肖婧姍　李洋　李娜　李文薈　崔艷飛　胡曉彤　李亞

【摘 要】目的 研究急性應(yīng)激對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能及腦內(nèi)BDNF表達(dá)的影響。方法 采用足底電擊急性應(yīng)激動(dòng)物模型，通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測試小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力；以免疫組織化學(xué)方法檢測腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）在海馬和前腦皮層的表達(dá)。結(jié)果 與正常對(duì)照組小鼠比較，急性應(yīng)激組小鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05， P<0.01），而在目標(biāo)象限的停留時(shí)間顯著延長（P<0.05）；急性應(yīng)激組小鼠海馬CA1、CA3區(qū)，齒狀回和前腦皮層BDNF的表達(dá)明顯增加（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 急性應(yīng)激導(dǎo)致小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能增強(qiáng)，這可能與海馬和前腦皮層BDNF表達(dá)的上調(diào)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】急性應(yīng)激；空間學(xué)習(xí)記憶；BDNF；海馬；前腦皮層

【Abstract】Objective To study the effects of acute stress on the ability of spatial learning and memory and the expression of brain derived neurotrophic factor （BDNF） in the hippocampus （HP） and prefrontal cortex （PFC） of mice. Methods Using animal model mice induced by single-factor acute stressor （foot shock）. The ability of spatial learning and memory of mice was measured using Morris water maze， and the expressional changes of BDNF in mice brain were detected by immunohistochemical method. Results Compared with control group mice， the escape latency of the acute stress group mice were shorter（P<0.05， P<0.01）， and the swimming time of the platform quadrant of the acute stress group mice were significantly increased in Morris water maze（P<0.05）. The expression of BDNF in the CA1，CA3 region and dentate gyrus of HP and PFC were significantly increased in stress group mice（P<0.05， P<0.01）， compared with control group mice. Conclusion The results indicated that acute stress induced a significant increase in spatial learning and memory ability， and it may be nearly related to the up-regulation of BDNF expression in HP and PFC.

【Key words】Acute stress； Spatial learning and memory； BDNF； Hippocampus； PFC

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor， BDNF）屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子家族，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的海馬、杏仁核、紋狀體和皮層等部位都有豐富的表達(dá)，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞分化、增殖、營養(yǎng)和成熟都具有重要作用。研究表明，BDNF可增強(qiáng)動(dòng)物腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞間的突觸聯(lián)系，從而使學(xué)習(xí)記憶功能增強(qiáng)[1]。外界環(huán)境的改變可引起機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。適度的應(yīng)激可增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力和適應(yīng)能力，對(duì)維持機(jī)體生存具有重要意義，但持久過度的應(yīng)激則會(huì)導(dǎo)致一系列病理現(xiàn)象產(chǎn)生。海馬結(jié)構(gòu)作為邊緣系統(tǒng)中的一個(gè)重要組成部位，是介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)的最重要腦區(qū)之一，參與情緒、學(xué)習(xí)和記憶、行為等功能的調(diào)節(jié)[2]。研究表明，動(dòng)物在急性應(yīng)激期，相關(guān)腦區(qū)的神經(jīng)元仍保持其完整性， 但中樞神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能活動(dòng)加強(qiáng)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，與應(yīng)激關(guān)系密切的腦區(qū)除海馬外，還有前額葉皮層、杏仁核、紋狀體等部位[3]。本研究采用急性應(yīng)激動(dòng)物模型，通過Morris水迷宮檢測小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能的變化，測定小鼠海馬和前腦皮層BDNF的表達(dá)，以探討急性應(yīng)激對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

健康昆明品系小白鼠24只，2月齡，體重18-20g，雌雄各半，由山東魯抗醫(yī)藥公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)小鼠置于自然晝夜節(jié)律光照條件下群養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境，每日撫摸抓捉小鼠，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)人員的操作。將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和急性應(yīng)激組。急性應(yīng)激組采用足底電擊的單一應(yīng)激原（電壓36V，每隔15s刺激一次，每次持續(xù)30s，共30次）；正常對(duì)照組動(dòng)物不接受實(shí)驗(yàn)應(yīng)激原，以同樣的條件飼養(yǎng)。

1.2 Morris水迷宮小鼠學(xué)習(xí)記憶能力檢測

急性應(yīng)激結(jié)束后，對(duì)正常對(duì)照組和急性應(yīng)激組小鼠進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。Morris水迷宮測試程序包括定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)兩部分。水迷宮被均等的分為4個(gè)象限，平臺(tái)置于第一象限（目標(biāo)象限），在水池第三象限周邊壁上做明顯標(biāo)志物，與第一象限平臺(tái)連線為圓形水池一直徑。定位航行試驗(yàn)歷時(shí)2天，每只小鼠每天接受8次找平臺(tái)訓(xùn)練，分兩個(gè)訓(xùn)練周期（上午和下午），每個(gè)訓(xùn)練周期4次，每次對(duì)應(yīng)一個(gè)象限將小鼠入水，每次訓(xùn)練2 min。記錄小鼠尋找到隱藏在水面下平臺(tái)的時(shí)間即逃避潛伏期（escape latency）?？臻g探索試驗(yàn)是在定位航行試驗(yàn)后進(jìn)行，第3天撤除平臺(tái)，從第三象限入水點(diǎn)將小鼠放入水中，記錄2 min內(nèi)小鼠在四個(gè)象限的游泳時(shí)間，檢測小鼠對(duì)原平臺(tái)（目標(biāo)象限）的記憶能力。定位航行試驗(yàn)每個(gè)訓(xùn)練周期前以及空間搜索試驗(yàn)前均對(duì)應(yīng)激組小鼠進(jìn)行足底電擊。

1.3 小鼠海馬和前腦皮層BDNF的表達(dá)

急性應(yīng)激結(jié)束后，對(duì)急性應(yīng)激組和正常對(duì)照組小鼠，用0.4%的戊巴比妥鈉行腹腔麻醉，當(dāng)即打開胸腔，暴露心臟，經(jīng)心快速灌注生理鹽水及預(yù)冷的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液，開顱取腦，后固定2小時(shí)；梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后，行冠狀切片（片厚約5 μm）。切片嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，以PBS（磷酸鹽緩沖液）代替一抗作陰性對(duì)照，試劑盒購自武漢博士德生物公司。每只小鼠選擇海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、齒狀回（DG）和前腦皮層（PFC）切片3張，每片各隨機(jī)取兩個(gè)視野，利用Motic Images Advanced 3.2圖像處理系統(tǒng)測量BDNF陽性神經(jīng)元平均目標(biāo)灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，水迷宮定位航行試驗(yàn)中的逃避潛伏期采用重復(fù)測量的方差分析（one-way repeated -measures ANOVA）；空間搜索試驗(yàn)中的各象限游泳時(shí)間采用單因素方差分析（one-way ANOVA），并以LSD法進(jìn)行組間的兩兩比較。其他數(shù)據(jù)的組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，以P<0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 急性應(yīng)激后小鼠定位航行學(xué)習(xí)能力的變化

在兩天定位航行試驗(yàn)中，正常對(duì)照組和急性應(yīng)激組小鼠的逃避潛伏期均明顯下降；具有顯著性差異（F=8.156， P<0.01）；結(jié)果顯示（表1），與正常對(duì)照組比較，在第一天的訓(xùn)練周期以及第二天的第一個(gè)訓(xùn)練周期，急性應(yīng)激組小鼠的逃避潛伏期均縮短，有顯著性差異（P<0.01，P<0.05）。結(jié)果表明，急性應(yīng)激后小鼠的小鼠的空間學(xué)習(xí)能力明顯增強(qiáng)。

2.2 急性應(yīng)激后小鼠空間搜索記憶能力的變化

在空間搜索試驗(yàn)中，正常對(duì)照組和急性應(yīng)激組小鼠均在目標(biāo)象限（第一象限）停留時(shí)間最長（表2）；且均顯著長于在其它三個(gè)象限的時(shí)間（正常對(duì)照組小鼠F=9.637， P<0.01；急性應(yīng)激組小鼠F=6.846， P<0.01）。與正常對(duì)照組小鼠比較，急性應(yīng)激組小鼠在目標(biāo)象限停留的時(shí)間顯著延長（P<0.05）。結(jié)果表明，急性應(yīng)激可以明顯增強(qiáng)小鼠的空間記憶保持能力以及對(duì)空間定位的準(zhǔn)確性。

2.3 急性應(yīng)激后小鼠海馬和前腦皮層BDNF表達(dá)的變化

免疫組化染色結(jié)果顯示，急性應(yīng)激后，與正常對(duì)照組小鼠相比，急性應(yīng)激組小鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、DG和前腦皮層BDNF的表達(dá)明顯增強(qiáng)；與正常對(duì)照組小鼠相比（表3），急性應(yīng)激組小鼠各腦區(qū)GDNF陽性神經(jīng)元平均目標(biāo)灰度值顯著減少（P<0.01）。

3 討論

在機(jī)體處于不利的環(huán)境條件下可產(chǎn)生一系列的應(yīng)激反應(yīng)。許多研究報(bào)道，適度的應(yīng)激對(duì)機(jī)體有利無害，但過強(qiáng)、持久的應(yīng)激可影響和改變中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與行為相關(guān)的神經(jīng)元形態(tài)和功能。有研究報(bào)道，當(dāng)人或動(dòng)物處于強(qiáng)烈的急性應(yīng)激或長期慢性應(yīng)激時(shí)，其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能可受到明顯的影響，特別是引起海馬功能的損害，學(xué)習(xí)記憶能力顯著損傷[4]。短暫的急性應(yīng)激可提高動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力，但也有研究報(bào)道，急性應(yīng)激可減弱動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶[5]，這種差異可能與采用的應(yīng)激強(qiáng)度及方式不同有關(guān)。在腦內(nèi)，海馬、前腦皮層、杏仁核等部位是與應(yīng)激和學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的區(qū)域。有研究表明，急性應(yīng)激對(duì)海馬的形態(tài)結(jié)構(gòu)沒有明顯影響，提示急性應(yīng)激對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響可能只涉及突觸傳遞效能的可塑性變化。在本研究中，急性應(yīng)激后小鼠的逃避潛伏期明顯縮短，且目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著延長，結(jié)果說明急性應(yīng)激明顯增強(qiáng)小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能。

BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子的一種。有研究報(bào)道，BDNF可調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的生存、生長、分化和凋亡，增加神經(jīng)細(xì)胞間的突觸聯(lián)系，能有效防止神經(jīng)元的變性及死亡。因此，它是維持神經(jīng)元功能和再生修復(fù)及防止神經(jīng)元退行性病變等多方面發(fā)揮重要作用的細(xì)胞因子[6]。也有研究報(bào)道，BDNF對(duì)神經(jīng)元的可塑性也具有一定的影響作用[7]。研究表明，BDNF mRNA高表達(dá)區(qū)在海馬、上丘和大腦皮層，并且在海馬內(nèi)其表達(dá)量可達(dá)神經(jīng)生長因子（NGF）的50倍[8]。我們先前的研究表明[9]，慢性應(yīng)激導(dǎo)致小鼠Morris水迷宮空間學(xué)習(xí)記憶功能受損，海馬各區(qū)及前腦皮層BDNF表達(dá)降低。而在本研究中，給予小鼠足底電擊急性應(yīng)激后，應(yīng)激組小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)，腦海馬和前腦皮層BDNF的表達(dá)明顯增加。結(jié)果表明，急性應(yīng)激后，引起小鼠海馬和前腦皮層神經(jīng)元功能活動(dòng)發(fā)生明顯變化?？梢酝茰y，BDNF可能參與了急性應(yīng)激對(duì)機(jī)體空間學(xué)習(xí)記憶的影響；急性應(yīng)激所致小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的改變可能與BDNF表達(dá)的上調(diào)密切相關(guān)。

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[責(zé)任編輯：楊玉潔]