王江浩，尤　帥，趙愛菊，高增玉，陳希勇，關(guān)中波*（.河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所，河北省遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，河北　石家莊　050035；.河北省農(nóng)業(yè)廳綠色食品辦公室，河北石家莊　0500）

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玉米單倍體的誘導(dǎo)加倍技術(shù)及其應(yīng)用研究

王江浩1，尤帥2，趙愛菊1，高增玉1，陳希勇1，關(guān)中波1*
（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所，河北省遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊050035；2.河北省農(nóng)業(yè)廳綠色食品辦公室，河北石家莊050011）

摘要：孤雌生殖誘導(dǎo)系的單倍體育種技術(shù)在玉米育種中被廣泛應(yīng)用，極大地加快了育種進(jìn)程。介紹了單倍體概念及其植物學(xué)形態(tài)；闡述了玉米單倍體的獲得途徑和加倍方法，以及育種中單倍體的篩選方法，其中人工獲得單倍體的途徑主要有遠(yuǎn)緣雜交、花藥培養(yǎng)、小孢子培養(yǎng)、物理法誘導(dǎo)、化學(xué)法誘導(dǎo)、不定配子體誘導(dǎo)孤雄生殖、孤雌生殖誘導(dǎo)系誘導(dǎo)，加倍的方法主要包括單倍體的自然加倍和化學(xué)加倍，單倍體的篩選可以通過遺傳標(biāo)記性狀、形態(tài)特征以及流式細(xì)胞儀和分子標(biāo)記加以篩選；討論了單倍體在縮短育種周期、群體改良、篩選突變體、構(gòu)建基因定位群體，以及商業(yè)雜交種親本保純提純方面的應(yīng)用價(jià)值；分析了單倍體育種技術(shù)存在的主要問題，并對其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：玉米；單倍體誘導(dǎo)；單倍體加倍；育種

玉米是世界第一大糧食作物[1]。而中國是世界第二大玉米生產(chǎn)國，產(chǎn)量和消費(fèi)量均約占全球玉米產(chǎn)量和消費(fèi)量的20%[2]。2012年我國的玉米產(chǎn)量和種植面積均超過水稻和小麥等其他作物，成為我國第一大糧食作物[3，4]。雖然近幾年我國玉米產(chǎn)量增長較快，但增速依然低于國內(nèi)需求增長，中國自2010年開始轉(zhuǎn)變?yōu)橛衩變暨M(jìn)口國[5]。為了緩解這種壓力，廣大育種工作者應(yīng)適應(yīng)當(dāng)前生產(chǎn)發(fā)展需要，盡快、高效地培育出適宜市場需求的玉米新品種。長期以來，常規(guī)的系譜法、回交法、復(fù)合雜交和輪回選擇等技術(shù)是改良玉米種質(zhì)的主要手段，且已培育了許多優(yōu)良雜交種。然而，利用常規(guī)遺傳改良方法選育一個(gè)優(yōu)良玉米雜交種往往需要6～10 a的周期[6，7]，無法滿足生產(chǎn)對玉米品種更新?lián)Q代的要求。

近年來，以生物孤雌誘導(dǎo)為基礎(chǔ)的玉米單倍體育種技術(shù)已經(jīng)逐步成為玉米育種的關(guān)鍵技術(shù)。單倍體育種技術(shù)只需2個(gè)世代便可得到純合DH系，不僅極大地縮短了育種周期，而且還可以實(shí)現(xiàn)配子的多樣性選擇，提高有利基因型的入選率，提升育種效率[8]。國外許多種業(yè)公司均已實(shí)現(xiàn)單倍體育種的規(guī)?；瘧?yīng)用，該技術(shù)成為可與轉(zhuǎn)基因技術(shù)、分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)相媲美的現(xiàn)代玉米育種的三大核心技術(shù)之一[9]。作者綜述了玉米單倍體的誘導(dǎo)、加倍技術(shù)以及單倍體育種技術(shù)在育種和拓寬玉米種質(zhì)基礎(chǔ)上的應(yīng)用以期為玉米單倍體育種技術(shù)更好地得到發(fā)展應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　單倍體概念及其植物學(xué)形態(tài)

單倍體指具有配子體染色體組分的個(gè)體、組織或細(xì)胞，它們分化、生長出的植株為單倍體植株。自然界中單倍體是經(jīng)過不正常受精形成的，一般發(fā)生率很低。1922年Dorothy Bergner首次發(fā)現(xiàn)了野生曼陀羅單倍體[10]，此后，煙草、小麥等的單倍體被相繼發(fā)現(xiàn)[11]。玉米單倍體的發(fā)現(xiàn)較晚，1929年Randolph和Stadler首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了玉米單倍體[12]。Randolph[13]首先觀察到玉米品種間或自交系間雜交后代中有0.011%～0.103%的孤雌生殖單倍體，且不同雜交組合中單倍體產(chǎn)生的頻率存在較大差異，但人工單倍體的產(chǎn)生經(jīng)歷了漫長過程。直到1947年Chase等[14，15]才將選育的優(yōu)良純合DH系用于商業(yè)雜交種，并于1951年培育出了有利用價(jià)值的DH系用于商業(yè)雜交種生產(chǎn)[16]。

單倍體由于染色體數(shù)目和配子體相等，所以其形態(tài)、解剖、遺傳、生理特性等與親本均有明顯不同。單倍體相對于親本植株均較矮小，根系變小，葉片狹長直立，單倍體植株葉片上單位面積氣孔數(shù)目較多，而保衛(wèi)細(xì)胞較小，葉綠體數(shù)目較少、顏色淺綠，單倍體的體細(xì)胞、細(xì)胞核和花粉母細(xì)胞均變小，花粉粒小而空癟，絕大多數(shù)不能正常授粉結(jié)實(shí)。單倍體加倍獲得純合二倍體后，可快速選育優(yōu)良自交系。單倍體育種技術(shù)直接利用配子體進(jìn)行選擇，提高了對有利基因型的遴選頻率，大大縮短了自交系選育的年限。

2　人工獲得玉米單倍體的方式

獲得單倍體的方法主要有自然發(fā)生和人工誘導(dǎo)2種。其中，自然發(fā)生單倍體的幾率極低，發(fā)生率一般不超過0.1%[17]。因此，要獲得大量的單倍體必須依靠人工誘導(dǎo)方法。在玉米育種實(shí)踐中人工誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體的方法主要有遠(yuǎn)緣雜交、花藥培養(yǎng)、小孢子培養(yǎng)、孤雌生殖和單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)等。

2.1遠(yuǎn)緣雜交產(chǎn)生單倍體

親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的花粉一般很難與母體卵細(xì)胞發(fā)生受精作用，但卻具有刺激卵細(xì)胞的作用，可誘發(fā)其成為單倍體或雙倍體。在玉米遠(yuǎn)緣雜交過程中，可能由于雙親體細(xì)胞分裂周期不同步，導(dǎo)致其一親本染色體丟失，從而引起單倍體的發(fā)生。

2.2花藥培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體

花藥培養(yǎng)的原理是基于植物每一特化的營養(yǎng)細(xì)胞都具有全能性[18]。花藥培養(yǎng)是獲得單倍體的有效途徑之一。玉米的花藥培養(yǎng)比較困難，主要原因是玉米花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率和分化率較低，且受基因型的限制。在國內(nèi)，谷光明最先通過花藥培養(yǎng)獲得單倍體，并經(jīng)過一步步的摸索和完善，最終形成了完整的試驗(yàn)技術(shù)體系，成功通過花粉分化出完整植株[19]。國外研究者利用此方法，在快速獲得純系、提高育種效率方面也取得了較大進(jìn)展[19]。1992年通過廣西壯族自治區(qū)審定的玉米品種桂三1號就是由廣西玉米研究所通過玉米花粉培養(yǎng)誘導(dǎo)出來的[20]，該品種推廣面積超過了5 000 hm2，是世界首例利用花藥培養(yǎng)得到的玉米雜交種。

2.3小孢子培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體

小孢子培養(yǎng)也是獲得單倍體的一條有效途徑。1982年Licher[21]首次使用小孢子培養(yǎng)技術(shù)獲得了油菜單倍體植株。禾本科作物小孢子培養(yǎng)研究起步相對較晚，首先在大麥上取得了突破[22]。Pescitelli等[23]首次報(bào)道了從玉米小孢子培養(yǎng)中分化出單倍體植株。玉米小孢子培養(yǎng)機(jī)理復(fù)雜，且受多種因素的影響，因此要促使供體植株健壯發(fā)育，須選擇小孢子發(fā)育時(shí)期處于單核中晚期或雙核早期的花藥。小孢子需要預(yù)冷處理、暗培養(yǎng)以及弱光培養(yǎng)等過程，然后接種到適宜的再生培養(yǎng)基上，得到健壯再生植株，再經(jīng)過馴化移栽到溫室。

2.4物理法誘導(dǎo)單倍體

物理法誘導(dǎo)單倍體是指通過輻射照射未受精的子房或者胚珠，誘變受精過程，降低受精能力，使花粉刺激卵細(xì)胞分裂但不受精從而獲得單倍體。使用最多的是X射線和Y射線。用輻射過的花粉授粉后，在玉米胚囊中可觀察到1個(gè)精子同極核融合，第2個(gè)精子則消失，使單倍體誘導(dǎo)率提高[24，25]。

2.5化學(xué)法誘導(dǎo)單倍體

化學(xué)誘導(dǎo)單倍體常用的化學(xué)試劑有二甲基亞砜（DMSO）、馬來酰肼（MH）、赤霉素（GA3）、萘乙酸（NAA）、聚乙二醇（PEG）、激動(dòng)素、甲苯胺藍(lán)、6-BA、秋水仙素、2，4-D等[26～28]。常用方法是花絲尚未抽出時(shí)將雌穗套袋，待花絲完全抽出后剪短花絲（留1～2 cm），再用注射器將化學(xué)試劑注射到花絲上，每個(gè)雌穗注射2 mL，最后再套上1層紙袋[29]。整個(gè)操作過程嚴(yán)格防止產(chǎn)生花粉污染，收獲無破損袋果穗?；瘜W(xué)誘導(dǎo)雖然簡單，但在實(shí)際應(yīng)用中存在許多缺點(diǎn)，如孤雌生殖誘導(dǎo)率低、孤雌生殖后代二倍體比例少、非整倍體居多、大多數(shù)孤雌生殖后代性狀分離等。馬來酰肼溶液濃度50 mg/kg預(yù)處理花柱后授粉，誘導(dǎo)單倍體率為0.7%[30]。余建華等[31]用濃度50 mg/L的MH和500 mg/L的PEG混合2%的二甲基亞砜處理抽絲5 d的花絲，誘導(dǎo)率達(dá)0.52%，約為對照的10倍。

2.6不定配子體誘導(dǎo)孤雄生殖產(chǎn)生單倍體

1969年Kermiele在玉米自交系W23中發(fā)現(xiàn)1個(gè)不定配子體突變基因（ig），能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生1%～2%的雄核發(fā)育單倍體[32]。以W23（ig）純合體為母本，與育種材料雜交，用于單倍體的選育。但純合體雄性不育，不能自交留種，而雜合體的后代只有1/4是純合體，群體難以擴(kuò)大，同時(shí)W23（ig）易感病、籽粒性狀差、誘導(dǎo)率低，所以限制了其在育種中的應(yīng)用。

2.7孤雌生殖誘導(dǎo)系誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體

孤雌生殖誘導(dǎo)系具有雜交誘導(dǎo)母本雌配子體形成高頻單倍體的能力，是目前玉米單倍體誘導(dǎo)的主要方法。Stock6是世界第1個(gè)選育成功的玉米單倍體誘導(dǎo)系，應(yīng)用廣泛。以Stock6作為父本，與任何被誘導(dǎo)材料進(jìn)行雜交，后代中均可出現(xiàn)1%～2%的孤雌生殖單倍體[33]。然而Stock6本身存在諸多缺陷，如花粉量很少或散粉不暢、自交結(jié)實(shí)性差、穗粒腐病嚴(yán)重等。因此，利用Stock6誘導(dǎo)單倍體的關(guān)鍵在于根據(jù)不同的生態(tài)環(huán)境對其進(jìn)行改良。法國的SWl4、俄羅斯的Krasnodar Markers和摩爾多瓦的ZMS等都是以Stock6為基礎(chǔ)，通過雜交改良的方法獲得新誘導(dǎo)系，與被誘導(dǎo)材料雜交均可產(chǎn)生3.0%左右的單倍體[34]。我國對誘導(dǎo)系的研究起步較晚，但也取得了一些進(jìn)展。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)育成了誘導(dǎo)率達(dá)5.8%的孤雌生殖單倍體誘導(dǎo)系農(nóng)大高誘1號[35，36]。才卓等[37]選育的吉高誘系3號，誘導(dǎo)率達(dá)到了10.4%。劉治先等[38]選育的HOl-HOS，誘導(dǎo)率為2.44%～18.50%。利用玉米誘導(dǎo)系誘導(dǎo)單倍體操作過程容易、鑒定方法簡單，是目前獲得單倍體經(jīng)濟(jì)、有效的方法之一。

3　玉米單倍體的篩選

玉米單倍體的篩選可以首先通過遺傳標(biāo)記性狀、形態(tài)特征加以篩選，然后通過細(xì)胞學(xué)檢測加以確證。流式細(xì)胞儀和分子標(biāo)記也能應(yīng)用于玉米單倍體鑒定。

通常獲得單倍體的最主要途徑是利用孤雌生殖誘導(dǎo)系誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體，也是育種單位最常用的方法。一般誘導(dǎo)系都帶有籽粒和植株顏色2套遺傳標(biāo)記性狀，表現(xiàn)為紫色的胚乳頂端、胚芽尖；紫色葉片、葉鞘乃至植株。這些標(biāo)記性狀受顯性基因控制，在雜交后代中顯性表達(dá)。單倍體籽粒一般具有紫色粒頂、無色胚芽尖性狀，可根據(jù)籽粒的標(biāo)記性狀逐粒挑選準(zhǔn)單倍體籽粒。另外，單倍體植株田間表現(xiàn)矮小瘦弱，生長緩慢，葉片窄小上沖或直立，葉色淺綠。雌雄不協(xié)調(diào)，雄穗高度不育，因此，也可依據(jù)單倍體的田間表現(xiàn)作進(jìn)一步篩選。

4　玉米單倍體的加倍

4.1單倍體的自然加倍

Chalyk[39]給234個(gè)單倍體玉米植株的雌穗授粉，平均結(jié)實(shí)26粒/穗，僅有8個(gè)果穗未結(jié)實(shí)。說明單倍體能否自交結(jié)實(shí)主要取決于雄穗是否恢復(fù)可育性。自然加倍率受環(huán)境和基因型的影響。在自然環(huán)境中，玉米單倍體植株自然加倍的概率為0.4%～1.2%。不同的基因型，自然加倍的頻率差異較大，有的材料不發(fā)生自然加倍，有的材料自然加倍率達(dá)10%左右[32]。玉米單倍體植株一般表現(xiàn)為雄性不育及雌雄不協(xié)調(diào)，對于自然加倍率高的材料，依靠自身的育性恢復(fù)便可以自交結(jié)實(shí)。而對于自然加倍率低的材料，對其進(jìn)行人工加倍恢復(fù)其育性后，才能在育種和研究中利用。

4.2單倍體的化學(xué)加倍方法

4.2.1浸種法浸種法是最簡單的加倍方法，即用秋水仙素溶液（0.06%秋水仙素+2% DMSO）浸泡萌動(dòng)的單倍體種子。先將單倍體種子用清水浸泡20～24 h，種子吸脹后，用秋水仙素溶液浸泡8～12 h，再用清水浸泡1～2 h后再播種，以減少對種子的傷害[40]。Gayen等用此方法處理單倍體種子，并將種子胚處進(jìn)行切口處理的加倍效果最好，加倍率能達(dá)到18%。

4.2.2浸芽法當(dāng)單倍體籽粒發(fā)芽到2 cm左右時(shí)，用刀片削掉幼芽頂端的胚芽鞘再浸泡[41]。Zabirova等在18℃、黑暗條件下用0.06%秋水仙素溶液處理胚芽鞘12 h，18℃和26℃恢復(fù)2 d，加倍率分別為28.8%（18℃）和31.5%（26℃）。Eder等[42]利用該方法處理單倍體，49.4%的單倍體產(chǎn)生了可育花粉，其中39.0%的單倍體能夠自交，27.3%的單倍體自交后結(jié)實(shí)。

4.2.3浸根法該方法主要是用秋水仙素溶液浸泡單倍體幼苗根。將2～3葉期單倍體幼苗的根系在0.05%的秋水仙素溶液中浸泡24 h，清水沖洗處理后，移栽于生長發(fā)育條件良好的環(huán)境下。Bords等[43]用該方法處理3葉期幼苗的根尖3 h，散粉率達(dá)到了30%～60%。該方法加倍效果較好，但需要的藥劑量大，成本較高。

4.2.4注射法注射法有2種處理方法：第1種為在田間用秋水仙素溶液注射6葉期單倍體的盾片節(jié)；第2種為在室內(nèi)用秋水仙素溶液注射3～4葉期單倍體幼苗的生長點(diǎn)。Chase[44]用0.05%秋水仙素+l0%甘油的水溶液0.5 mL注射6葉期玉米幼苗的盾片節(jié)，結(jié)實(shí)率較對照提高了3倍以上。Deimling等[45]用0.125%秋水仙素溶液注射3～4葉期幼苗莖尖生長點(diǎn)，然后在18℃、黑暗條件下保持2 d，加倍率為27.5%。Eder等[42]用0.125%秋水仙素+0.5% DMSO混合溶液注射3～4葉期幼苗，處理后一部分單倍體種于溫室，另一部分種于大田，發(fā)現(xiàn)種在溫室的單倍體加倍率達(dá)到30.5%，種在大田的單倍體加倍率只有溫室的l/3左右。這種方法的處理時(shí)期以及注射部位的選擇難以把握，從而影響到加倍效果。

4.2.5除草劑加倍法雖然利用秋水仙素處理的加倍率較高，但秋水仙素是致癌物質(zhì)，毒性大，而且對單倍體幼苗傷害較重。一些具有類似功能的細(xì)胞分裂抑制劑，如AMP、拿草特、氟樂靈和安磺靈等除草劑均對細(xì)胞有加倍作用，甚至對某些材料較秋水仙素的加倍效果還高[46]。拿草特以50滋mol/L濃度浸種處理24 h的加倍率最高，平均加倍率為10.5%。氟樂靈處理玉米單倍體，以80滋mol/L濃度浸種處理20 h的加倍率最好，平均加倍率為17.6%[47]。另外，除草劑對單倍體5～7片葉期的幼苗進(jìn)行滴心處理，也有很好的加倍效果[48]。目前，國外已經(jīng)廣泛應(yīng)用除草劑進(jìn)行玉米單倍體加倍。利用除草劑這樣的低毒加倍劑進(jìn)行加倍將是今后研究的重要方向。

4.3組織培養(yǎng)加倍法

組織培養(yǎng)加倍的方法是利用細(xì)胞全能性在分化前使細(xì)胞還原成二倍體，從而達(dá)到加倍的目的。將秋水仙素、除草劑或其他試劑添加到培養(yǎng)基中，對花藥、小孢子或單倍體愈傷組織等進(jìn)行加倍處理，然后經(jīng)分化得到DH植株的方法。Barnabas等[49]用0.02%和0.03%的秋水仙素處理玉米小孢子，得到了高度可育的再生植株。國外跨國種業(yè)公司已經(jīng)利用此種方法大大提高了單倍體的加倍效率。組織培養(yǎng)加倍方法可能是迄今為止單倍體加倍效率最高的一種方法。今后要深入研究、掌握這種技術(shù)。

4.4氣體加倍法

N2O也具有染色體加倍功能。在玉米6葉期，用N2O（600 kPa）處理2 d，可以顯著提高單倍體植株的可育性，44%的單倍體植株能自交結(jié)實(shí)；未用N2O處理的單倍體，只有11%的單倍體植株能自發(fā)加倍[32]。

5　玉米單倍體育種技術(shù)的應(yīng)用

5.1縮短育種周期，提高選擇效率

傳統(tǒng)的方法選育二環(huán)系，需要連續(xù)自交7代才能得到純度為99.2%的自交系，耗時(shí)費(fèi)力，而且周期較長。使用單倍體育種技術(shù)，只需2個(gè)世代便可以得到純度為100%系，再經(jīng)過2 a的測交組合試驗(yàn)，從選育自交系到育成雜交種只需4 a時(shí)間，與常規(guī)育種相比，省工省時(shí)，可以明顯縮短育種周期。

由于單倍體只有一套染色體，沒有等位基因，利用單倍體育種技術(shù)在自交系的選育過程中能簡化基因互作，去掉超顯性效應(yīng)，保留有利的加性和上位效應(yīng)；還可淘汰有害的、致死和半致死的隱性基因。因此，單倍體育種技術(shù)在提高目標(biāo)性狀選擇的準(zhǔn)確性、加快育種進(jìn)程上具有不可替代的作用。

5.2群體改良

玉米單倍體育種技術(shù)還可以應(yīng)用在基礎(chǔ)群體的創(chuàng)建與改良上。育種中輪回選擇基礎(chǔ)群體中的某個(gè)體基因型若雜合程度很高，該個(gè)體被選擇后雖然會(huì)將有利的基因帶入下一輪的群體，但也連帶有大量隱性的有害基因。應(yīng)用常規(guī)方法必須要經(jīng)過多輪的選擇才能將這些隱性的有害基因淘汰掉，因此群體改良的進(jìn)程非常緩慢。DH系應(yīng)用于基礎(chǔ)群體的創(chuàng)建和改良可以消除顯性基因?qū)﹄[性基因的掩蓋作用，增加選擇的準(zhǔn)確性，提高輪回選擇的效率。

5.3突變體的篩選

產(chǎn)生和利用有利突變，是培育植物新品種的有效方法。單倍體只有一套染色體，沒有顯隱性關(guān)系。因此，突變在早代可進(jìn)行鑒定，經(jīng)加倍處理，突變位點(diǎn)純合，縮短了育種周期。但是到目前為止，單倍體技術(shù)在玉米突變育種中的研究與應(yīng)用較少。

5.4構(gòu)建基因定位群體

DH群體盡管所含的信息量相對較少，但群體中的每個(gè)DH系都是一個(gè)遺傳上純合的株系，能夠無限繁殖，因此是永久性群體，可以連續(xù)使用。DH群體在各種環(huán)境下均可以進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，使用該群體收集到的數(shù)據(jù)與使用常規(guī)方法早代選單株收集的數(shù)據(jù)相比減小了環(huán)境的誤差，而且DH系構(gòu)建群體消除了常規(guī)法早代競爭的影響，大大提高了QTL定位的準(zhǔn)確性。另外，利用DH群體還可快速建立不同的質(zhì)量性狀基因或QTL位點(diǎn)的近等基因系，以便對這些位點(diǎn)的作用機(jī)理進(jìn)行深入研究。更為重要的是，構(gòu)建玉米DH群體比構(gòu)建重組近交系群體效率高，能節(jié)省大量人力物力。

5.5商業(yè)雜交種親本保純提純

單倍體技術(shù)還可以用于親本種子的保純。在玉米種子生產(chǎn)過程中，親本種子純度是制種的關(guān)鍵因素之一，直接影響到雜交種的使用價(jià)值。親本經(jīng)過多年繁殖后常出現(xiàn)退化和混雜的現(xiàn)象，原來的優(yōu)良性狀會(huì)逐漸減弱或消失，嚴(yán)重時(shí)就失去應(yīng)用價(jià)值。可以利用單倍體技術(shù)產(chǎn)生單倍體，經(jīng)加倍形成DH系，使發(fā)生混雜或退化的親本恢復(fù)其純度和優(yōu)良特性。

6　討論

單倍體技術(shù)作為新的快速選育自交系的方法是現(xiàn)代育種的重要方法，但如何使這一方法能夠有效地應(yīng)用于育種實(shí)踐仍有諸多問題需要考慮。

6.1誘導(dǎo)系的選育

孤雌生殖誘導(dǎo)系的選育是進(jìn)行單倍體育種的先決條件。選育標(biāo)記明顯、誘導(dǎo)率高的玉米誘導(dǎo)材料是研究的重點(diǎn)方向，現(xiàn)在國外已經(jīng)選育出帶有熒光蛋白的高效誘導(dǎo)系，可以快速準(zhǔn)確篩選單倍體籽粒，為進(jìn)一步做幼胚的組織培養(yǎng)加倍奠定基礎(chǔ)，目前國內(nèi)這方面的研究鮮有報(bào)道。

6.2誘導(dǎo)基礎(chǔ)材料的選擇

與常規(guī)自交系的選育方法一樣，通過單倍體誘導(dǎo)選系同樣應(yīng)重視基礎(chǔ)材料的選擇，該環(huán)節(jié)是單倍體育種工作成敗的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，決定著后續(xù)育種工作的意義。單倍體育種需要大量的單倍體，因此對誘導(dǎo)材料的選擇具有一定的特殊性，主要應(yīng)考慮誘導(dǎo)材料產(chǎn)生單倍體的能力以及選系材料的世代。有人主張?jiān)诨A(chǔ)材料的F1進(jìn)行誘導(dǎo)，有人主張?jiān)诮?jīng)過高壓選擇后的分離世代進(jìn)行誘導(dǎo)，這些問題還需進(jìn)一步研究。

6.3加倍方法的研究

隨著新的誘導(dǎo)系的選育，誘導(dǎo)效率不斷提高，單倍體加倍技術(shù)是目前單倍體育種中的最主要的技術(shù)屏障。當(dāng)前單倍體加倍以人工化學(xué)加倍方法為主，主要用秋水仙素處理，加倍效果受溶液濃度、處理部位、處理時(shí)間、基因型等不同因素的影響而不同，研究結(jié)果也不盡相同[50～53］。

秋水仙素是一種劇毒物質(zhì)，探尋無毒無害的化學(xué)試劑加倍是目前的研究方向。今后應(yīng)主要對除草劑及組織培養(yǎng)加倍的方法進(jìn)行重點(diǎn)研究，這可能也是最經(jīng)濟(jì)、最有效的加倍方法。

7　前景展望

單倍體育種技術(shù)是與轉(zhuǎn)基因技術(shù)、分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)相媲美的現(xiàn)代玉米育種的三大核心技術(shù)之一，在國內(nèi)的應(yīng)用尚處于起始階段。與轉(zhuǎn)基因育種相比，單倍體育種不存在生物安全問題，并且育種周期短，特別適合我國當(dāng)前的育種實(shí)際需要。單倍體育種技術(shù)可以應(yīng)用于種質(zhì)擴(kuò)增和群體改良等各個(gè)可能的領(lǐng)域，將來可與分子育種、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等結(jié)合起來，發(fā)揮更大的作用。因此，以單倍體技術(shù)為核心，重點(diǎn)研究單倍體群體和DH系的應(yīng)用方向，并結(jié)合雜種優(yōu)勢利用技術(shù)、形態(tài)改良技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)，能大量、快速創(chuàng)制玉米新種質(zhì)，為培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗、廣適的玉米新品種提供資源保障。未來還需要在誘導(dǎo)機(jī)理、新型誘導(dǎo)系選育、單倍體準(zhǔn)確快速鑒定、高效低毒加倍方法以及DH系管理上加強(qiáng)研究力度，最終形成一套高效的單倍體育種體系，實(shí)現(xiàn)玉米育種技術(shù)的變革，對促進(jìn)國內(nèi)育種技術(shù)進(jìn)步、種質(zhì)資源改良、品種選育和種子生產(chǎn)等做出更大的貢獻(xiàn)。

參考文獻(xiàn)：

［1］張世煌，徐偉平，李明順，李新海，徐家舜.玉米育種面臨的機(jī)遇和挑戰(zhàn)［J］.玉米科學(xué)，2008，16（6）：1-5.

［2］孫儷，劉鐘欽，高國棟，董巖.中國玉米生產(chǎn)及貿(mào)易現(xiàn)狀分析［J］.經(jīng)濟(jì)研究導(dǎo)刊，2009，（4）：174-175.

［3］佟屏亞.中國玉米生產(chǎn)形勢和技術(shù)走向［J］.農(nóng)業(yè)科技通訊，2012，（10）：5-7.

［4］戴景瑞，鄂立柱.我國玉米育種科技創(chuàng)新問題的幾點(diǎn)思考［J］.玉米科學(xué)，2010，18（1）：1-5.

［5］仇煥廣，張世煌，楊軍，井月.中國玉米產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢、面臨的挑戰(zhàn)與政策建議［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2013，15（1）：20-24.

［6］Lawrence C J，Walbot V. Translational genomics for bioenergy production from fuelstock grasses：maize as the model species［J］. Plant Cell，2007，19（7）：2091-2094.

［7］劉紀(jì)麟.玉米育種學(xué)：第2版［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

［8］扈光輝.利用父本單倍體誘導(dǎo)系選育自交系的研究進(jìn)展［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，（1）：138-139.

［9］王麗娜.雜交誘導(dǎo)玉米單倍體化學(xué)加倍效果的研究［D］.長春：吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，2012.

［10］Blakeslee A F，Belling J，F(xiàn)amham ME，Bergner AD. Ahaploid mutation in the jinson weed，datura stramonium ［J］. Science，1922，55：646-647.

［11］Clausen R E，Mann M C. Inheritance in Nicotiana tabacum.V.The occurre of haploid plants in interspecific progenies［J］. Proc Natl Acad Sci，1924，10：121-124.

［12］Sarkar K R，Coe E H. A genetic analysis of the origin of maternal haploids in maize［J］. Genetics，1966，54：453-464.

［13］Randolph L F. Note on haploid frequencies［J］. Maize Genet Coop News Lett，1938，12：12.

［14］ChaseSS. Monoploid frequencies in a commercial double cross hybrid maize，and in its component single cross hy原brids and inbred lines［J］.Genetics，1949，34：328-332.

［15］Chase SS. Production of homozygous diploids of maize from monoploids［J］. Agronomy Journal，1952，44：263-267.

［16］Chase SS. The reproductive success of mono ploi d maize［J］.Am Jour Bot，1949，36：795-796.

［17］陳文俊，李明媚.玉米單倍體誘導(dǎo)育種技術(shù)體系與應(yīng)用前景［J］.農(nóng)業(yè)科技通訊，2009，（12）：112-115.

［18］王忠.植物生理學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010.

［19］中國科學(xué)院遺傳研究所組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室四室一組.誘導(dǎo)玉米花粉植株的初步研究［J］.遺傳學(xué)報(bào)，1975，2（2）：138-142.

［20］胡爾良.利用stock6誘導(dǎo)玉米孤雌生殖單倍體及其加倍的研究［D］.成都：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［21］Licher R. Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus［J］. Z Pflanzenphysiol，1982，105：427-434.

［22］Hunter C P. The effect of anther orientation on the pro原duction of microspore -derived embryoids and plants of Hordeum vulgare cv. Sabarlis［J］. Plant Cell Reports，1985，（4）：267-268.

［23］Pescitelli S M，petolino J F. Microspore development in cultured maize anthers［J］. Plant Cell Reports，1988，（7）：441-444.

［24］霍赫洛夫.單倍體與育種［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1985.

［25］Kimber G，Riley R. Haploid anglosperms［J］. Bol Rev，1963，29：480-531.

［26］王宏偉，邢志遠(yuǎn)，史振聲，李鳳海，王志斌，陳志斌.藥劑誘導(dǎo)玉米孤雌生殖［J］.玉米科學(xué)，2006，14（6）：35-37.

［27］文仁來，閻飛燕，吳翠榮，譚強(qiáng)，韋桂旺.化學(xué)藥物誘導(dǎo)玉米孤雌生殖研究初報(bào)［J］.玉米科學(xué)，2001，9（4）：31-32.

［28］劉曉廣，金玄吉.孤雌生殖誘導(dǎo)技術(shù)在玉米育種上的利用效果［J］.吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999，24（1）：23-25.

［29］豐嶸，蔡群峰.藥劑誘導(dǎo)玉米孤雌生殖研究［J］.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，16（6）：566-568.

［30］蔡旭.植物遺傳育種學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，1988.

［31］余建華，蔡群峰，加那提，許啟鳳.化學(xué)藥劑誘導(dǎo)玉米孤雌生殖［J］.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，4（3）：5-10.

［32］杜何為，戴景瑞，李建生.玉米單倍體育種研究進(jìn)展［J］.玉米科學(xué)，2010，18（6）：1-7.

［33］譚靜，徐春霞，陳洪梅，羅黎明.利用單倍體誘導(dǎo)系選育玉米自交系研究［J］.玉米科學(xué)，2007，15（4）：56-58，62.

［34］馬蘭.淺談?dòng)衩讍伪扼w的產(chǎn)生途徑［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，（8）：16-17.

［35］劉志增，宋同明.玉米高頻率孤雌生殖單倍體誘導(dǎo)系的選育與鑒定［J］.作物學(xué)報(bào)，2000，（5）：570-574.

［36］劉志增，宋同明，滕文濤，薛國賓，劉麗娟.玉米孤雌生殖誘導(dǎo)系的選育方法研究［J］.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，（3）：51-57.

［37］才卓，徐國良，劉向輝，董亞琳，代玉仙，李淑華.玉米高頻率單倍生殖誘導(dǎo)系吉高誘系3號的選育［J］.玉米科學(xué)，2007，15（1）：1-4.

［38］劉治先，楊菲，丁照華，劉朋.玉米單倍體誘導(dǎo)材料的鑒定和快速選系技術(shù)研究［J］.玉米科學(xué)，2008，16（3）：12-14，18.

［39］ChaIyk ST. Properties of maternal haploid maize plants and potential application to maize breeding［J］.Euphytica，1994，79：13-18.

［40］慈佳賓，楊巍，任雪嬌，崔學(xué)宇，張野，張艷輝，楊偉光.玉米單倍體誘導(dǎo)及化學(xué)加倍方法的研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，36（3）：49-53.

［41］魏昌松.玉米單倍體高頻誘導(dǎo)系的篩選與加倍技術(shù)的研究［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［42］Eder J，Chalyk S. In vivo haploid induction in maize ［J］. Theor Appl Genet，2002，104：703-708.

［43］Bordes J，Dumas De Vaulx R，Lapierre A，Pollacsek M. Haploidiploidization of maize（Zea mays L.）through induced gynogenesis assisted by glossy markers and its use in breeding［J］. Agronomier（Print），1997，17：291-292.

［44］Chase SS. Production of homozygous diploids of maize from monmoploids［J］. Agron J，1952，44：263-267.

［45］Deimling S，Rober F，Geiger H. Methodology and ge原netics of in vivo haploid induction in Maize［J］. Vortr. Pflanzenztichtg，1997，38：203-224.

［46］慈佳賓，李繼竹，劉振庫，尹日成，姜龍，鄭雷雷，梁曉斐，楊偉光.抗微管除草劑對玉米單倍體加倍效果研究［J］.玉米科學(xué)，2012，20（5）：10-14.

［47］慈佳賓.玉米單倍體誘導(dǎo)和加倍技術(shù)及DH系的遺傳研究［D］.長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

［48］惠國強(qiáng)，杜何為，楊小紅，劉光輝，王振通，張義榮，鄭艷萍，嚴(yán)建兵，張銘堂，李建生.不同除草劑加倍玉米單倍體的效率［J］.作物學(xué)報(bào)，2012，38（3）：416-422.

［49］Barnabas B，Obert B，Kovacs G. Colchicine，an efficient genome -doubling agent for maize（Zea mays L.）microspores cultured in anthero［J］. Plant Cell Reports，1999，18（10）：858-862.

［50］Shatskaya O A，Zabirova E R，Shcherbak V S. Autodiploi d lines as sources of haploid spontaneous diploidization in corn［J］. Maize Genetics Cooperation Newsletter，1994，68：51-52.

［51］魏俊杰，張曉麗，陳梅香，劉志增，祝麗英. 6葉期秋水仙素注射處理玉米單體的加倍效果研究［J］.玉米科學(xué)，2007，15（4）：49-51.

［52］韓學(xué)莉，唐祈林，榮廷昭. Stock6雜交誘導(dǎo)的玉米單倍體化學(xué)加倍效果研究［J］.玉米科學(xué)，2009，17（1）：22-27.

［53］蔡泉，張建國，趙偉，李樹軍，殷躍. Stock6雜交誘導(dǎo)的玉米單倍體加倍效果研究［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，（11）：1-3.

Study on Maize Haploid Inducing and Doubling Method and Application

WANG Jiang-hao1，YOU Shuai2，ZHAO Ai-ju1，GAO Zeng-yu1，CHEN Xi-yong1，GUAN Zhong-bo1*
（1.Institute of Cereal and Oil Crops，Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Hebei Crop Hered-itary Breeding Laboratory，Shijiazhuang 050035，China；2.Green Food Office of Hebei Agriculture Department，Shijiazhuang 050011，China）

Abstract：The gynogenesis-inducer lines were used to induce maternal haploid，and this technology had been widely used in maize breeding，which accelerated the breeding process. The concept of haploid and its botanical morphology were introduced in this paper. The methods for obtaining and doubling of maize haploid and the screening method for haploid in breeding were introduced，the main way to obtain haploid included distant hybridization，anther culture，microspores culture，physical induction，chemical induction，induction of solitary male reproduction by the indefinite，induction by solitary female reproduction induction system. The doubling method mainly included natural doubling and chemical doubling of haploid. Haploid could be screened by genetic markers，morphological characteristics，flow cytometry and molecular markers. The application value of haploid in shortening breeding period，population improvement，selection of mutants，construction of genetic mapping population，and the purity of the parents of commercial hybrids was discussed. The main problems existed in haploid breeding technology were analyzed，and its application prospect was forecasted.

Key words：Maize；Doubling of maize haploid；Maize haploid inducing；Breeding

中圖分類號：S513

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-1631（2016）01-0070-06

收稿日期：2015-06-15

基金項(xiàng)目：河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（14226305D）；河北省農(nóng)林科學(xué)院特色優(yōu)勢項(xiàng)目（A2015060201）

作者簡介：王江浩（1978-），男，河北定州人，助理研究員，主要從事作物育種研究。E-mail：Jhw78@163.com。

通訊作者：關(guān)中波（1970-），男，河北晉州人，研究員，主要從事農(nóng)業(yè)推廣與良種繁育工作。E-mail：guanzhongbo@126.com。