倪英群 方朝暉

摘要：目的 觀察不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)聯(lián)合中藥對(duì)葡萄糖耐量減退（IGT）大鼠過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α（PGC-1α）的表達(dá)及血管內(nèi)皮功能的影響，探討不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)與中藥聯(lián)合的協(xié)同作用及其機(jī)制。方法 健康雄性SD大鼠70只，隨機(jī)取10只為空白組予以常規(guī)飼料喂養(yǎng)，其余60只大鼠予以高糖高脂飼料喂養(yǎng)進(jìn)行造模。將成模大鼠隨機(jī)分為模型組、單純中藥組（中藥組）、低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)+中藥組（低強(qiáng)度組）、中強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)+中藥組（中強(qiáng)度組）、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)+中藥組（高強(qiáng)度組），每組10只?？瞻捉M、模型組、中藥組每日自由活動(dòng)，運(yùn)動(dòng)各組進(jìn)行不同強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，同時(shí)給予丹蛭降糖膠囊灌胃。比較干預(yù)前后一氧化氮（NO）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、血管性假血友病因子（vWF）和血漿內(nèi)皮微粒（EMP）變化；檢測(cè)各組PGC-1α水平。結(jié)果 與空白組比較，模型組NO、eNOS、PGC-1α水平下降，vWF、EMP水平升高（P<0.05）；與模型組比較，各干預(yù)組NO、eNOS、PGC-1α水平升高，vWF、EMP水平降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)聯(lián)合丹蛭降糖膠囊能有效改善血管內(nèi)皮功能。

關(guān)鍵詞：不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)；葡萄糖耐量減退；過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α；中藥；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.014

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）04-0054-04

Effects of Sports with Different Strength Combined with Traditional Chinese Medicine on Function of Vascular Endothelium of IGT Rats NI Ying-qun， FANG Zhao-hui （National Diabetic Base of Clinical Research of Chinese Medical Science， First Affiliated Hospital of Anhui University of TCM， Hefei 230031， China）

Abstract： Objective To observe the effects of sports with different strength combined with traditional Chinese medicine on expression of PGC-1α and function of vascular endothelium of IGT rats； To discuss the synergistic action and its mechanism. Methods Seventy healthy male SD rats were randomly divided into blank group （10 rats）， which were given regular diet， and the other 60 rats were given high-glucose and high-lipoid diet to establish the IGT model rats， which were then randomly divided into 5 groups， including IGT model group （model group）， simple Chinese medicine group （Chinese medicine group）， low strength sports+Chinese medicine （low strength group）， middle strength+Chinese medicine （middle strength group）， and high strength sports+Chinese medicine groups （high strength group）， 10 rats in each group. Rats in blank group， model group and Chinese medicine group exercised freely. While rats in different sport strength groups conducted treadmill exercise with different strength， and were given Danzhi Jiangtang Capsules for gavage. Changes of NO， eNOS， vWF and EMP before and after the treatment were compared， the PGC-1α level was detected. Results Compared with the blank group， levels of NO， eNOS and PGC-1α decreased， while the levels of vWF and EMP increased in model group （P<0.05）. Compared with the model group， levels of NO， eNOS and PGC-1α increased in all treatment groups， while the levels of vWF and EMP decreased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Middle strength sports combined with Danzhi Jiangtang Capsules may effectively improve function of vascular endothelium.

Key words： sports with different strength； glucose tolerance subsiding； PGC-1α； traditional Chinese medicine； rats

基金項(xiàng)目：國家科技重大專項(xiàng)-重大新藥創(chuàng)制（2010ZX09102）；國家中醫(yī)臨床研究基地業(yè)務(wù)建設(shè)科研專項(xiàng)（JDZX201201）；國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科（20091221）；國家中醫(yī)藥管理局國家基本公共衛(wèi)生服務(wù)項(xiàng)目（20131012）；安徽省教育廳高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目（KJ2015A136）

糖尿病是臨床常見的內(nèi)分泌代謝紊亂癥，以血管內(nèi)皮損傷為基礎(chǔ)的并發(fā)癥給患者帶來諸多危害。有研究表明，在糖尿病早期糖耐量受損（IGT）階段血管內(nèi)皮功能就已處于失調(diào)狀態(tài)[1-2]。過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α（PGC-1α）在線粒體生物合成過程中起重要作用，影響細(xì)胞的能量代謝及細(xì)胞凋亡，在血管重建及胰島素抵抗等方面具有調(diào)節(jié)作用。前期研究表明，運(yùn)動(dòng)聯(lián)合丹蛭降糖膠囊可對(duì)抗氧化應(yīng)激，改善胰島功能[3]。本實(shí)驗(yàn)以IGT大鼠為研究對(duì)象，觀察丹蛭降糖膠囊聯(lián)合不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)干預(yù)下PGC-1α的表達(dá)及血清一氧化氮（NO）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、血管性假血友病因子（vWF）水平、血漿內(nèi)皮微粒（EMP）的變化，探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)健康雄性SD大鼠70只，4～5周齡，體質(zhì)量140～160 g，安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK（皖）2012-001。室溫（23±2）℃、濕度40%～60%，晝夜明暗12 h/12 h交替，自由飲水，分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥物

丹蛭降糖膠囊由太子參、生地黃、牡丹皮、菟絲子、澤瀉、水蛭等組成，安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)20140526，每粒含原藥材0.5 g。

1.3 主要試劑與儀器

NO、NOS測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；vWF測(cè)定試劑盒，上海軒吳科技公司；EMP抗體，美國BCI公司；PGC-1α試劑盒，美國ADL公司。

Teacan Infinite M200酶標(biāo)儀、洗板機(jī)wellwash4MK-2（芬蘭），流式細(xì)胞儀（美國BD公司），PCR儀（美國Bio-RAD），凝膠成像分析系統(tǒng)（美國SYNGENE）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模和分組

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取10只為空白組，予以常規(guī)飼料（13.4 kJ/g）喂養(yǎng)，其余60只大鼠予以高糖高脂飼料（21.8 kJ/g）喂養(yǎng)。12周時(shí)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT），禁食8 h鼠尾采血測(cè)空腹血糖（FBG），50%葡萄糖注射液2 g/kg灌胃，2 h后再次鼠尾采血測(cè)餐后2 h血糖（2 h PG），以7.8 mmol/L≤2 h PG<11.1 mmol/L并持續(xù)1周以上為IGT造模成功，實(shí)際成模50只。將成模大鼠隨機(jī)分為模型組、單純中藥組（中藥組）、低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)+中藥組（低強(qiáng)度組）、中強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)+中藥組（中強(qiáng)度組）、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)+中藥組（高強(qiáng)度組），每組10只。由于高血糖、運(yùn)動(dòng)等原因造成實(shí)驗(yàn)中大鼠少量死亡及丟失，最終空白組10只、模型組8只、中藥組9只、低強(qiáng)度組9只、中強(qiáng)度組10只、高強(qiáng)度組9只。

2.2 給藥

空白組、模型組和中藥組每日自由活動(dòng)；中藥組予丹蛭降糖藥液灌胃，給藥劑量按臨床成人劑量的12倍即1.08 g/kg灌胃，每日1次；運(yùn)動(dòng)各組大鼠每日10 m/min×10 min適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練。正式治療開始后，負(fù)荷強(qiáng)度依據(jù)Bedford等[4]推薦，即低強(qiáng)度組跑速為10 m/min（約30%VO2max），坡度為0°；中強(qiáng)度組為15 m/min（約50%VO2max），初始跑速為12 m/min，持續(xù)30 min，坡度為0°，以后運(yùn)動(dòng)坡度為5°，每隔1 d速度增加1 m/min，運(yùn)動(dòng)時(shí)間增加10 min，直至增至15 m/min，時(shí)間為1 h；高強(qiáng)度組為20 m/min（約70%VO2max），初始跑速為15 m/min持續(xù)30 min，坡度為0°，以后運(yùn)動(dòng)坡度為5°，每隔1 d速度增加1 m/min，運(yùn)動(dòng)時(shí)間增加10 min，1周增至20 m/min，時(shí)間為1 h，或以大鼠在跑臺(tái)上出現(xiàn)頑固性拒跑現(xiàn)象，則停止跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。運(yùn)動(dòng)各組運(yùn)動(dòng)時(shí)間每周5 d，每日1次。其余時(shí)間自由活動(dòng)，期間不改變膳食方案，同時(shí)予丹蛭降糖藥液1.08 g/kg灌胃，每日1次。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 一氧化氮和血管性假血友病因子檢測(cè) 第18周末干預(yù)結(jié)束后禁食12 h，10%水合氯醛0.5 mL/100 g大鼠腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血3 mL，室溫靜置1 h，3000 r/min離心20 min，分離血清后-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，按試劑說明書進(jìn)行操作。

2.3.2 內(nèi)皮微粒檢測(cè) 大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈采血3 mL，置于抗凝管中，參考文獻(xiàn)[5]測(cè)定，EMP<1.0 μm且CD31+/CD42-的微粒，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.3.3 過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α檢測(cè) 大鼠麻醉取腹主動(dòng)脈約4 cm長(zhǎng)，PBS沖凈，濾紙吸干放入凍存管，然后迅速投入液氮中，置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。用Trizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR反應(yīng)。PGC-1α引物由上海英駿生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。上游5'-TCAGTCCTCACTG GTGGACA-3'，下游3'-TGCTTCGTCGTCAAAAACA G-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度126 bp。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性1 min，51 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。1%瓊脂凝膠電泳，然后用凝膠成像系統(tǒng)觀察。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SASS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 丹蛭降糖膠囊聯(lián)合不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)模型大鼠血清一氧化氮、內(nèi)皮型一氧化氮合酶、血管性假血友病因子和內(nèi)皮微粒水平的影響

與空白組比較，模型組NO、eNOS、vWF和EMP水平顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，低強(qiáng)度組、高強(qiáng)度組、中藥組NO、eNOS水平顯著升高及vWF、EMP水平降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表1。

4.2 丹蛭降糖膠囊聯(lián)合不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)模型大鼠過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組PGC-1α表達(dá)水平明顯下降（P<0.05）；低強(qiáng)度組、中強(qiáng)度組、高強(qiáng)度組和中藥組PGC-1α表達(dá)較模型組顯著升高（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見圖1。

5 討論

糖尿病血管內(nèi)皮損傷是多因素、多種病理機(jī)制所致，是影響患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。NO是重要的調(diào)節(jié)血管張力的物質(zhì)，具有舒張血管作用。高血糖可使血管內(nèi)皮NO合成系統(tǒng)紊亂，損壞內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生eNOS，使NO的生成減少，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能的障礙。EMP是血管內(nèi)皮在激活或凋亡時(shí)細(xì)胞膜脫落的小囊泡，其直徑在0.1～l μm，攜帶著某些特異性抗原，糖尿病患者EMP水平明顯升高。EMP的釋放一方面負(fù)反饋于內(nèi)皮系統(tǒng)，促進(jìn)內(nèi)皮損傷；另一方面，釋放的EMP可降低eNOS的活性，減少NO生成，加速內(nèi)皮損傷。EMP與血管病變的發(fā)生發(fā)展有著密切的相關(guān)性，是血管損傷、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的新興生物標(biāo)志物。這2個(gè)敏感性指標(biāo)可直接反映血管內(nèi)皮損傷的程度，有助于及時(shí)了解內(nèi)皮功能動(dòng)態(tài)變化。來自于血管內(nèi)皮細(xì)胞的糖蛋白vWF，作為Ⅷ因子的載體，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞中vWF因子進(jìn)入血液，促進(jìn)血小板的聚集并黏附于受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞，在血栓形成過程中起關(guān)鍵作用。該指標(biāo)可幫助判定糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生的早晚及其嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予模型大鼠不同強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)并聯(lián)合中藥，可使血清e(cuò)NOS、NO含量升高，血清vWF、EMP含量降低，并且這一結(jié)果與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度具有相關(guān)性。與單純中藥組及高強(qiáng)度組比較，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)更有助于改善血管內(nèi)皮功能，說明適當(dāng)運(yùn)動(dòng)有助于中藥作用的充分發(fā)揮，與中藥聯(lián)合具有效果協(xié)同作用。

糖尿病的發(fā)生及血管內(nèi)皮損傷與能量代謝有著密切的聯(lián)系。線粒體是機(jī)體能量代謝的中心，參與多種生理過程，而線粒體的生成關(guān)系著線粒體的功能。在線粒體的生成過程中PGC-1α起著關(guān)鍵作用。PGC-1α可通過增加骨骼肌長(zhǎng)鏈脂肪酸肌纖維膜線粒體膜的表達(dá)，促進(jìn)線粒體脂肪酸氧化，提高胰島素敏感性；另一方面可抑制脂肪酸誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生進(jìn)而減少內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，改善內(nèi)皮狀態(tài)。PGC-1α表達(dá)水平下降會(huì)顯著降低線粒體呼吸率，降低生成ATP的能力。因此，PGC-1α水平的表達(dá)可直接反映能量代謝及內(nèi)皮凋亡的變化。本研究結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)可增強(qiáng)中藥對(duì)PGC-1α的表達(dá)調(diào)節(jié)，具有協(xié)同促進(jìn)作用，而中等強(qiáng)度組療效最為顯著。

運(yùn)動(dòng)可增加機(jī)體能量消耗，使肌肉組織攝取葡萄糖增加。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度變化可調(diào)整胰島素受體的表達(dá)，但運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度并不是越大越好。中等強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可使骨骼肌產(chǎn)生良好的適應(yīng)性。這也與中醫(yī)辨證思想“過猶不及”“中病即止”相一致。相對(duì)于高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，中、低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)更能有效地控制血糖，改善糖尿病患者血管內(nèi)皮功能，可作為防治糖尿病及血管并發(fā)癥的有效手段。

參考文獻(xiàn)：

[1] 于萍，李強(qiáng)，劉穎，等.2型糖尿病早期血管內(nèi)皮功能變化的研究[J].中國實(shí)用內(nèi)科雜志，2010，30（9）：827-828.

[2] 程森華，方朝暉.氧化應(yīng)激對(duì)糖尿病血管內(nèi)皮的損傷機(jī)制及中醫(yī)藥干預(yù)研究[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2012，24（2）：163-165.

[3] 方朝暉.丹蛭降糖膠囊聯(lián)合運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠胰腺NAPDH氧化酶亞單