江金蘭，葉 煒*，李永清，范志敏，雷伏貴(.三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院藥用植物研究所,福建沙縣 365509; .福建泰寧紅石山生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司,福建泰寧 354400)

?

福建泰寧野生鐵皮石斛ISSR親緣關(guān)系分析

江金蘭1，葉 煒1*，李永清1，范志敏2，雷伏貴1
(1.三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院藥用植物研究所,福建沙縣 365509; 2.福建泰寧紅石山生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司,福建泰寧 354400)

摘 要：利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對158份福建省泰寧縣野生鐵皮石斛(Dendrobium officinale)單株進(jìn)行親緣關(guān)系分析。結(jié)果顯示,11條ISSR引物在158份樣本中共擴(kuò)增條帶189條,多態(tài)性比率達(dá)91.7%,表明泰寧野生鐵皮石斛樣本間存在極為豐富的遺傳多樣性; UPGMA樹狀圖分析顯示,樣本總體遺傳距離介于0～0.58,在遺傳距離0.43處,158份福建省泰寧野生鐵皮石斛樣本被分為4個類群,具有較高的物種多樣性。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛;親緣關(guān)系; ISSR;遺傳多樣性

DOI 10.16178/j.issn.0528-9017.20160221

鐵皮石斛(Dendrobium officinale)為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)多年生附生草本植物,生于海拔1 600 m的山地半陰濕的巖石上,喜溫暖濕潤氣候和半陰半陽的環(huán)境。鐵皮石斛主要產(chǎn)于安徽西南部、浙江東部、福建西部、廣西西北部、四川、云南東南部等地［1］。因生長周期緩慢,野生鐵皮石斛極難存活,已被列入重點(diǎn)保護(hù)的珍稀瀕危藥用植物。鐵皮石斛因表皮鐵綠色而得名,具有獨(dú)特的藥用價值,以其莖入藥,屬補(bǔ)益藥中的補(bǔ)陰藥,《中國藥典》指其具有益胃生津、滋陰清熱的功效［2］,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)指其擁有增強(qiáng)免疫功能、降低血糖血脂、抗腫瘤、滋養(yǎng)肌膚、抗衰老等功效。

福建省地處東南沿海,為南亞、中亞熱帶氣候區(qū)的交疊地帶,境內(nèi)武夷山、戴云山兩大山脈的屏障及臺灣海峽暖流作用,形成地形復(fù)雜、雨量充沛的地理環(huán)境,為石斛屬植物的生長提供了極佳的生境［3］。泰寧縣位于武夷山脈中段的杉嶺支脈東南側(cè),海拔落差大,境內(nèi)大量丹霞地貌以丘陵及山地形式分布,蘊(yùn)藏有豐富的野生鐵皮石斛資源,并在外觀上與現(xiàn)有鐵皮石斛栽培品種呈現(xiàn)豐富的多樣性。DNA分子標(biāo)記技術(shù)作為傳統(tǒng)分類的補(bǔ)充,可減少由于形態(tài)描述和環(huán)境條件產(chǎn)生的誤差,從分子水平鑒定個體和群體間的差異; DNA分子標(biāo)記技術(shù)在石斛上的應(yīng)用主要集中在遺傳穩(wěn)定性［4-6］、種間鑒定［7-11］以及野生居群分析［12-19］等方面。本研究以福建省泰寧縣采集的158份野生鐵皮石斛單株為試驗材料,利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對其遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行分析,了解福建泰寧野生鐵皮石斛的生物多樣性,對該地區(qū)野生鐵皮石斛資源的保護(hù)和利用具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗材料

本試驗所用的材料為從福建泰寧采集的野生鐵皮石斛單株158份(部分樣本如圖1),由福建泰寧紅石山生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

1.1.2生化試劑

Taq酶和Marker購自上海寶生物工程有限公司,瓊脂糖、SDS、ISSR引物購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司。

1.2方法

1.2.1DNA的提取

采用改良CTAB小量法提取鐵皮石斛葉片的總DNA。具體步驟為:取幼嫩葉片0.1 g,加液氮研磨至粉末狀,轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中;加800 μL 70℃預(yù)熱的提取緩沖液,振蕩混勻,于70℃水浴鍋溫浴5～10 min,期間不時輕搖;加入400 μL氯仿,顛倒混勻3～5 min; 12 000 g,4℃離心5 min,棄上清,用75%預(yù)冷的乙醇漂洗2次;晾干,加入50 μL ddH2O,常溫下溶解; -20℃中保存?zhèn)溆谩?.2.2 ISSR引物篩選及擴(kuò)增

圖1　福建泰寧野生鐵皮石斛的部分單株

隨機(jī)抽取3個鐵皮石斛樣本混合,對100條隨機(jī)ISSR引物進(jìn)行初步篩選,篩選出清晰、重復(fù)性好的ISSR引物,再用所有鐵皮石斛的DNA樣本進(jìn)行進(jìn)一步篩選,最終篩選出條帶豐富、清晰的ISSR引物11條作為正式擴(kuò)增的引物(表1)。

ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系20 μL:ddH2O 9 μL,2×Taq MasterMix 9 μL,引物1 μL,模板DNA 1 μL。ISSR-PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性4 min,94℃變性45 s,不同退火溫度下退火45 s,72℃延伸2 min,40個循環(huán),72℃延伸10 min,4℃保存PCR產(chǎn)物。2%瓊脂糖凝膠電泳分離擴(kuò)增電泳產(chǎn)物,EB染色,凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照記錄。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

1.3.1數(shù)據(jù)統(tǒng)計

ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)成像儀拍照,同一引物擴(kuò)增、電泳遷移率一致的條帶被認(rèn)為具有同源性,利用人工方法進(jìn)行統(tǒng)計,將擴(kuò)增產(chǎn)物在相同遷移位置清晰的條帶賦值為1,沒有或不易分辨的條帶賦值為0,用Excel建立原始數(shù)據(jù)矩陣。

1.3.2數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用DPS 7.05軟件進(jìn)行聚類分析,生成UPGMA (un-weighted pair group method with arithmetic mean)聚類圖。

2　結(jié)果與分析

2.1ISSR標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果

從100條ISSR引物中篩選出11條條帶豐富清晰的ISSR引物(表1),利用這些引物對158份福建泰寧野生鐵皮石斛單株進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增。結(jié)果(圖2)表明,11條引物共擴(kuò)增條帶189條,多態(tài)性比率達(dá)91.7%,單條引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶數(shù)在12～22,平均17.2條,其中擴(kuò)增出最多條帶的引物是I73,共擴(kuò)增出條帶22條,ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大多在100～2 500 bp。

表1　ISSR分子標(biāo)記引物

2.2福建泰寧野生鐵皮石斛樣本聚類分析

PCR擴(kuò)增結(jié)果采用Excel按0和1記錄后,使用DPS 7.05軟件分析其遺傳距離,得到UPGMA親緣關(guān)系的樹狀圖(圖3)。結(jié)果表明,樣本間遺傳距離介于0～0.58;在遺傳距離0.43處,158份福建省泰寧野生鐵皮石斛樣本被分為4個類群,第Ⅰ類群為樣本41,54,113號,第Ⅱ類群為135,151號,第Ⅲ類群為64,153號,第Ⅳ類群為其余151份樣本,其中,僅4號和52號、139號和161號、115號和121號、207和215號、208和212號、46和81號之間的遺傳距離較近,其余樣本間呈現(xiàn)較大的遺傳距離。

圖2　ISSR引物I73 PCR擴(kuò)增圖譜

圖3　福建泰寧野生鐵皮石斛樣本的UPGMA聚類分析樹

3　討論

福建省是鐵皮石斛的原產(chǎn)地之一［2］,據(jù)林建麗［3］對福建省野生石斛屬植物分布及生境調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),鐵皮石斛多分布在邵武、寧化、泰寧、建寧、將樂等地。雖然泰寧縣野生鐵皮石斛的民間采集與利用歷史悠久,但對該地區(qū)的鐵皮石斛的種質(zhì)資源多樣性的調(diào)查與分析還未見報道。丁鴿等［17-18］利用RAPD和SRAP標(biāo)記技術(shù)對不同居群鐵皮石斛的遺傳多樣性進(jìn)行評價,結(jié)果表明鐵皮石斛種內(nèi)多態(tài)性水平較高,可達(dá)91.35% (RAPD)和88.01% (SRAP);包英華等［19］利用SRAP技術(shù)分析8個居群鐵皮石斛的遺傳多樣性,結(jié)果表明鐵皮石斛種質(zhì)資源遺傳多樣性水平較高,總多態(tài)性條帶比率為96.46%。本試驗以源自福建省泰寧縣158份野生鐵皮石斛單株為材料,利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù),從100條引物中篩選出11條條帶豐富清晰的ISSR引物,利用這些引物對158份福建泰寧野生鐵皮石斛單株進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增,共擴(kuò)增條帶189條,多態(tài)性比率達(dá)91.7%,該結(jié)果與前人的研究結(jié)果基本一致。

從聚類分析的結(jié)果看,源自福建泰寧的158份野生鐵皮石斛樣本間遺傳距離介于0～0.58之間,在遺傳距離0.43處,158份福建省泰寧野生鐵皮石斛樣本被分為4個類群,表明雖然泰寧野生鐵皮石斛各樣本源自同一地區(qū),但是各樣本間呈現(xiàn)較為復(fù)雜的遺傳結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果表明,泰寧野生鐵皮

石斛種群具有豐富的遺傳多樣性,但由于近年來破壞性采集,野生資源急劇減少,對本地區(qū)野生鐵皮石斛進(jìn)一步的研究和保護(hù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

參考文獻(xiàn):

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:265-266.

［2］中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志:第十九卷［M］.北京:科學(xué)出版社,1999:117.

［3］林建麗.福建省野生石斛屬植物分布及生境調(diào)查研究［J］.林業(yè)勘察設(shè)計,2009 (2):13-16.

［4］楊春勇,李學(xué)蘭,王云強(qiáng),等.人工栽培石斛的ISSR標(biāo)記分析［J］.中國農(nóng)學(xué)通報,2011,27 (4):148-152.

［5］李霞,何濤,淳澤,等.石斛組培苗遺傳差異性ISSR檢測［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,2013,19 (2):249-254.

［6］江金蘭,葉煒,李永清,等.同源四倍體鐵皮石斛的生長及多糖積累［J］.植物生理學(xué)報,2014,50 (4):519-526.［7］沈穎,徐程,萬小鳳,等.ISSR-PCR在石斛種間鑒別中的應(yīng)用［J］.中草藥,2005,36 (3):423-427.

［8］沈潔.DNA序列、ISSR標(biāo)記在藥用植物種質(zhì)鑒別中的應(yīng)用［D］.南京:南京師范大學(xué),2005.

［9］沈穎.石斛類ISSR標(biāo)記研究與ITS序列分析［D］.杭州:浙江大學(xué),2004.

［10］盧家仕,卜朝陽,呂維莉,等.20份蘭科植物的ISSR遺傳多樣性分析［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,2012 (6):2252-2257.

［11］盧家仕,卜朝陽,呂維莉,等.不同產(chǎn)地石斛屬種質(zhì)資源的ISSR遺傳多樣性分析［J］.中草藥,2013 (1):96-100.

［12］沈潔,丁小余,丁鴿,等.鐵皮石斛居群差異的研究ⅡISSR指紋標(biāo)記方法的建立與優(yōu)化［J］.中國中藥雜志,2006 (4):291-294.

［13］沈潔,徐慧君,袁英慧,等.鐵皮石斛野生居群基于RAMP標(biāo)記的遺傳多樣性評價［J］.藥學(xué)學(xué)報,2011 (9):1156-1160.

［14］SHEN J,DING X Y,LIU D Y,et al.Intersimple sequence repeats (ISSR ) molecular fingerprinting markers for authenticating populations of Dendrobium officinale Kimura et Migo［J］.Biological & Pharmaceutical Bulletin,2006,29 (3):420-422.

［15］馬佳梅,殷壽華.西雙版納地區(qū)流蘇石斛遺傳多樣性的ISSR分析［J］.云南植物研究,2009,31 (1):35-41.

［16］曾淑華,蕭鳳回,查應(yīng)洪,等.云南文山鐵皮石斛居群的初步評價［J］.時珍國醫(yī)國藥,2012,23 (2):468-470.

［17］丁鴿,丁小余,沈潔,等.鐵皮石斛野生居群遺傳多樣性的RAPD分析與鑒別［J］.藥學(xué)學(xué)報,2005,40 (11):1028-1032.

［18］DING G,ZHANG D Z,DING X Y,et al.Genetic variation and conservation of the endangered Chinese endemic herb Dendrobium officinale based on SRAP analysis［J］.Plant Systematics and Evolution,2008,276 (3):149-156.

［19］包英華,潘超美,白音,等.鐵皮石斛種質(zhì)資源遺傳多樣性的SRAP分析［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2014,37 (5):349-353.

(責(zé)任編輯：張 韻)

通信作者:葉 煒(1980—),男,副研究員,博士,主要從事園藝植物生物技術(shù)研究工作,E-mail:yewei922@qq.com。

作者簡介:江金蘭(1973—),女,福建泰寧人,高級農(nóng)藝師,主要從事園藝植物生物技術(shù)研究工作,E-mail:420465520@qq.com。

基金項目:國家級星火計劃項目(2014GA720032);福建省種業(yè)創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化工程項目(FJZZZX-1540);福建省三明市科技計劃項目(2014-N-3);三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院院立項目(2013-Y-01)

收稿日期:2015-09-15

中圖分類號：S567

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0528-9017(2016)02-0208-03

文獻(xiàn)著錄格式:江金蘭,葉煒,李永清,等.福建泰寧野生鐵皮石斛ISSR親緣關(guān)系分析［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,57 (2):208-210,213.