀病毒供體質(zhì)粒pFastBac HTA中，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)座載體pFastBac-FMDV-VP1-PPV-VP2，轉(zhuǎn)化含有穿梭載體Bacmid的E.coli DH10Bac中，經(jīng)藍(lán)白菌落篩選獲得重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒rBac-FMDV-VP1-PPVVP2，轉(zhuǎn)染昆蟲草地夜蛾（Sf9）細(xì)胞，并在Sf9中進(jìn)行了表達(dá)。電鏡觀察顯示，表達(dá)的重組蛋白能夠自我組裝成病毒樣顆粒，小鼠免疫試驗證實，在低濃度FMDV抗原下能夠產(chǎn)生特異性T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，而且該病毒樣顆粒能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗FMDV特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。徐志文等[29]以pEGFP-C1為載體構(gòu)建了含有PCV2 ORF2基因和PPV VP2基因的重組質(zhì)粒pEGFP-VP2.ORF2，經(jīng)轉(zhuǎn)染及電鏡觀察表明成功獲得VP2.ORF2重組病毒樣顆粒。重組病毒樣顆粒經(jīng)超速離心純化后免疫小鼠，同時設(shè)立PPV普通疫苗組、PCV2弱毒株組及空白對照組，并在不同時期檢測小鼠CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞動態(tài)變化情況及PPV和PCV2抗體水平。結(jié)果顯示：VP2. ORF2重組病毒樣顆粒免疫小鼠后能誘導(dǎo)較高水平的細(xì)胞免疫和高于同等條件普通疫苗和弱毒株的體液免疫水平。陳楊等[30]利用PCR技術(shù)從PPV SC1株基因組中擴(kuò)增VP2全基因，并將其插入真核表達(dá)載體pPI-2.EG-FP中，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pPI-2.EGFP. VP2。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將PRV SA215株DNA與pPI-2.EGFP.VP2 DNA共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，待出現(xiàn)細(xì)胞病變后收集病毒液。經(jīng)空斑純化，并同時采用檢測PPV VP2基因的PCR方法篩選獲得重組病毒PRV SA215/VP2株。以兔抗VP2的多克隆抗體建立的免疫熒光技術(shù)可檢測到Vero細(xì)胞發(fā)出的特異性熒光，表明PPV VP2成功插入到PRV SA215基因組中，并獲得表達(dá)。進(jìn)一步電鏡觀察表明，感染PRVSA215/VP2的Vero細(xì)胞中可同時觀察到PRV與PPV 2種病毒樣顆粒。結(jié)果表明，成功實現(xiàn)了利用PRV載體表達(dá)PPV VP2蛋白病毒樣顆粒，為進(jìn)一步研制PPV病毒樣顆粒疫苗奠定了基礎(chǔ)。

3 小結(jié)

PPV是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一，廣泛存在于世界各養(yǎng)豬場，造成的經(jīng)濟(jì)損失十分嚴(yán)重，因此，做好豬細(xì)小病毒病防控的研究相關(guān)工作非常重要。目前已經(jīng)建立了PPV多種分子生物檢測方法，如常規(guī)PCR方法、多重PCR方法、熒光定量PCR方法、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)、基因芯片等，但這些方法各有利弊，有時需將幾種檢測方法結(jié)合起來，綜合判斷，才能得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。當(dāng)前對豬細(xì)小病毒病的防控主要靠接種疫苗，傳統(tǒng)的滅活疫苗存在需要量大，作用時間短，需多次注射等缺點(diǎn)，弱毒株不易于儲存和運(yùn)輸，且存在毒力返強(qiáng)的危險。近年來，PPV新型疫苗研制已取得了很大的進(jìn)展，研制了一系列新型疫苗，如核酸疫苗、活載體疫苗，但核酸疫苗可能與宿主基因發(fā)生整介誘發(fā)癌變等，活病毒載體疫苗制備技術(shù)復(fù)雜，主要停留實驗室階段，并沒有大規(guī)模推廣應(yīng)用實際生產(chǎn)中，病毒樣顆粒疫苗具有高效的免疫原性，而且不存在散毒和基因重組的威脅，給PPV的免疫防控帶來了新的希望，成為各國研究的焦點(diǎn)。相信在不久的將來隨著病毒分子生物學(xué)的發(fā)展及對PPV蛋白功能研究的深入，必將研制出安全、高效、廉價、易于保存和運(yùn)輸?shù)男滦突蚬こ桃呙纭?/p>

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（編輯：郭玉翠）

S858.28

A

1002-1957(2016)03-0125-04

2015-12-09

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊項目（SDAIT-06-022-15）；山東省自然科學(xué)基金項目（ZR2013CQ006）；山東省自然科學(xué)基金青年基金項目（ZR2014CQ010）

李天芝（1985-），女，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事動物傳染病診斷研究.E-mail：517493935@qq.com