金宇霆 李大偉 明雅南 張江 張明 夏強(qiáng)

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對(duì)乙酰氨基酚肝損傷時(shí)炎性因子、趨化因子以及Toll樣受體表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

金宇霆 李大偉 明雅南 張江 張明 夏強(qiáng)

【摘要】目的 研究對(duì)乙酰氨基酚（APAP）引起肝臟組織損傷過程中的炎性因子、趨化因子以及Toll樣受體的動(dòng)態(tài)變化。方法 隨機(jī)將30只小鼠分為6組：對(duì)照組、APAP1 h組、APAP3 h組、APAP6 h組、APAP12 h組，APAP24 h組，每組5只。禁食15 h后，對(duì)照組小鼠腹腔注射0.9％氯化鈉溶液，其余5組腹腔注射APAP300 Mg/kg誘發(fā)小鼠肝損傷。取各組小鼠肝臟組織采用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)炎性因子、趨化因子以及Toll樣受體的MRNA水平，HE染色觀察各組肝臟組織損傷情況。結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，24 h內(nèi)APAP誘發(fā)的小鼠肝損傷隨時(shí)間推移加重。IL-6、IL-10、IL-1β、IP-10 MRNA相對(duì)于對(duì)照組在不同時(shí)間點(diǎn)有不同程度升高；MIP-3α 24 h相較對(duì)照組明顯下降（P＜0.05）；IFN-γ和TNF-α各時(shí)間點(diǎn)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。趨化因CXCR-2和CCR-2在24 h與對(duì)照組比較明顯下降（P＜0.05）；CXCL-2分別在12 h 和24 h升高14.8倍（P＜0.05）和7.8倍（P＜0.05）。Toll樣受體TLR-9、TLR-4相對(duì)對(duì)照組在不同時(shí)間點(diǎn)亦有不同程度升高或降低。結(jié)論 對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)肝損傷后，肝組織炎性因子、趨化因子及Toll樣受體MRNA表達(dá)水平發(fā)生明顯改變。

【關(guān)鍵詞】對(duì)乙酰氨基酚；炎癥因子；趨化因子；Toll樣受體

治療劑量的對(duì)乙酰氨基酚（APAP）是一種安全有效的止痛和退燒藥物。但是，過量使用APAP能導(dǎo)致以肝小葉中央纖維化為特點(diǎn)的急性肝衰竭。近幾十年來，APAP引起的急性肝損傷已經(jīng)成為急性肝衰竭的主要原因［1］。APAP在肝細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過CYP450代謝轉(zhuǎn)化成N-乙酰-對(duì)苯醌亞胺（N-acetyl-p-benzoquinone Imine，NAPQI）。NAPQI可與胞內(nèi)親核物質(zhì)結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞核，產(chǎn)生肝細(xì)胞毒性［2］。正常情況下NAPQI通過結(jié)合谷胱甘肽解毒，所以谷胱甘肽耗竭在肝臟損傷進(jìn)展過程發(fā)揮重要的作用。有學(xué)者認(rèn)為，APAP誘導(dǎo)急性肝損傷的病理生理過程主要是代謝產(chǎn)物激活、谷胱甘肽消耗和蛋白結(jié)合［3］。APAP肝損傷與肝細(xì)胞線粒體功能障礙，自由基代謝產(chǎn)物增加以及氧化應(yīng)激等有密切關(guān)聯(lián)［4］。近年的研究發(fā)現(xiàn)，固有免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)在APAP誘導(dǎo)的肝損傷也起重要作用［5］。本研究觀察APAP誘導(dǎo)的肝損傷小鼠模型病理生理過程中炎性因子、趨化因子及Toll樣受體的動(dòng)態(tài)變化，為進(jìn)一步理解APAP肝損傷機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

資料和方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑及儀器

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性C57BL/6小鼠，鼠齡8～10周，體質(zhì)量20～25 g，無固定病原體級(jí)（SPF），購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠均于清潔環(huán)境下晝夜規(guī)律喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。

（二）試劑及儀器 APAP購自美國Sig ma公司；TLR-9、TLR-4、CXCL-2、CXCR-2、MIP-3a、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、CCR-2、IL-6、IL-10、IP-10引物購自日本Ta KaRa公司；SYBR購自日本Ta KaRa公司；TRIZOL購自美國Invitrogen公司；徠卡顯微鏡購自德國徠卡儀器有限公司；Minispin臺(tái)式高速離心機(jī)購自德國Eppendorf公司；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；微量加樣器購自德國Eppendorf公司。

二、動(dòng)物分組及模型的制備

采用隨機(jī)數(shù)表法將30只小鼠，每組5只，分為6組：對(duì)照組、APAP1 h組、APAP3 h組、APAP6 h組、APAP12 h組，APAP24 h組。所有小鼠注射APAP溶液之前禁食15 h。實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射對(duì)乙酰氨基酚溶液300 Mg/kg，對(duì)照組小鼠腹腔注射0.9％氯化鈉溶液，注射對(duì)乙酰氨基酚溶液后恢復(fù)正常食物供應(yīng)。

三、檢測(cè)指標(biāo)

（一）小鼠肝臟炎性因子、趨化因子和Toll樣受體MRNA肝臟RNA提取及實(shí)時(shí)定量（qRT）PCR分析MRNA表達(dá)水平?？俁NA根據(jù)制造商提供的步驟用Trizol（購自美國Invitrogen）法提取。所提取的總RNA用分離光度計(jì)測(cè)定RNA在260 nm處的吸光度，以A260 nm/A280 nm評(píng)估提取的總RNA的濃度和質(zhì)量。選取A260 nm/A280 nm在1.9～2.0之間的樣品用于qRT-PCR分析。然后將所提RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。qRT-PCR用20μL體系包括cDNA，SYBRGreen PCR混合液（購自日本Takara公司）水及引物（購自上海皓嘉生物公司），反應(yīng)條件為95℃，酶活化15 min；95℃變性15 s，60℃退火延伸1 min，一共40個(gè)循環(huán)。

（二）小鼠肝組織HE染色 小鼠肝臟組織取肝左外葉和右外葉，用體積分?jǐn)?shù)為0.04甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片（厚5μm），HE染色，于顯微鏡下觀察肝組織病理改變。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS軟件（19.0版）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，組間均數(shù)的比較采用方差分析（ANOVA）或者Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，并使用Dunnett t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　果

一、APAP肝損傷組織病理形態(tài)學(xué)影響

給予APAP后不同時(shí)間點(diǎn)肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果如圖1所示。隨著時(shí)間推移，肝組織壞死情況逐漸加重，SUZUKI評(píng)分增高。對(duì)照組：肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝細(xì)胞未見變性、壞死；APAP1 h組：肝小葉結(jié)構(gòu)尚清楚，可見中央靜脈周圍少量肝細(xì)胞胞質(zhì)氣球樣變；APAP3 h組：肝小葉結(jié)構(gòu)尚可見，可見點(diǎn)片狀壞死，肝細(xì)胞氣球樣變明顯增加，肝竇充血可見；APAP6 h組：肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，可見較大面積細(xì)胞壞死，大量肝細(xì)胞水腫及炎性細(xì)胞浸潤改變；APAP12 h組：肝小葉結(jié)構(gòu)不完整，大片狀細(xì)胞壞死，肝竇充血明顯；APAP24 h組：肝小葉結(jié)構(gòu)明顯破壞，大面積細(xì)胞壞死，明顯炎性細(xì)胞浸潤。

二、APAP肝損傷肝組織中Toll樣受體MRNA水平變化

由圖2 A可見，與對(duì)照組相比，APAP300 Mg/kg誘導(dǎo)的肝損傷組織TLR-9 MRNA在1 h升高4.6倍（P＜0.05），之后開始下降，在3 h降到2.6倍（P＜0.05），并于6 h恢復(fù)正常水平。TLR-4（圖2B）在3 h降到對(duì)照組的25％（P＜0.05），直至24 h尚未恢復(fù)正常水平。

三、APAP肝損傷肝組織中趨化因子MRNA水平變化

IP-10（圖2 C）在6 h開始升高至對(duì)照組的13.5倍（P＜0.05），12 h為4.3倍（P＜0.05），并于24 h恢復(fù)正常。CXCL-2（圖2 D）表達(dá)水平與對(duì)照組相比，在前6 h變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，于12 h和24 h分別升高14.8倍（P＜0.05）和7.8倍（P＜0.05）。CXCR-2（圖2 E）表達(dá)水平在24 h降至對(duì)照組的39％（P＜0.05），24 h前表達(dá)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CCR-2（圖2F）表達(dá)水平與對(duì)照組比較，3 h降到30％（P＜0.05），且3 h至24 hCCR-2表達(dá)變化程度組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

四、APAP肝損傷肝組織中炎性因子MRNA水平變化

IL-6（圖3 A）3 h表達(dá)水平相較于對(duì)照組升高2.6倍（P＜0.05），其他時(shí)間點(diǎn)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-10（圖3B）跟對(duì)照組相比，在1 h、3 h、6 h分別升高2.5倍、2.4倍、2.1倍（P＜0.05），12 h恢復(fù)正常水平，24 h降至52％（P＜0.5）。由圖3 C可見，IL-1β表達(dá)水平1 h升高2倍（P＜0.05），其他時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組相比，MIP-3α（圖3F）24 h表達(dá)水平下降至23％（P＜0.05），其他時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TNF-α（圖3 D）與IFN-γ（圖3 E）相較于對(duì)照組，在各時(shí)間點(diǎn)的變化皆差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討　論

APAP誘導(dǎo)小鼠肝損傷與臨床肝損傷病理過程極為相似，本實(shí)驗(yàn)通過各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的肝臟HE染色來觀察24 h內(nèi)APAP誘導(dǎo)肝損傷進(jìn)展情況，并采用qRT-PCR檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)肝臟組織的炎性因子、趨化因子及Toll樣受體MRNA表達(dá)水平的變化，以研究APAP肝損傷病理過程固有免疫所發(fā)揮的作用。

圖1　對(duì)乙酰氨基酚作用不同時(shí)間對(duì)肝組織的影響

圖2　Toll樣受體和趨化因子MRNA相對(duì)表達(dá)量

目前認(rèn)為，無菌性炎性反應(yīng)和固有免疫細(xì)胞參與APAP誘導(dǎo)的肝損傷和修復(fù)，而相較肝臟缺血再灌注損傷、梗阻性膽汁淤積和內(nèi)毒素血癥的病理生理過程，炎性細(xì)胞對(duì)APAP肝毒性的作用是矛盾的。APAP肝毒性反應(yīng)被認(rèn)為最初是由NAPQI啟動(dòng)。超劑量應(yīng)用APAP時(shí)，人體內(nèi)葡萄糖醛酸化和硫酸鹽化作用負(fù)載過重，且谷胱甘肽過度消耗，過量的NAPQI共價(jià)結(jié)合半胱氨酸家族形成APAP蛋白加合物，激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致線粒體功能失調(diào)和DNA損傷，最后介導(dǎo)肝細(xì)胞壞死。谷胱甘肽和共價(jià)結(jié)合是APAP肝毒性的先決條件。然而，肝損傷的嚴(yán)重程度卻取決于下游的炎性細(xì)胞因子釋放。APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞壞死可激活固有免疫細(xì)胞及募集炎性細(xì)胞，而固有免疫細(xì)胞釋放的炎性介質(zhì)，如炎性因子、趨化因子、氧自由基等，參與肝臟損傷的進(jìn)展。

圖3　炎性因子MRNA相對(duì)表達(dá)量

庫普弗細(xì)胞是定位于肝臟的具有噬菌作用的巨噬細(xì)胞，具有多重功能，如吞噬作用、內(nèi)吞作用、免疫調(diào)節(jié)作用、合成和分泌各種生物活性介質(zhì)。研究表明［6］，TLR-4基因敲除的小鼠對(duì)APAP肝毒性更加敏感。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TLR-4 MRNA水平在APAP腹腔注射后3 h，下降到對(duì)照組的25％，直至24 h未恢復(fù)正常。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)TLR-9在1 h就開始明顯升高，6 h才恢復(fù)正常水平。TLR-9可被APAP肝損傷的壞死細(xì)胞產(chǎn)生的DNA激活，協(xié)同Nalp3促進(jìn)IL-1β生成。而IL-1β則是一種非常重要的促炎性因子，本實(shí)驗(yàn)中IL-1β在1 h升高了2倍，說明IL-1β參與APAP肝損傷早期的炎性反應(yīng)。

有文獻(xiàn)表明［7］，IFN-γ基因敲除小鼠對(duì)APAP肝毒性敏感性明顯降低。APAP誘導(dǎo)肝損傷情況下庫普弗細(xì)胞激活產(chǎn)生的TNF-α表達(dá)量升高［5，7］。然而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IFN-γ和TNF-α在APAP誘導(dǎo)肝損傷肝組織的MRNA表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-6和IL-10對(duì)APAP引起的肝損傷有明顯的保護(hù)作用。Masubuchi等［8］研究發(fā)現(xiàn)，IL-6基因敲除的小鼠肝細(xì)胞內(nèi)的熱休克蛋白缺乏，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)APAP肝毒性更加敏感。本研究結(jié)果表明，IL-6和IL-10 MRNA分別在APAP誘導(dǎo)肝損傷后3 h和1 h開始升高，與文獻(xiàn)報(bào)道較為一致［9］。趨化因子募集炎性細(xì)胞，參與APAP肝臟毒性過程，MCP-1、MIP-1α、MIP-2及IP-10在應(yīng)用APAP的動(dòng)物模型的肝臟組織明顯上調(diào)表達(dá)［10］。趨化因子對(duì)于APAP肝損傷的作用充滿爭議，一些學(xué)者認(rèn)為趨化因子通過增強(qiáng)炎性細(xì)胞遷移促進(jìn)肝損傷，然而也有部分研究認(rèn)為趨化因子具有對(duì)抗肝損傷的作用，這類保護(hù)作用依靠浸潤的炎性細(xì)胞釋放抗炎細(xì)胞因子以及直接刺激肝細(xì)胞增生實(shí)現(xiàn)。趨化因子CCR-2，CXCR-2保護(hù)APAP肝損傷，CCR-2是MCP-1的受體，小鼠敲除CCR-2基因后，APAP肝毒性損傷加重，且與損傷相關(guān)的肝臟IFN-γ和TNF-α表達(dá)升高［11，12］。本研究結(jié)果顯示，CXCL-2相對(duì)于對(duì)照組在12 h和24 h分別升高14.8倍和7.8倍，CCR-2和CXCR-2則是在各自時(shí)間點(diǎn)有不同程度下降。

APAP誘導(dǎo)肝臟毒性反應(yīng)是個(gè)非常復(fù)雜的過程，多種細(xì)胞及生物活性物質(zhì)參與其中。固有免疫系統(tǒng)對(duì)于APAP肝損傷是重要的參與者。本研究討論了炎性因子、趨化因子和Toll樣受體在APAP肝損傷病理生理過程的動(dòng)態(tài)變化，證實(shí)了固有免疫系統(tǒng)在APAP肝損傷的重要作用，為進(jìn)一步研究固有免疫與APAP肝損傷之間的聯(lián)系以及闡明APAP肝損傷的具體機(jī)制提供借鑒。

參 考 文 獻(xiàn)

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（本文編輯：錢燕）

·臨床與基礎(chǔ)研究·

Dynamic variation of inflam matory cytokines，chemokines and Toll-like receptors in APAP-induced liver injury

JINYu-ting，LIDa-wei，MINGYa-nan，ZHANGJiang，ZHANGMing，XIAQiang. Department of Liver Surgery，RenJi Hospital，ShanghaiJiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200127，China

【Abstract】Objective To explore the dynamic changes ofinflam matory cytokines，chem okines and Toll-like receptors （TLR）in acetaminophen（APAP）-induced liver injury within 24 hours. Methods C57BL/6 mice were rando mly divided into six groups：control group，APAP1h group，APAP3h group，APAP6h group，APAP12h group and APAP24h group，including 5 mice in each group. After fasting for 15 hours，control group were given 0.9％saline by intraperitoneal injection，w hile other groups were given 300 Mg/kg APAP. Assessment of the various inflam matory cytokines，chem okines and TLRin mice liver was carried out at MRNAlevel by realtime poly merase chain reaction（RT-PCR）. Degrees of APAP-induced liver injury were evaluated by haematoxylin eosin（HE）staining. Results According to HEstaining result，APAP-induced liver injury in APAPgroups increasingly aggravated within 24 hours w hen compared with that in control group.In APAPgroups，RT-PCRindicated that MRNAlevels of IL-6，IL-10，IL-1βand IP-10 rose to various degrees at different time points，w hile MIP-3α MRNAlevels declined distinctly（P＜0.05），w hich was in contrast to control group. Additionally，variation ofinterferon（IFN）-γ and tu Mor necrosis factor（TNF）-α had no statistical difference between APAPand control groups.In APAPgroups，levels of CXCR-2 and CCR-2 were obviously lower at 24h（P＜0.05）than those in control group，w hile level of CXCL-2 rose to 14.8 and 7.8 times higher at 12h and 24h（P＜0.05），respectively. Furtherm ore，levels of TLR-9 and TLR-4 changed to various extents at different time points（P＜0.05）. Conclusion APAPfor 300 Mg/kg induces mice liver injury within 24h，w hich makes inflam matory cytokines，chem okines and TLRchange obviously at MRNAlevels in mice liver.

【Key words】Acetaminophen；Cytokine；Chem okine；Toll-like receptor

收稿日期：（2015-08-31）

Corresponding author：XIAQiang，Email：xiaqiang@medmail.com.cn

通信作者：夏強(qiáng)，Email：xiaqiang@med mail.com.cn

基金項(xiàng)目：國家自然基金項(xiàng)目（81472243）；上海市衛(wèi)生局重點(diǎn)聯(lián)合攻關(guān)項(xiàng)目（2013ZYJB001）

作者單位：200127 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院肝臟外科（金宇霆，李大偉，張江，張明，夏強(qiáng)）；消化內(nèi)科（明雅南）