李金霞 穆凌云 張秋云 等

摘要：目的 動態(tài)觀察截斷逆挽方對慢加急性肝衰竭（ACLF）大鼠線粒體凋亡途徑的影響，探討其作用機制。方法 SPF級Wistar大鼠隨機分為正常組、模型組和截斷逆挽方組，豬血清腹腔注射13周聯(lián)合D-氨基半乳糖、脂多糖急性攻擊建立ACLF模型。截斷逆挽方組在急性攻擊前予截斷逆挽方灌胃3 d。各組大鼠于急性攻擊后4、8、12 h平行取材。電鏡觀察肝細胞超微結構，免疫組化檢測肝組織細胞色素C（Cyt C）表達，Western blot檢測肝組織Bid蛋白表達。結果 與正常組比較，模型組4、8 h Cyt C和Bid表達量增加、12 h表達量減少（P<0.05）；與模型組比較，截斷逆挽方組4、8 h Cyt C和Bid表達量減少、12 h表達量增加（P<0.05）。電鏡觀察顯示，模型組大鼠肝細胞超微結構嚴重破壞，且程度逐漸加深，而各時間點截斷逆挽方組大鼠肝細胞超微結構損傷程度較模型組均有所減輕。結論 截斷逆挽方可有效降低ACLF大鼠肝細胞的損傷程度，其作用機制可能與阻斷肝細胞線粒體凋亡途徑有關。

關鍵詞：慢加急性肝衰竭；截斷逆挽方；線粒體；凋亡；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.012

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）04-0045-04

Effects of Jieduan Niwan Formula on Mitochondrial Apoptotic Pathway in Acute-on-Chronic Liver Failure Rats LI Jin-xia1， MU Ling-yun1， ZHANG Qiu-yun1， CHEN Yu2， GAO Lian-yin1， DU Yu-qiong1 （1. School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing Key Laboratory of TCM Collateral Disease Theory Research， Beijing 100069， China； 2. Artificial Liver Center， Beijing You An Hospital， Capital Medical University， Beijing 100069， China）

Abstract： Objective To dynamically observe the effects of Jieduan Niwan Formula on mitochondrial apoptotic pathway in acute-on-chronic liver failure （ACLF） rats； To further reveal the possible mechanism of Jieduan Niwan Formula. Methods SPF Wistar rats were randomly divided into normal group， model group and Jieduan Niwan group. 13-week porcine serum injection followed with D-galactosamine and lipopolysaccharide joint acute attack was used to established ACLF model in all rats except for normal group. Rats in Jieduan Niwan group were orally given Jieduan Niwan Formula for 3 days before acute attack. Rats were sacrificed respectively at 4， 8 and 12 h after models were established. The expressions of Bid， Cytochrome C （Cyt C） and hepatocyte ultrastructure were detected by Western blot method， immunohistochemical analysis and transmission electron microscope， respectively. Results Compared with normal group， the levels of Cyt C and Bid in model group increased at 4 h and peaked at 8 h but decreased at 12 h （P<0.05）； however， the levels of Cyt C and Bid in Jieduan Niwan group were lower than those in model group at 4 and 8 h but higher at 12 h （P<0.05）. The ultrastructures were significantly damaged in model rats， which severity was escalated through time； in Jieduan Niwan group， the degree of injury decreased at each timing. Conclusion Jieduan Niwan Formula can efficiently alleviate the hepatocyte damage in ACLF rats， and the mechanism might be involved in the inhibition of the mitochondrial apoptotic pathway.

Key words： acute-on-chronic liver failure； Jieduan Niwan Formula； mitochondrion； apoptosis； rats

ACLF）是我國重大疾病重點研究對象之一，有進展迅速、病死率較高的特點，目前尚缺乏有效的預防和治療措施[1]。肝細胞凋亡是ACLF的重要發(fā)病機制之一，研究表明，線粒體在細胞凋亡過程中扮演著極為重要的角色[2]。截斷逆挽方是全國名老中醫(yī)藥專家錢英教授治療ACLF的經(jīng)驗方，前期臨床觀察已顯示其有效性，實驗研究也表明其能降低ACLF模型大鼠死亡率、改善肝組織病理損傷并減少肝細胞凋亡[3-6]。本研究通過動態(tài)觀察截斷逆挽方對ACLF大鼠肝組織Bid、細胞色素C（cytochrome C，Cyt C）表達量及肝細胞超微結構的影響，進一步探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

雄性SPF級Wistar大鼠49只，鼠齡45 d，體質(zhì)量180～200 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學實驗動物部，自由飲食，溫度（21±3）℃，濕度（50.2±2.0）%，12 h/12 h晝夜交替。

1.2 藥物

截斷逆挽方由苦味葉下珠30 g、瓜蔞30 g、金錢草30 g、生黃芪30 g、桑寄生30 g、三七6 g、生地黃20 g、莪術6 g、丹參20 g、黑附片15 g組成，飲片均購自北京同仁堂藥店，水煎濃縮成4.34 g/mL，4 ℃保存，使用前37 ℃水浴加熱。

1.3 主要試劑與儀器

D-氨基半乳糖（D-GalN），Inalco，P29/14/221；脂多糖（LPS），Sigma，109K4075；豬血清，北京平睿生物有限公司，20140713；Anti-Bid Antibody，Santa Cruz，J1413；Anti-Cyt C Antibody，CST，20140306；Anti-β-actin Antibody，CST，20140907。Eclipse 80i共聚焦熒光顯微鏡（Nikon），Universal 320R低溫離心機（Hettich），1-14高速離心機（Sigma），F(xiàn)6/10超細勻漿器（Fluko），Model680酶標儀（Bio-Rad），165-8003垂直電泳儀（Bio-Rad），170-3930濕轉電轉儀（Bio-Rad），Odysseey2.1紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（LI-COR），JEM-1400高襯度投射電子顯微鏡（JEOL）。

2 實驗方法

2.1 造模、分組及給藥

49只大鼠隨機分為正常組6只和造模組43只，造模組大鼠腹腔注射豬血清0.5 mL/（次·只），每周2次，共13周。正常組大鼠注射等量生理鹽水。于13周末造模組隨機抽取1只大鼠處死，取肝組織進行病理觀察，根據(jù)《肝纖維化中西醫(yī)結合診療指南》[7]判定免疫型肝纖維化造模是否成功。將成模大鼠隨機分為模型組和截斷逆挽方組（中藥組），每組21只。中藥組給予截斷逆挽方4.34 g/mL濃縮液21.7 g/（kg·d）灌胃，連續(xù)3 d，正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。灌胃處理后，3組同時給予D-GalN 800 mg/kg聯(lián)合LPS 100 μg/kg腹腔注射造成急性攻擊，建立ACLF模型。各組大鼠分別于急性攻擊4、8、12 h后進行平行取材，各組每個時間點取3只。大鼠麻醉后腹主動脈取血，摘取肝右葉同一部分置于10%福爾馬林溶液固定，摘取相同部位乳頭葉，切成1 mm3大小組織塊，置于2.5%戊二醛中固定，余下部分于液氮中快速凍存。

2.2 免疫組化檢測肝組織細胞色素C蛋白表達

10%福爾馬林固定肝組織后進行石蠟包埋、切片，常規(guī)脫蠟、水化，微波抗原修復，10%正常羊血清封閉1 h，Cyt C單克隆抗體（1∶200）4 ℃過夜孵育，PBS洗滌后滴加HRP標記二抗37 ℃孵育1 h，DAB顯色80 s，蘇木素復染。各組每個時間點觀察3張切片，隨機選取10個高倍視野進行拍攝，并應用NIKON NIS-Elements BR軟件進行陽性表達的標示及積分光密度（IOD）值檢測。

2.3 Western blot檢測肝組織Bid蛋白表達

各組每個時間點取5只進行勻漿、抽提總蛋白，按蛋白定量試劑盒說明測定提取液蛋白濃度。每例上樣蛋白84 μg，經(jīng)12%聚丙烯凝膠電泳分離后300 mA電轉1 h至0.22 μm NC膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，根據(jù)所需分子量剪開膜后，分別予以β-actin抗體（1∶1000）、Bid抗體（1∶200）4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后加二抗（1∶5000）室溫孵育1 h，紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃膜。應用ImageJ2x 2.1.4.7軟件檢測蛋白條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參對照，以目的蛋白灰度值÷內(nèi)參蛋白灰度值計算Bid蛋白的相對表達量。

2.4 透射電鏡觀察肝細胞及線粒體超微結構

肝臟標本經(jīng)由2.5%戊二醛及1%餓酸固定，經(jīng)乙醇、丙酮脫水后，環(huán)氧樹脂包埋、切片，飽和醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察肝細胞及線粒體超微結構并拍照。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，方差齊時用LSD檢驗，方差不齊用Tamhane's T2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 截斷逆挽方對模型大鼠肝組織細胞色素C蛋白表達的影響

Cyt C蛋白被染成棕褐色，在細胞質(zhì)表達。與正常組比較，模型組4 h Cyt C表達量明顯增加，且隨時間延長其表達逐漸增加，至8 h達到高峰，而12 h表達量則較前降低（P<0.01）；與模型組比較，中藥組4、8 h Cyt C蛋白表達量明顯降低（P<0.01），而至12 h其表達量則略高于模型組，其表達量隨時間的推移呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。結果見表1、圖1。

4.2 截斷逆挽方對模型大鼠肝組織Bid蛋白表達的影響

各組大鼠肝組織Bid蛋白表達的趨勢與Cyt C蛋白表達基本相同。與正常組比較，模型組4 h時Bid蛋白表達量增加，至8 h達到高峰（P<0.05），至12 h表達量較前則降低；與模型組比較，中藥組4、8 h Bid蛋白表達量降低，而12 h表達量則高于模型組（P<0.05），整體呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。結果見表2、圖2。

4.3 截斷逆挽方對模型大鼠肝細胞及線粒體超微結構的影響

正常組大鼠肝細胞胞膜完整，胞質(zhì)均勻，細胞核圓且居中，核仁明顯，胞質(zhì)內(nèi)可見豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；線粒體形態(tài)多為圓形，大小為0.4～0.8 μm，嵴及雙層膜結構完整。模型組4 h大鼠肝細胞腫脹，核染色質(zhì)凝聚，可見大小不等的類圓形包涵體，脂滴增多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒；線粒體增多、聚集，呈啞鈴樣改變，電子密度增高，嵴內(nèi)腔擴張，嵴斷裂。模型組8 h可見核變形，染色質(zhì)邊集，胞質(zhì)空淡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，部分細胞內(nèi)細胞器濃縮，形成高電子密度粗顆粒樣凋亡小體，周圍有空暈環(huán)繞；線粒體腫脹、聚集，基質(zhì)中空，嵴亂而減少，并有膜包繞。模型組12 h肝細胞核皺縮呈不規(guī)則形或破裂，質(zhì)膜破壞中斷，Kupffer細胞侵入壞死細胞內(nèi)吞噬凋亡小體，糖原增多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基復合體膜斷裂，產(chǎn)生大量髓鞘樣結構；線粒體皺縮、空泡化，外膜破裂。較相對應時間點模型組，中藥組肝細胞超微結構損害較輕，肝細胞核變形不明顯，細胞基質(zhì)尚存，至急性攻擊后12 h，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張脫顆粒，但尚未降解，凋亡小體形成較少，炎性細胞浸潤情況較輕，線粒體腫脹變形，但尚可見到一定的嵴，雙層膜結構完整。見圖3、圖4。

5 討論

肝細胞凋亡是ACLF的重要發(fā)病機制之一，其主要由2條途徑介導，即死亡受體途徑和線粒體途徑[8]。前期研究結果顯示，截斷逆挽方能有效降低ACLF大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量及肝組織中caspase3、caspase8表達量，從而阻斷死亡受體途徑，減少肝細胞凋亡率，保護肝臟[3-6]。

有研究表明，線粒體是調(diào)控細胞凋亡的中心，近年來對細胞凋亡的研究已從聚焦細胞核的改變轉向對線粒體呼吸鏈變化的研究。線粒體能夠感受到細胞凋亡的信號，導致線粒體膜通透性改變（mitochondrial permeability transition，MPT），從而向細胞質(zhì)中釋放以Cyt C為主的多種凋亡誘導因子，在ATP介導下引起caspase家族級聯(lián)反應，最終導致凋亡發(fā)生，因此Cyt C是線粒體啟動凋亡程序的關鍵物質(zhì)[8]。Cyt C的釋放受Bcl-2家族蛋白的調(diào)節(jié)，目前已發(fā)現(xiàn)的Bcl-2蛋白家族可分為抗凋亡（Bcl-2、Bcl-XL等）和促凋亡（Bax、Bad、Bid等）兩大家族，其中Bid蛋白是近來研究的熱點，Bid前體在caspase-8的激活下，形成截斷的Bid（truncated Bid，tBid），tBid轉位到線粒體，從而觸發(fā)Cyt C的釋放[9]。另有研究表明，線粒體途徑和死亡受體途徑還可以通過Bid蛋白連接起來，放大凋亡信號[10]。

本實驗結果顯示，模型組4～8 h Cyt C、Bid表達逐漸增加，提示線粒體途徑的凋亡活動逐漸增多，并在8 h時達到高峰，而至12 h，Cyt C、Bid表達量呈降低的趨勢，考慮此時肝細胞大量死亡，凋亡活動亦隨之減少。經(jīng)截斷逆挽方干預大鼠4、8 h，Cyt C和Bid表達量較模型組有所降低，且其表達量4～12 h呈逐漸增加的趨勢，并不存在一個上升又回落的過程，這提示我們截斷逆挽方在抑制ACLF大鼠肝細胞線粒體途徑細胞凋亡的同時又延緩了肝細胞死亡的過程。另外，通過電鏡觀察可以直觀看到，模型組大鼠肝細胞超微結構遭到了嚴重的破壞，隨時間的延長損傷程度逐漸加深，至12 h可見大量細胞凋亡壞死及炎性細胞浸潤，而各時間點中藥組大鼠肝細胞超微結構損傷程度較模型組均有所減輕，這種保護機制可能與阻斷線粒體途徑細胞凋亡有關。凋亡細胞的典型形態(tài)變化多有報道，但與凋亡有關的線粒體超微結構變化的報道相對較少。在本實驗中，線粒體改變主要特征是腫脹，并伴有嵴斷裂或消失，腫脹嚴重者成空泡化且外膜破裂，尤其在8 h其線粒體腫脹最為明顯，而此時Cyt C及Bid表達最多，線粒體途徑的凋亡活動最為活躍，由此推斷，這種腫脹可能與MPT直接相關，可能有利于線粒體內(nèi)外的物質(zhì)和離子交換。而經(jīng)截斷逆挽方干預，大鼠線粒體腫脹及嵴斷裂消失程度均有所減輕，意味著ACLF肝細胞凋亡過程中線粒體超微結構的變化與凋亡發(fā)生發(fā)展可能存在一定的相關性。

綜上所述，截斷逆挽方可有效減輕ACLF大鼠肝細胞的損傷程度，其作用機制可能與阻斷肝細胞線粒體凋亡途徑有關。

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