盧芳 井月娥 任燕冬 等

摘要：目的 探討鉤藤提取物對1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導(dǎo)帕金森?。≒D）模型小鼠神經(jīng)元保護(hù)的作用機(jī)制。方法 將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、鉤藤組及美多芭組，腹腔注射MPTP法制備PD小鼠模型。行為學(xué)測試小鼠抓握和肢體運(yùn)動協(xié)調(diào)能力；生化法測定小鼠中腦黑質(zhì)超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及谷胱甘肽-過氧化物酶（GSH-Px）水平，酶聯(lián)免疫法測定白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6的活性。結(jié)果 與對照組比較，模型組小鼠自主活動次數(shù)減少、爬桿時間延長（P<0.05），腦組織SOD、GSH-Px酶活性明顯下降，MDA、IL-1β、IL-6含量明顯上升（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，鉤藤組和美多芭組小鼠自主活動次數(shù)增多、爬桿時間縮短（P<0.05），腦組織SOD、GSH-Px酶活性明顯上升，MDA、IL-1β及IL-6含量明顯下降（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 鉤藤提取物對PD模型小鼠的治療作用可能是通過清除氧自由基、提高機(jī)體抗氧化能力和抑制炎癥反應(yīng)，從而減少神經(jīng)元的凋亡實現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞：帕金森??；鉤藤提取物；神經(jīng)保護(hù)；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.015

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）04-0057-04

Effects of Uncariae Ramulus Cum Uncis Extract on Neurons of MPTP-induced PD Model Mice LU Fang1， JING Yue-e1， REN Yan-dong2， ZHANG Shu-xiang1， LIU Shu-min1 （1. Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150040， China； 2. Jiamusi Medical College， Jiamusi 154000， China）

Abstract： Objective To study the neuron protection mechanism of Uncariae Ramulus Cum Uncis extract for the MPTP-induced PD mice. Methods C57BL/6 mice were randomly divided into control group， model group， Uncariae Ramulus Cum Uncis extract group and madopar group， and injected with MPTP in abdominal cavity. Behavior test was used to detect grabbing capacity and body movement coordination capacity： three biochemical indexes （SOD， MDA， GSH-Px） were detected by biochemical process and the activity of two immune enzyme-linked indexes （IL-1β， IL-6） were detected by enzymelinked immunosorbent assay. Results Compared with the control group， the autonomic activity numbers of mice increased and climbing pole time decreased in the model group （P<0.05）， enzymatic activity of SOD and GSH-Px decreased significantly and the contents of MDA， IL-1β and IL-6 increased obviously （P<0.01）. Compared with model group， the autonomic activity numbers of mice increased and climbing pole time decreased in the Uncariae Ramulus Cum Uncis extract group and madopar group （P<0.05）. Enzymatic activity of SOD and GSH-Px increased and the contents of MDA and IL-1β and IL-6 decreased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Uncariae Ramulus Cum Uncis extract can reduce neuronic apoptosis PD mice， whose therapeutic action may be realized through eliminating oxygen free radicals， improving oxidation resistance and reducing inflammatory reactions.

Key words： Parkinsons disease； Uncariae Ramulus Cum Uncis； neuroprotection； mice

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（收稿日期：2015-07-04）

（修回日期：2015-08-24；編輯：華強(qiáng)）

帕金森?。≒arkinson disease，PD），亦名震顫性麻痹，是一種常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以靜止性震顫、肌肉僵直、運(yùn)動遲緩和姿勢反射性受阻為典型臨床特征，并通常伴有精神障礙、認(rèn)知障礙或睡眠障礙，導(dǎo)致患者失去生活能力。目前對于PD的發(fā)病機(jī)制并未明確的界定，多巴胺/乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)、氧化應(yīng)激、免疫炎性機(jī)制等因素被認(rèn)為參與了中腦黑質(zhì)部位神經(jīng)元的病變。對于PD的臨床治療，全球范圍內(nèi)普遍以西藥治療為主，而“金藥物”美多芭也僅能改善患者的癥狀，無法阻止疾病的發(fā)展進(jìn)程[1]，且服用西藥通常會出現(xiàn)一系列的不良反應(yīng)，所以，尋求一種中藥保護(hù)制劑迫在眉睫。鉤藤為茜草科植物鉤藤、大葉鉤藤、毛鉤藤、華鉤藤或無柄果鉤藤的干燥帶鉤莖枝。已有研究顯示鉤藤對于PD患者癥狀具有改善作用[2]。本研究從鉤藤提取物入手，檢測在氧化應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用的超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽-過氧化物酶（GSH-Px）3項指標(biāo)，以及神經(jīng)炎癥過程中2種重要的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6來探討鉤藤提取物對神經(jīng)元保護(hù)的作用機(jī)制，為開發(fā)預(yù)防或治療PD的新藥提供參考。

1 實驗材料

1.1 動物

健康C57BL/6雄性小鼠32只，2月齡，體質(zhì)量（20±2）g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心動物實驗室，飼養(yǎng)溫度（22±1）℃、濕度（60±5）%，自由飲食、飲水。

1.2 藥物

鉤藤藥材購于黑龍江省藥材公司，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)劉樹民教授檢驗符合2010年版《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。水浴溫度80 ℃，70%乙醇提取2次，加醇量分別為10、8倍，提取時間分別為2、1.5 h。合并濾液，60 ℃真空旋至浸膏，最后冷凍干燥得鉤藤提取物。多巴絲肼片，上海羅氏制藥有限公司，批號SH1778。

1.3 主要試劑與儀器

鉤藤堿（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號150515）、異鉤藤堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111927-201403），羧甲基纖維素鈉（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司），1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP，美國Sigma公司），SOD、MDA、GSH-Px測試盒和IL-1β、IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒，南京建成生物工程研究所。Waters2695高效液相色譜儀（日本島津），ZZ-6小鼠自主活動測試儀（成都泰盟），KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新），UV-2450可見分光光度計（日本島津）。

2 實驗方法

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：甲醇-水（60∶40）含10 mmol/L三乙胺，乙酸調(diào)pH值7.5；流速：1 mL/min；測定波長：254 nm；在所擬色譜條件下，鉤藤堿的理論塔板數(shù)不低于1500。精密稱取鉤藤堿或異鉤藤堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL含50 μg溶液，即得對照品溶液。取鉤藤總堿20 mg，用甲醇溶解后濾過，25 mL定容，即得供試品溶液，進(jìn)樣量20 μL，測定鉤藤總堿中鉤藤堿和異鉤藤堿的含量。經(jīng)HPLC檢測，自提的鉤藤提取物中鉤藤堿含量為0.13%、異鉤藤堿含量為0.18%，色譜圖見圖1。

2.2 分組、造模及給藥

參照文獻(xiàn)[3]腹腔注射MPTP法制備C57BL/6小鼠PD模型。將小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、鉤藤組及美多芭組，每組8只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，造模組予MPTP腹腔注射30 mg/（g·d），連續(xù)5 d，制備PD小鼠模型，對照組腹腔注射等量生理鹽水。造模結(jié)束后，鉤藤組予鉤藤提取物混懸液灌胃，根據(jù)前期藥效學(xué)實驗選擇最佳劑量818 mg原藥材/（kg·d）；美多芭組予多巴絲肼片懸濁液0.12 mg/g灌胃；模型組和對照組予等量羧甲基纖維素鈉混懸液灌胃。給藥體積0.1 mL/10 g體質(zhì)量，1次/d，連續(xù)20 d。

2.3 行為學(xué)測試方法

各組小鼠于實驗前1周每日進(jìn)行1次爬桿、自主活動行為訓(xùn)練，于取材前進(jìn)行爬桿和自主活動實驗檢測其抓握能力和肢體運(yùn)動協(xié)調(diào)能力。爬桿實驗：將一直徑為2.5 cm泡沫塑料小球固定于一根60 cm長1 cm粗鐵桿頂端，桿上纏繞醫(yī)用膠帶以防打滑。將小鼠放至球頂，松手的同時開始計時，記錄小鼠落到地面的時間。自主活動實驗：將小鼠放到自主活動儀內(nèi)，適應(yīng)黑暗環(huán)境3 min，然后開始計時5 min，記錄小鼠規(guī)定時間內(nèi)的活動次數(shù)。

2.4 腦組織勻漿液制備

行為學(xué)測試后，將各組實驗小鼠于冰上斷頭取腦，將黑質(zhì)部位置于凍存管中，液氮速凍并于-80 ℃冰箱保存。MDA、SOD樣品制備：準(zhǔn)確稱取小鼠腦組織質(zhì)量，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9比例加9倍生理鹽水，冰水浴條件下，機(jī)械勻漿，制備成濃度為10%勻漿液，3000 r/min離心10 min，取上清液分裝待測。GSH-Px樣品制備：取上述10%樣品勻漿液，用生理鹽水稀釋成1%樣品待測。IL-1β、IL-6樣品制備：準(zhǔn)確稱取小鼠腦組織質(zhì)量，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9比例加9倍體積PBS（pH 7.4），冰水浴條件下，機(jī)械勻漿，制備成濃度為10%勻漿液，3000 r/min離心20 min，收集上清液，分裝待測。

2.5 指標(biāo)檢測

取已制備好的相應(yīng)濃度樣品，實驗按照各試劑盒說明書進(jìn)行操作。SOD、MDA、GSH-Px樣品采用生化法測定，分別以分光光度計于550、532、412 nm處，1 cm光徑比色杯，雙蒸水調(diào)零，比色。IL-1β、IL-6樣品采用酶聯(lián)免疫法測定，于酶標(biāo)儀波長450 nm處測定光密度（OD）值。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析，2組間均數(shù)比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 一般狀況

實驗開始2 d后，造模小鼠逐漸開始出現(xiàn)頭部和前肢不自主抖動、頸部和背部體毛戰(zhàn)栗、活動減少現(xiàn)象，提示PD小鼠模型成功。小鼠在連續(xù)腹腔注射MPTP 5 d內(nèi)體質(zhì)量呈下降趨勢。

4.2 行為學(xué)測定結(jié)果

與對照組比較，模型組小鼠自主活動次數(shù)減少、爬桿時間延長（P<0.05）；與模型組比較，鉤藤組和美多芭組小鼠自主活動次數(shù)增多、爬桿時間縮短（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表1。

4.3 鉤藤提取物對模型大鼠腦組織超氧化物歧化酶、丙二醛、谷胱甘肽-過氧化物酶、白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-6水平的影響

與對照組比較，模型組小鼠腦組織SOD、GSH-Px酶活性明顯下降，MDA、IL-1β、IL-6含量明顯上升（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，鉤藤組和美多芭組小鼠腦組織SOD、GSH-Px酶活性明顯升高，MDA、IL-1β、IL-6含量明顯下降（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表2。

5 討論

氧化應(yīng)激學(xué)說認(rèn)為，多巴胺氧化代謝產(chǎn)物造成細(xì)胞內(nèi)氧化壓力過盛和細(xì)胞抗氧化能力不足是PD黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元自發(fā)退變的主要原因。GSH-Px、SOD均是體內(nèi)重要的自由基清除劑，可有效清除H2O2及O2–等自由基。MDA含量也可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映細(xì)胞損傷的程度。本實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠腦組織GSH-Px酶活性明顯低于對照組（P<0.05），MDA含量明顯升高（P<0.01），而清除O2–的抗氧化酶SOD酶活性顯著降低（P<0.01），經(jīng)給予鉤藤提取物和美多芭治療后，MDA含量有所下降（P<0.05）、SOD酶活性增強(qiáng)（P<0.01），均向?qū)φ战M水平靠近，GSH-Px酶活性升高（P<0.05）。本實驗結(jié)果表明，PD模型小鼠黑質(zhì)內(nèi)GSH-Px含量下降及抗氧化自由基酶類活性的改變都體現(xiàn)了經(jīng)MPTP誘導(dǎo)后，小鼠腦組織清除自由基的功能明顯不足，而給予藥物治療后，各項指標(biāo)均被改善，提示鉤藤提取物可通過清除氧自由基、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力及減少細(xì)胞凋亡的途徑保護(hù)神經(jīng)元。

氧化應(yīng)激除發(fā)生在神經(jīng)元，也發(fā)生在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。膠質(zhì)細(xì)胞的激活，尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，是PD病理的重要組分[4]。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)重要的免疫細(xì)胞，當(dāng)受到外界刺激時會被激活而分泌一系列的細(xì)胞因子，其中IL-1β是炎癥反應(yīng)過程中最早被動員的細(xì)胞因子，它還可以激活巨噬細(xì)胞等分泌IL-6。在PD患者尸檢中，黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)內(nèi)明顯可見主要分布在激活的小膠質(zhì)細(xì)胞上的IL-1β等炎癥因子，且炎癥因子的表達(dá)與多巴胺神經(jīng)元的丟失呈正相關(guān)[5]。IL-1β、IL-6均是炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，且同時具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、保護(hù)神經(jīng)元、促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)等作用[6]。本實驗結(jié)果顯示，造模后模型小鼠黑質(zhì)內(nèi)IL-1β、IL-6的含量明顯升高（P<0.05），經(jīng)鉤藤提取物治療后，二者含量顯著下降（P<0.01）。鉤藤提取物能夠通過抑制MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠IL-1β、IL-6的表達(dá)，提示其可能通過阻斷或減弱PD黑質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)來減少神經(jīng)元的變性。

綜上所述，鉤藤提取物對MPTP誘導(dǎo)PD模型小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用是通過清除氧自由基、提高機(jī)體抗氧化能力及抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)而實現(xiàn)的。

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