宋志慧　張?jiān)獔@　柳 寧　李東陽

(青島科技大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院， 山東 青島　266042)

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有機(jī)農(nóng)藥百草枯對金魚藻的生理生化參數(shù)的毒性作用

宋志慧張?jiān)獔@柳 寧李東陽

(青島科技大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院， 山東 青島266042)

摘要：采用靜態(tài)模擬方法，研究了金魚藻(Ceratophyllum demersum L)在不同濃度(0、0.05、0.1、0.15、0.25 mg/L)百草枯脅迫下葉綠素含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶(SOD)和多酚氧化酶(PPO)活性的變化。結(jié)果表明：在百草枯脅迫下，葉綠素和可溶性蛋白含量受到強(qiáng)烈抑制，0.25 mg/L實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，葉綠素含量下降了60.23%，可溶性蛋白含量下降了67.76%；PPO和SOD均為氧化還原酶，金魚藻受百草枯脅迫程度較輕時(shí)，為抵御外界脅迫PPO和SOD活性升高；當(dāng)脅迫程度超過機(jī)體抗氧化防御能力時(shí)，酶活性下降，于是呈現(xiàn)“低促高抑”的變化趨勢。

關(guān)鍵詞：百草枯；金魚藻；葉綠素；SOD；PPO；可溶性蛋白

0引言

農(nóng)藥是一種重要的生產(chǎn)資料，對糧食生產(chǎn)與農(nóng)業(yè)發(fā)展有著重要作用。世界范圍內(nèi)農(nóng)藥防治農(nóng)業(yè)病、蟲、草害挽回的損失占總產(chǎn)量30%[1]。農(nóng)藥經(jīng)噴灑之后，一部分會(huì)直接進(jìn)入大氣，隨降水排入河流中，一部分則滲入泥土，經(jīng)雨水沖刷流入河流湖泊中，繼而進(jìn)入飲用水或進(jìn)入植物動(dòng)物體內(nèi)，影響人類的健康。

根據(jù)農(nóng)藥用途不同可以分為除草劑、殺蟲劑、殺菌劑、殺螨劑等，根據(jù)化學(xué)成分不同可以分為有機(jī)氯類、有機(jī)磷類、酰胺類、氨基甲酸酯類等。

我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)藥的大量使用已經(jīng)對我國水系統(tǒng)造成了嚴(yán)重的危害。經(jīng)調(diào)查，在我國長江流域，尤其是長江中下游地區(qū)因?yàn)槭卟思敖?jīng)濟(jì)作物的大量種植，使得一些有機(jī)磷、氨基甲酸酯類農(nóng)藥得到廣泛使用，因此此地區(qū)農(nóng)藥累積量較高。作為我國七大水系中水質(zhì)最好的水系，其水體也已經(jīng)受到了農(nóng)藥的污染，可見，農(nóng)藥對我國水體的污染形勢已相當(dāng)嚴(yán)峻。

金魚藻(Ceratophyllumdemersum)是多年生沉水草本植物，屬金魚藻科金魚藻屬，在國內(nèi)和世界具有廣泛分布，多生長于淡水池沼，湖泊及河流中，常在1~3 m深的水域中形成密集的水下群落。金魚藻在環(huán)境污染和生態(tài)的治理中有較明顯的作用，例如吸附累積去除水中的重金屬離子[5]，克制水中有害藻類生長[6]，除磷脫氮[7]等。因而國內(nèi)外對于金魚藻的研究也逐漸增多。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

供試植物金魚藻(Ceratophyllumdemersum)來源于江西宿遷市沐陽縣，經(jīng)洗凈后放入曝氣澄清的自來水中馴化3天后，置于7 L桶內(nèi)用1/4 Hoagland營養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)2周，放入25℃恒溫培養(yǎng)箱，光照強(qiáng)度為3000 Lux，光暗比為24：0，隔天更換培養(yǎng)液。

百草枯實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)液由1/4 Hoagland營養(yǎng)液以及200 g/L百草枯原藥稀釋液組成，實(shí)驗(yàn)共設(shè)置5個(gè)濃度梯度，分別為0、0.05、0.1、0.15、0.25 mg/L，每濃度設(shè)4個(gè)平行組，選取長約15~20 cm、鮮重約1 g、生長狀況良好的植株隨機(jī)分組，每組6株，在500 mL燒杯中培養(yǎng)。7天后測定金魚藻的葉綠素的含量、PPD和SOD活性、可溶性蛋白含量。

葉綠素含量的測定：取一定質(zhì)量的金魚藻，吸干水后稱量計(jì)重。將金魚藻放入勻漿器中，加入2 ml 無水乙醇研磨成勻漿，將勻漿移入到10 ml離心管內(nèi)，分別用2 ml無水乙醇沖洗勻漿器并將清洗液一并移入離心管。在4 000 r/min 下離心10分鐘。取上清液到25 ml比色管內(nèi)定容至10 ml[8]。用無水乙醇作為對照，用分光光度計(jì)分別在645 nm、663 nm處測量吸光度。

葉綠素含量的計(jì)算：C(a+b)=(20.21A645+8.02A663)×0.01/G

公式中：C(a+b)為葉綠素含量，mg/g；

A645、A663分別為645 nm 及663 nm處測量的吸光度；

G 為稱量的金魚藻質(zhì)量，g。

多酚氧化酶(PPO)的測定采用改進(jìn)的比色法[9]：

由圖1可以很明顯看出，硬質(zhì)合金與鋼兩側(cè)界面區(qū)內(nèi)有一定的反應(yīng)產(chǎn)物形成。當(dāng)間隙為0.05mm時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物貫穿了整個(gè)焊縫，隨著接頭間隙的增大，反應(yīng)產(chǎn)物越來越不明顯。因此，對界面區(qū)內(nèi)產(chǎn)物及釬縫中心區(qū)的元素構(gòu)成進(jìn)行分析有助于確定界面區(qū)產(chǎn)物的類型及釬焊接頭形成機(jī)理。

(1) PPO提?。悍謩e稱取0.5 g吸干水后的金魚藻，放入勻漿器中，加入2 ml pH 5.5檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液研磨成勻漿，再將勻漿轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，在5000 r/min下離心10 min。取上清液于10 ml比色管中，再加入相應(yīng)體積的pH 5.5檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液使W:V=1:10，即得粗酶液上清液為PPO提取液。

(2) 酶活力檢測：取0.1 ml PPO酶液加入比色皿，加入pH 5.5檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液2.9 ml，再加入0.1 mol/L鄰苯二酚溶液1 ml。迅速測量410 nm處的吸光度變化。以pH 5.5檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液3 mL+0.1 mol/L鄰苯二酚溶液1 mL作為空白，每30 s記錄一次吸光度，測量3 min。1 ml酶液在1 min內(nèi)使吸光度值變化0.001定義為一個(gè)酶活力單位(U/(mL·min)。

超氧化物歧化酶(SOD)的測定采用鄰苯三酚自氧化法[10]。

可溶性蛋白的測定采用考馬斯亮藍(lán)法[11]。稱取不同處理的金魚藻(用吸水紙吸干)1 g于勻漿器中，加入pH=7.8的磷酸緩沖液，磨成勻漿，在5 000 r/min下離心10 min，提取上清液，定容和混勻。吸取定容后的樣品提取液1 ml，放入具塞刻度試管中，加入5 ml考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，充分混合，放置2 min后再595 nm下比色，記錄吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到蛋白質(zhì)含量。

1.3數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)取平均值，用Origin8.5軟件繪圖。用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，在P=0.05的置信水平下對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)。

2結(jié)果與分析

2.1金魚藻在不同濃度的百草枯染毒作用下葉綠素含量的變化

不同濃度百草枯處理下葉綠素含量見圖1。隨著百草枯質(zhì)量濃度的增加，金魚藻體內(nèi)葉綠素含量逐漸減少，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，均存在極顯著差異(p<0.01)。染毒液濃度為0.05 mg/L時(shí)，實(shí)驗(yàn)組葉綠素含量為對照組的94.15%；當(dāng)染毒液濃度大于0.05 mg/L時(shí)，葉綠素含量迅速下降，0.10 mg/L實(shí)驗(yàn)組葉綠素含量僅為對照組的48.15%，隨后葉綠素含量繼續(xù)下降，但下降緩慢，0.25 mg/L實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，葉綠素含量下降了60.23%。百草枯對金魚藻葉綠素的合成起到抑制作用且效果明顯。

圖1　金魚藻在不同濃度百草枯作用下葉綠素的含量(**：表示與對照組差異極其顯著，P<0.01，下同)

2.2金魚藻在不同濃度的百草枯染毒作用下多酚氧化酶(PPO)的變化

不同濃度百草枯處理下金魚藻的PPO活性變化如圖2。金魚藻體內(nèi)PPO活性隨百草枯染毒濃度的升高呈現(xiàn)先增后降的趨勢。低濃度組(0.05 mg/L和0.10 mg/L)染毒液促進(jìn)PPO活性，PPO活性最高為對照組的1.98倍。高濃度組(0.15、0.25 mg/L)染毒液抑制PPO活性。0.25 mg/L實(shí)驗(yàn)組PPO活性僅為對照組的38.41%。且所有實(shí)驗(yàn)組與對照組比較均存在極顯著差異(p<0.01)。PPO活性呈現(xiàn)低促高抑的趨勢，其原因可能是百草枯對植物細(xì)胞的損傷造成金魚藻PPO活性的下降。

圖2　PPO活性受百草枯的影響

2.3金魚藻在不同濃度的百草枯染毒作用下超氧化物酶(SOD)的變化

不同濃度百草枯處理下金魚藻的SOD活性變化趨勢與PPO活性變化趨勢相同，呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(圖3)。低濃度組(0.05、0.10 mg/L)染毒液促進(jìn)SOD活性，SOD活性最高為對照組的2.25倍。高濃度組(0.15、0.25 mg/L)染毒液抑制SOD活性。0.25 mg/L實(shí)驗(yàn)組SOD活性僅為對照組的77.33%。0.15 mg/L實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，存在顯著差異(p<0.05)，其他實(shí)驗(yàn)組與對照組相比均存在極顯著差異(p<0.01)。

圖3　SOD受百草枯的影響

2.4金魚藻在不同濃度的百草枯染毒作用下可溶性蛋白含量的變化

不同濃度百草枯處理下金魚藻的可溶性蛋白含量變化如圖4。金魚藻中可溶性蛋白含量隨百草枯濃度的升高而發(fā)生明顯的下降，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較均存在極顯著差異(p<0.01)。0.05 mg/L實(shí)驗(yàn)組可溶性蛋白含量僅為對照組的73.74%，染毒液濃度為0.25 mg/L時(shí)，可溶性蛋白的含量相對于對照組下降了67.76%，說明百草枯對金魚藻的蛋白質(zhì)合成呈現(xiàn)明顯的抑制作用，并且毒害作用較顯著。

圖4　金魚藻在不同濃度百草枯染毒下可溶性蛋白的含量

3結(jié)論

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的色素，是一項(xiàng)反映植物生長狀況的重要生理生化指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金魚藻中葉綠素的含量隨百草枯濃度的增大而逐漸下降，說明百草枯對金魚藻體內(nèi)葉綠素的合成起到明顯的抑制作用，百草枯濃度>0.05 mol/L時(shí)，金魚藻體內(nèi)葉綠素含量迅速下降，說明百草枯對金魚藻的生長有明顯的抑制作用。

植物細(xì)胞中可溶性蛋白含量作為植物代謝和生理狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)，其變化反映細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、變性及降解等多方面的動(dòng)態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金魚藻中的可溶性蛋白含量隨百草枯濃度的增加逐漸下降，當(dāng)百草枯濃度達(dá)到0.25 mg/L時(shí)，可溶性蛋白的含量相對于對照組下降了67.76%，說明水體中的百草枯會(huì)嚴(yán)重影響金魚藻中蛋白質(zhì)的合成，從而抑制金魚藻的正常生長。

李玲等[16]選擇了浮萍、蘭氏萍、紫萍、金魚藻、水鱉、伊樂藻和菹草7種植物開展了百草枯的敏感性研究，結(jié)果也表明在百草枯的脅迫下，各種植物的POD、CAT、SOD、MAD均呈增加趨勢，可溶性蛋白也都有所降低，且從各個(gè)單一的5個(gè)指標(biāo)分析來看，金魚藻的敏感性排第二。由此得出結(jié)論，金魚藻對于百草枯的脅迫具有靈敏的生理生化反應(yīng)，在實(shí)際應(yīng)用中，金魚藻適合作為水體百草枯污染的表征植物，可用來快速發(fā)現(xiàn)水體中的百草枯污染。

參考文獻(xiàn)

[1] 王未, 黃從建, 張滿成，等.我國水域性水體農(nóng)藥污染現(xiàn)狀研究分析[J]. 環(huán)境保護(hù)科學(xué),2013，39(5)：5-9.

[2] 廖樹盛. 除草劑百草枯的毒理作用及急救治療進(jìn)展[J]. 右江醫(yī)學(xué),2011,39(4):505-507.

[3] 武寶玕, Mitchell E D, Johnson B L，等. 野生種花生葉片內(nèi)超氧化物歧化酶及其抗paraquat特性[J]. 植物生理學(xué)報(bào),1990,16(2):147-152.

[4] 華乃震. 非選擇性除草劑的進(jìn)展和應(yīng)用[J]. 農(nóng)藥市場信息,2011，10(2):7-11.

[5] 馬劍敏,靳萍,吳振斌.沉水植物對重金屬的吸收凈化和受害機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 植物學(xué)通報(bào), 2007,24(2):232-239.

[6] 聶榮,翟建平,王傳瑜，等. 水生生態(tài)系統(tǒng)在污水處理中的應(yīng)用[J]. 環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備,2006，7(6):6-12.

[7] 王丹,張銀龍,龐博. 金魚藻對不同程度污染水體的水質(zhì)凈化效果[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010，34(4):83-86.

[8] 李合生. 現(xiàn)代植物生理學(xué)[M]. 北京：高等教育出版社, 2006：134-137.

[9] 李忠光,龔明.植物多酚氧化酶活性測定方法的改進(jìn)[J].云南師范大學(xué)學(xué)報(bào),2005,25(1):44-45,49.

[10] 李永利, 張焱. 鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2000,10(6):673-676.

[11] 陳少裕.膜脂過氧化對植物細(xì)胞的傷害[J].植物生理學(xué)通訊，1991，27 (2) : 84-90.

[12]ElstnerEF,OsswaldW.Mechanismofoxygenactivationduringplantstress[J].ProceedingsofroyalsocietyofEdinburgh,1994,10(B):131-154.

[13] Foyer C H, Lelandais M, Kunert K J. Photooxidative stress in plant[J]. Physiol Plant,1994,92:696-717.

[14] Cakmak I, Marschner H. Magnesium deficiency enhances resistance to paraquat toxicity in bean leaves[J]. Plant, Cell and Environment, 1992，15(8)：955-960.

[15] 樸仁哲, 趙洪顏, 金玉姬，等. 百草枯脅迫對地黃和苘麻膜脂過氧化及抗氧化酶活性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2008(3):271-274.

[16] 李玲. 長三角地區(qū)農(nóng)藥百草枯對水生高等植物的水生態(tài)基準(zhǔn)研究[D]. 南京：南京師范大學(xué),2012.

Toxic effect of organic pesticide Paraquat on physiological and biochemical indexes ofCeratophyllumdemersumL

Song Zhihui, Zhang Yuanyuan, Liu Ning, Li Dongyang

(Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042, China)

Abstract:A static simulation method was conducted to study the changes of chlorophyll content, soluble protein content, superoxide dismutase (SOD) and polyphenol oxidase (PPO) activity of Ceratophyllum demersum under toxic effects of different concentration (0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.25 mg/L ) Paraquat. The results showed that under Paraquat stress, chlorophyll and soluble protein contents were strongly inhibited, for example, compared with control group, the chlorophyll and soluble protein contents in the 0.25 mg/L experimental group decreased by 60.23% and 67.76% respectively.When Ceratophyllum demersum L. was exposed to lower concentration of Paraquat, PPO and SOD, a kind of oxidoreductases would show higher activity in order to resist the external stress; while for higher concentration of Paraquat, which presented stress exceeding PPO and SOD's antioxidant capacity, the activity would decrease, thus activity of PPO and SOD would be promoted under low stress, and suppressed under high stress.

Keywords:Paraquat; Ceratophyllum demersum L.；chlorophyll；SOD；PPO；soluble protein

中圖分類號：X171.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

作者簡介：宋志慧，男，1972年生，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：生態(tài)毒理學(xué)。E-mail：zyy890616@163.com通訊作者： 張?jiān)獔@， E-mail: 1034180165@qq.com

收稿日期：2015-10-19；2015-12-17修回