□ 王皛蕾 寧夏大學(xué) 劉敦華 寧夏食品檢測(cè)中心

高效液相色譜法測(cè)定油脂類保健食品中的維生素E

□ 王皛蕾 寧夏大學(xué) 劉敦華 寧夏食品檢測(cè)中心

維生素E為脂溶性維生素，其水解產(chǎn)物為生育酚，是體內(nèi)有效的抗氧化劑，其中以α-生育酚的生物效應(yīng)最高，具有促進(jìn)生育、抗衰老的作用，參與細(xì)胞DNA合成的調(diào)節(jié)，可提高免疫力和對(duì)抵抗力。維生素E缺乏可引起生殖障礙，肌肉、肝臟、骨髓和腦功能異常，紅細(xì)胞溶血和胚胎發(fā)生缺陷等。但維生素E在人體內(nèi)不能合成，需由食物攝人。

近年來，隨著生活水平的提高，人們保健意識(shí)不斷加強(qiáng)，目前已有8種具有維生素E活性的化合物從生物資源中分離出來，分別為D-α-、D-β-、D-γ-及δ-生育酚和D-α-、D-β-、D-γ-及δ-生育三烯酚。食品添加劑天然維生素E的α-生育酚在食品工業(yè)中可用作營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑、抗氧化劑；混合生育酚用作抗氧化劑，因此，在油類保健食品中一般添加混合生育酚作抗氧化劑。反相高效液相色譜法，綜合精密度、回收率、分析時(shí)間和實(shí)驗(yàn)安全性等方面考慮，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的前處理方法，建立了反相高效液相色譜法檢測(cè)油類保健食品中的D-α-生育酚，為該類保健食品制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

材料與方法

儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器：安捷倫高效液相色譜儀配DAD，分析天平。

材料：枸杞油膠丸，試劑與對(duì)照品，無(wú)水乙醇色譜純，抗壞血酸分析純，氫氧化鉀分析純，石油醚分析純，純化水，D-α-生育酚（純度99%）。

儀器條件

色譜柱：XDB C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；流速：1.7 mL/min；柱溫：20 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；波長(zhǎng)：300 nm；流動(dòng)相：A為甲醇，B為水；等度洗脫比例為（98+2）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備過程

1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

精確稱取D-α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品0.05 g置于50.0 mL棕色容量瓶，用無(wú)水乙醇定容，濃度1.0 mg/mL，儲(chǔ)備液于-20℃中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度校正

精確移取D-α-生育酚儲(chǔ)備液150 μL注入3.0 mL無(wú)水乙醇的比色皿中，以無(wú)水乙醇為空白，入射波長(zhǎng)為294 nm 測(cè)定其吸光度。校正公式：C0=A/E×100×3/V×10-3，其中，C0是維生素濃度，單位為 g/ mL；A是維生素的平均紫外吸光度；E是某維生素1%的比吸光系數(shù)；V是加入標(biāo)液的量，單位為 μL。

本實(shí)驗(yàn)中，D-α-生育酚比吸光系數(shù)為71，經(jīng)分光光度計(jì)校正D-α-生育酚儲(chǔ)備液濃度為987.7 μg/mL。

3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

分別取D-α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.5、0.75、1.0、1.5 mL和2.0 mL于10.0 mL容量瓶（A級(jí)），加無(wú)水乙醇定容到刻度，分別配制成49.39、74.08、98.77、148.16 μg/mL和197.54μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。

樣品前處理

稱取約1.0 g樣品于250 mL三角瓶中，稱取0.5 g抗壞血酸于50 mL棕色容量瓶中，依次加入5 mL水，30 mL無(wú)水乙醇使其完全溶解，將溶解后的抗壞血酸全部加入試樣中混勻，再加入10 mL氫氧化鉀溶液混勻，充入氮?dú)馀懦諝猓w上膠塞。放在恒溫磁力攪拌器上，水溫控制在（53±2）℃，皂化45 min后，取出冷卻至室溫。將皂化液全部轉(zhuǎn)入500 mL分液漏斗中，加入100 mL分析純石油醚，來回振搖，排氣，室溫下均勻震蕩10 min后靜置分層，將水相轉(zhuǎn)移另一分液漏斗中按上述方法進(jìn)行重復(fù)提取。合并有機(jī)相，用清水洗至中性。有機(jī)相通過無(wú)水硫酸鈉過濾脫水，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上在40 ℃的充氮條件下蒸發(fā)近干（不能完全蒸干），在40 ℃下氮吹儀上吹干。用50 mL無(wú)水乙醇溶解定容，過有機(jī)膜0.45 μm，上機(jī)測(cè)定。

結(jié)果與討論

樣品前處理方法的優(yōu)化

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法采用苯并[e]芘為內(nèi)標(biāo)，氫氧化鉀溶液皂化，乙醚提取，無(wú)水乙醇為溶劑，測(cè)定樣品的維生素E。但苯并[e]芘接觸毒性極大，強(qiáng)致癌物，因此為了實(shí)驗(yàn)人員的身體健康將乙醚試劑換為石油醚，內(nèi)標(biāo)法定量換為外標(biāo)法定量，以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法為準(zhǔn)并進(jìn)行了優(yōu)化改進(jìn)，適用于保健食品中維生素E的分析。

色譜條件的選擇

1 色譜柱的選擇

本實(shí)驗(yàn)選擇了250 mm的C18柱分離D-α-生育酚，實(shí)驗(yàn)表明300 mm的長(zhǎng)柱有良好的分離效果，能很好地分離D-α-生育酚和雜質(zhì)峰。

2 流動(dòng)相

本方法采用甲醇、水等度洗脫，讓目標(biāo)物得到有效地分離。

方法的線性范圍確認(rèn)

在實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，D-α-生育酚在49.39～197.54 μg/mL內(nèi)有良好的線性關(guān)系，r＞0.999 7。

方法的回收率

稱取10 份樣品,分別添加3.00 mL濃度為987.7 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。本方法回收率95.8%～101.1%，RSD為2.53%，說明該方法準(zhǔn)確度和精密度可滿足D-α-生育酚的檢測(cè)要求。

方法檢出限

以標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜響應(yīng)值計(jì)算，檢出限為91.8 ng，色譜峰的信噪比為SN=5.1＞3，能滿足樣品的測(cè)定需求。

不確定度評(píng)定

用液相色譜法測(cè)定保健食品中D-α-生育酚的含量，測(cè)定兩份樣品取其平均值報(bào)告結(jié)果，其結(jié)果和擴(kuò)展不確定度為（270.86±7.58）mg/100g，包含因子k=2，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為2.8%。

結(jié)論

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采用苯并[e]芘為內(nèi)標(biāo)，但苯并[e]芘毒性大，強(qiáng)致癌物，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員健康造成很大的危害，且內(nèi)標(biāo)含量極大，毒性強(qiáng)。本文方法操作簡(jiǎn)捷，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，安全環(huán)保，適用于含有油類的保健食品檢測(cè)混合生育酚。