■楊　苗　蔡　俊　王常高　杜　馨　林建國

(湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點實驗室工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068)

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響應(yīng)面法優(yōu)化β-甘露聚糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基的研究

■楊苗蔡俊王常高杜馨林建國

(湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點實驗室工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068)

摘要：研究采用響應(yīng)面法對路氏腸桿菌(EnterobacterludwigiiMY271)液體發(fā)酵產(chǎn)β-甘露聚糖酶的培養(yǎng)基進行優(yōu)化。在前期單因素試驗對培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman試驗設(shè)計篩選出影響產(chǎn)酶的3個顯著性因素：魔芋粉、Na2HPO4和MgSO4。在此基礎(chǔ)上，運用最陡爬坡試驗找到中心復(fù)合試驗的中心點，然后研究不顯著因素的最低添加量來降低生產(chǎn)成本，最后利用中心復(fù)合設(shè)計確定顯著性因素之間的交互作用及最佳組成。結(jié)果表明，魔芋粉14 g/l、蛋白胨18 g/l、Na2HPO40.7 g/l、KH2PO40.5 g/l、ZnSO40.15 g/l、MgSO40.01 g/l，β-甘露聚糖酶酶活可達到62.76 U/ml，與模型預(yù)測值相近，且與單因素優(yōu)化后的酶活(30.02 U/ml)相比，提高了109.06%。通過響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基組分，酶活得到了顯著提高，為該酶制劑的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：路氏腸桿菌；β-甘露聚糖酶；響應(yīng)面法；培養(yǎng)基優(yōu)化

β-甘露聚糖是一種非淀粉多糖，為植物性原料中的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子，其在非反芻動物體內(nèi)不能被消化，而且由于甘露聚糖的吸水性高、黏性高，當(dāng)其作為飼料時，將極大地阻礙其他營養(yǎng)成分的吸收[1]。微生物酶制劑作為一種綠色飼料添加劑，因其來源的無害性及其功用的廣泛性，使其在飼料工業(yè)和養(yǎng)殖行業(yè)中得到了普遍重視和廣泛應(yīng)用。β-甘露聚糖酶(β-man?nanase, EC 3.2.1.78)是一種胞外誘導(dǎo)酶，能夠水解含有β-1，4甘露糖苷鍵的甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖為甘露低聚糖[2]。甘露低聚糖作為腸道有益菌雙歧桿菌的增殖因子，能夠促進腸道內(nèi)以雙歧桿菌為代表的有益菌群的增殖，同時抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長[3-4]。飼料中使用β-甘露聚糖酶能降解少量的甘露聚糖，消除抗消化作用和營養(yǎng)因子，提高飼料利用率，加速家畜的生長。同時，β-甘露聚糖酶還廣泛應(yīng)用于烘焙、咖啡萃取、紡織印染、造紙制漿等工業(yè)中[5-7]。

發(fā)酵條件的優(yōu)化是提高微生物產(chǎn)酶量、降低發(fā)酵生產(chǎn)成本的重要途徑。目前，在發(fā)酵條件優(yōu)化過程中，常使用的試驗設(shè)計包括單因素、正交試驗、響應(yīng)面法等[8-9]。而單因素?zé)o法考慮到因素之間的交互作用，正交試驗無法得到全面可靠的水平組合；響應(yīng)面法是采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，因而其被廣泛地應(yīng)用于微生物發(fā)酵條件的優(yōu)化和模型建立中[10-11]。關(guān)叢笑等（2013）[12]采用響應(yīng)面法對費氏新薩托菌G5產(chǎn)β-甘露聚糖酶發(fā)酵過程進行優(yōu)化分析，使產(chǎn)酶水平由最初的14.22 U/ml提高到35.55 U/ml。Lin等(2004)[13]通過黑曲霉(Aspergillusni?gerNCH189)液態(tài)發(fā)酵獲取β-甘露聚糖酶，產(chǎn)酶水平為27.4 U/ml。Yin等（2013）[14]利用CCD中心復(fù)合試驗研究了黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)β-甘露聚糖酶的工藝，酶活達到561.3 U/g。

本研究以實驗室篩選的路氏腸桿菌(Enterobac?terludwigiiMY271)作為出發(fā)菌株，在前期單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對其液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)β-甘露聚糖酶的培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化，以期提高酶活，為后期實現(xiàn)該酶的大規(guī)模生產(chǎn)及其在飼料工業(yè)中的應(yīng)用提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗菌株

本實驗室自行篩選獲得的路氏腸桿菌(Enterobac?terludwigiiMY271)，該菌株已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，專利保藏號為CCTCC M 2015182。

1.1.2主要試劑和儀器

魔芋粉（武漢強森魔芋有限公司）、甘露糖（武漢市華順生物技術(shù)有限公司）、3,5-二硝基水楊酸（DNS）（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、酶標(biāo)儀（Gene Compa?ny Limited）、立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、單人凈化工作臺（SW-CJ-1D型，蘇州凈化設(shè)備有限公司）、臺式高速冷凍離心機3K15（德國Sigma公司）、ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)箱振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.1.3培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/l、牛肉膏3 g/l、NaCl 5 g/l，pH值自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：魔芋粉8 g/l、蛋白胨19 g/l、KH2PO42 g/l、Na2HPO42 g/l、NaCl 0.2 g/l、MgSO40.2 g/l、ZnSO40.2 g/l，pH值自然。

斜面保藏培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/l、牛肉膏3 g/l、NaCl 5 g/l、瓊脂20 g/l，pH值自然。

1.2方法

1.2.1 β-甘露聚糖酶的制備與酶活測定

將9%的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、160 r/min培養(yǎng)48 h，8 000 r/min、4℃離心15 min，即得粗酶液。

DNS法測定β-甘露聚糖酶酶活：以0.5%(w/v)的魔芋純化粉為底物(用0.05 mol/l、pH值為6.4的磷酸鹽緩沖溶液配制)，參照Akino等（1987）[15]的方法，在1.5 ml底物中加入0.5 ml適當(dāng)稀釋的酶液，置55℃水浴反應(yīng)10 min，加入DNS試劑3 ml，置沸水浴中煮沸5 min顯色，然后以流水迅速冷卻，用蒸餾水定容至25 ml，以預(yù)先滅活的酶液為空白對照，最后用酶標(biāo)儀在540 nm處測定吸光值。

酶活定義：在上述測定條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

1.2.2 Plackett-Burman設(shè)計

PB設(shè)計是一種2水平的試驗設(shè)計方法，是以少量試驗次數(shù)挑選出對目的產(chǎn)物有顯著性影響的因素的試驗方法[16]。選用試驗次數(shù)N=12的試驗設(shè)計，選取單因素優(yōu)化試驗中對菌株產(chǎn)β-甘露聚糖酶影響較大的培養(yǎng)基的7個組分，每個因素取高低2個水平，低水平為“-”，高水平為“+”，以β-甘露聚糖酶的酶活(U/ml)為響應(yīng)值Y，共進行12次試驗選取可信度大于95%以上的因素作為影響菌株產(chǎn)β-甘露聚糖酶的主要因素。Plackett-Burman試驗設(shè)計的各因素和水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗因素與水平設(shè)計

1.2.3最陡爬坡試驗

根據(jù)PB試驗所得到的3個顯著性因素，以其正負(fù)效應(yīng)設(shè)定各因素的步長及變化方向進行試驗，從而逼近最大響應(yīng)區(qū)域，找到最大拐點值，確定下一步中心復(fù)合試驗的中心點。

1.2.4最低添加量試驗

對于PB試驗分析得出的不顯著因素，為了盡量減少成本、提高效益及簡化培養(yǎng)基組分，采用單因素試驗確定這些培養(yǎng)基成分最優(yōu)最小的用量。

1.2.5 Central composite design(CCD)響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)PB設(shè)計及最陡爬坡試驗的結(jié)果，通過3因素5水平的試驗設(shè)計來確定路氏腸桿菌的最適培養(yǎng)基成分。CCD試驗可利用有限的試驗次數(shù)，評價各個因素的影響，并分析各個因素之間的相互作用，分析過程中對試驗結(jié)果采用二階經(jīng)驗?zāi)Ｐ蛯?shù)據(jù)進行擬合。CCD試驗自變量水平的編碼值和實際值見表2。

表2中心復(fù)合設(shè)計試驗因素與水平設(shè)計

1.2.6驗證試驗

根據(jù)Design expert 8.0.5對回歸方程在試驗范圍內(nèi)產(chǎn)酶最佳培養(yǎng)基組分濃度進行試驗，將所測定的酶活與響應(yīng)面預(yù)測值進行比較，以驗證模型是否可靠，進而確定最終優(yōu)化培養(yǎng)基組成。

2結(jié)果與分析

2.1 PB試驗結(jié)果與分析

PB試驗設(shè)計結(jié)果見表3。對表3中的試驗結(jié)果進行方差分析和回歸分析，分析結(jié)果見表4和表5。

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計

表4 Plackett-Burman試驗設(shè)計的回歸分析

表5 Plackett-Burman試驗設(shè)計方差分析

由表4可看出，該回歸模型的P值(prob＞F)< 0.000 1，為高度顯著，表明該模型在所得回歸區(qū)域擬合很好。且魔芋粉、Na2HPO4和MgSO4的P值分別為< 0.000 1、0.005和<0.000 1，均小于0.05，則魔芋粉、Na2HPO4和MgSO4在95%的置信區(qū)間內(nèi)高度顯著，而蛋白胨、KH2PO4、NaCl和ZnSO4的P值均大于0.05，則蛋白胨、KH2PO4、NaCl和ZnSO4在95%的置信區(qū)間內(nèi)不顯著。由表5可知，其決定系數(shù)R2=99.42%，表示模型中99.42%的數(shù)據(jù)都能用此模型來解釋，即表示該回歸方程的擬合程度很好。

2.2最陡爬坡試驗

根據(jù)PB試驗的回歸分析和方差分析，按照各因素的正負(fù)效應(yīng)來設(shè)定最陡爬坡試驗(見表6)。魔芋粉為正效應(yīng)，步長2 g/l，Na2HPO4與MgSO4為負(fù)效應(yīng)，步長分別為0.4、0.05 g/l。

由表6可知，第4組試驗時β-甘露聚糖酶酶活最高，即魔芋粉、Na2HPO4和MgSO4的用量分別為14、0.8 g/l和0.05 g/l時，酶活為49.750 U/ml，故選擇魔芋粉、Na2HPO4和MgSO4的添加量分別為14、0.8 g/l和0.05 g/l作為中心復(fù)合設(shè)計的中心點。

2.3最低添加量試驗(見圖1)

對PB試驗得到的4個不顯著因素蛋白胨、KH2PO4、NaCl、ZnSO4做最低添加量試驗，以期達到培養(yǎng)基成分最優(yōu)最小的用量。

由圖1a可知，隨著蛋白胨添加量的增加，β-甘露聚糖酶酶活逐漸增加，當(dāng)添加量為18.0 g/l時，β-甘露聚糖酶酶活達到最大值52.34 U/ml；由圖1b可知，KH2PO4的用量在0.5~2.0 g/l范圍內(nèi)遞增時，β-甘露聚糖酶酶活基本沒有變化，而加入KH2PO4后的酶活高于沒有加入KH2PO4時β-甘露聚糖酶酶活，故選擇KH2PO4的添加量為0.5 g/l；由圖1c可知，隨著NaCl含量的增加，β-甘露聚糖酶酶活基本趨于平衡，為節(jié)省成本，故選擇NaCl添加量為0 g/l；由圖1d可知，隨著ZnSO4添加量的增加，β-甘露聚糖酶酶活逐漸增加，當(dāng)添加量為0.15 g/l時，β-甘露聚糖酶酶活達到最大值55.03 U/ml。故選擇蛋白胨、KH2PO4、NaCl、ZnSO4的添加量分別為18、0.5、0、0.15 g/l。

表6最陡爬坡試驗設(shè)計與結(jié)果

圖1最低添加量的試驗設(shè)計與結(jié)果

2.4中心復(fù)合試驗設(shè)計

經(jīng)PB設(shè)計篩選得到3種顯著影響β-甘露聚糖酶酶活的培養(yǎng)基成分，即魔芋粉、磷酸氫二鈉和硫酸鎂，根據(jù)最陡爬坡試驗得到中心復(fù)合試驗的中心點，即魔芋粉、Na2HPO4和MgSO4的添加量分別為14、0.8 g/l和0.05 g/l。以此3種顯著性因素的濃度（g/l）為自變量，β-甘露聚糖酶的酶活(U/ml)為響應(yīng)值，進行3因素5水平的中心復(fù)合設(shè)計試驗。其設(shè)計及結(jié)果見表7。

表7中心復(fù)合試驗設(shè)計

響應(yīng)面分析中對CCD試驗結(jié)果進行擬合二次模型的方差分析(見表8)。模型的P值(prob>F)小于0.05，說明模型具有顯著性，該二次模型多元相關(guān)系數(shù)R2=93.06%，即預(yù)測僅有6.94%的變異情況不能由該模型解釋；失擬項P值為0.122 1，表明失擬項不顯著，即模型沒有失擬現(xiàn)象。A、C、A2、B2對酶活的影響顯著，AB、AC、BC之間的交互影響均顯著。

表8中心復(fù)合設(shè)計回歸分析

利用軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析后得到模型的二次多項回歸方程：

Y=60.08+1.14A+0.88B-2.24C+2.85AB-1.76AC+ 2.06BC-3.26A2-1.96B2-0.91C2。

式中：Y——β-甘露聚糖酶的預(yù)測值(U/ml)；

A、B、C——分別代表魔芋粉、Na2HPO4和MgSO4的質(zhì)量濃度(g/l)。

根據(jù)Design expert 8.0.5軟件對回歸方程中的交互項AB、AC和BC繪制響應(yīng)面分析圖，觀察其對β-甘露聚糖酶的影響。

圖2魔芋粉和磷酸氫二鈉的交互作用對酶活影響的響應(yīng)面圖

圖3魔芋粉和硫酸鎂的交互作用對酶活影響的響應(yīng)面圖

圖4磷酸氫二鈉和硫酸鎂的交互作用對酶活影響的響應(yīng)面圖

由圖2可知，當(dāng)魔芋粉添加量不變時，隨著Na2HPO4含量的增加，酶活力出現(xiàn)了先增大后減小的趨勢。同樣，當(dāng)Na2HPO4含量不變時，隨著魔芋粉添加量的增加，酶活力也出現(xiàn)了明顯先增大后減小的趨勢，且曲面呈鐘罩型，說明兩者之間交互作用顯著。由圖3可知，當(dāng)MgSO4添加量不變時，魔芋粉含量對酶活存在二次效應(yīng)，其曲面呈現(xiàn)拋物面。由圖4可知，在試驗水平內(nèi)，Na2HPO4和MgSO4存在一定的交互作用，即確定一個因素添加量不變時，另一因素呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。

2.5驗證試驗

通過Design expert 8.0.5軟件對回歸方程求解，預(yù)測菌株產(chǎn)β-甘露聚糖酶的最佳培養(yǎng)基組成為：魔芋粉14 g/l、Na2HPO40.7 g/l、MgSO40.01 g/l，其他培養(yǎng)基成分為：蛋白胨18 g/l、KH2PO40.5 g/l、ZnSO40.15 g/l，在此條件下作3次驗證性試驗，測得β-甘露聚糖酶酶活平均值為62.76 U/ml。實測值與回歸方程預(yù)測值62.69 U/ml相對誤差很小，由此可見，用該回歸模型優(yōu)化EnterobacterludwigiiMY271產(chǎn)β-甘露聚糖酶進行的分析和預(yù)測是可行的，且具有實用價值。此外，與單因素優(yōu)化后的最大酶活力(30.02 U/ml)相比，提高了109.06%。

3　結(jié)論

本研究以實驗室自行篩選并保存的Enterobacter ludwigii MY271，利用響應(yīng)面法對其液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化，得到的最佳培養(yǎng)基組分為：魔芋粉14 g/l、蛋白胨18 g/l、Na2HPO40.7 g/l、KH2PO40.5 g/l、ZnSO40.15 g/l、MgSO40.01 g/l。在此條件下進行3次驗證試驗，試驗結(jié)果與預(yù)測值基本吻合，說明運用響應(yīng)面法優(yōu)化路氏腸桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶是合理可靠的，且酶活與單因素優(yōu)化后的最大酶活力(30.02 U/ml)相比，提高了109.06%，是野生菌株最初酶活(2.87 U/ml)的21.87倍。本試驗通過響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基組分顯著提高了產(chǎn)酶水平，為工業(yè)上實現(xiàn)β-甘露聚糖酶的大規(guī)模生產(chǎn)提供了有價值的參考；同時，其降解得到的甘露低聚糖能夠減少致病菌的產(chǎn)生，且沒有藥物殘留，沒有抗藥性，是良好的飼用抗生素替代品。

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（編輯：劉占，laramie_liu@139.com）

Optimization of fermentation medium for β-mannanase production using response surface methodology

Yang Miao, Cai Jun, Wang Changgao, Du Xin, Lin Jian’guo

Abstract：In this study, response surface methodology (RSM) was employed to optimize a liquid fer?mentation medium for β-mannanase production of Enterobacter ludwigii MY271. Based on single fac?tor experiments used to optimize cultural conditions and the medium, three significant influence fac?tors were screened by the method of Plackett-Burman design as: konjak powder, Na2HPO4, MgSO4.Un?der the conditions, the steepest ascent design was applied to obtain the center point of central compos?ite design. For reducing the source cost, the minimum addition amount experiment was used to find out the minimum addition amount of non-significant factors. And the optimal concentration and corre?lations among three factors were identified by central composite design. The result indicated that the optimal fermentation components for β-mannanase production were as follows: konjak powder 14 g/l, peptone 18 g/l, Na2HPO40.7 g/l, KH2PO40.5 g/l, ZnSO40.15 g/l and MgSO40.01 g/l. The enzyme activi?ty in vertification test reached 62.76 U/ml, consistent with the model predicted value, which is 109.06% higher than that of single factor experiments results. By optimizing the fermentation medium using RSM, the enzyme activity was improved significantly, which lays the foundation for large-scale production of the enzymic preparations.

Key words：Enterobacterludwigii；β-mannanase；RSM；medium optimization

收稿日期：2015-12-07

通訊作者：蔡俊，教授。

作者簡介：楊苗，碩士，研究方向為發(fā)酵過程優(yōu)化與放大。

中圖分類號：Q55

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-991X（2016）04-0048-06

doi:10.13302/j.cnki.fi.2016.04.012