李夢杰， 劉蘇珍， 周 斌， 崔小弟， 陳振華

（江西科技師范大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌330013）

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HPLC法同時(shí)測定荷葉中的荷葉堿、蘆丁、槲皮素

李夢杰， 劉蘇珍， 周 斌*， 崔小弟， 陳振華

（江西科技師范大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌330013）

摘要：目的 建立HPLC法同時(shí)測定荷葉中荷葉堿、蘆丁、槲皮素的含有量。方法 荷葉甲醇提取液采用依利特hypersi1ODS2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分析；流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B，含0.3％磷酸和0.4％三乙胺），梯度洗脫（0～10 min，14％ A；10～17 min，14％～5％ A；17～25 min，5％～14％ A；25～50 min，14％ A；50～75 min，14％～34％ A）；體積流量1.0 m L/min；檢測波長256 nm；柱溫25℃。結(jié)果 荷葉堿、蘆丁、槲皮素分別在0.015～0.300 μg（r=0.999 9）、0.012～0.240 μg（r=0.999 9）、0.010 4～0.208 μg（r=0.999 9）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率（n =6）分別為99.7％（RSD=1.3％）、100.0％（RSD=1.4％）、100.1％（RSD=1.6％）。結(jié)論 該方法可用于荷葉的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：荷葉；荷葉堿；蘆?。婚纹に?；HPLC

荷葉為睡蓮科植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥葉，其味苦，性平，歸肝、脾、胃經(jīng)，清暑化濕，升發(fā)清陽，涼血止血，用于暑熱煩渴，暑濕泄瀉，血熱吐衄，便血崩漏［1］，其中荷葉堿和黃酮是荷葉的兩大主要活性成分［2-3］。藥理研究表明，荷葉具有降脂減肥、抑菌、抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗炎抗過敏等作用［4］，目前關(guān)于其有效成分的單組分以及同類中多組分含有量測定的報(bào)道相對較多［5-13］，但對不同類有效成分中多組分同時(shí)進(jìn)行含有量測定的研究則未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法，用于同時(shí)測定荷葉中3種有效成分，包括1個(gè)生物堿類化合物荷葉堿和2個(gè)黃酮類化合物蘆丁、槲皮素的含有量，該方法簡便準(zhǔn)確，可以用來更好地控制和完善荷葉藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agi1ent1260高效液相色譜儀，包括高壓四元泵（G-1311C）、自動(dòng)進(jìn)樣器（G-1329B）、智能化柱溫箱（G-1316A）、二極管陣列檢測器（G-4212B）、Agi1ent1260 series色譜工作站（美國安捷倫科技公司）；XS205（0.01 mg）、XS203S （1 mg）電子天平（瑞士Mett1er To1edo公司）；KQ-200VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 荷葉堿（批號YM0507YA14）、蘆丁（批號YM0316SA13）對照品（上海源葉生物科技有限公司）；槲皮素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100081-200406）。荷葉購自安徽普仁中藥飲片有限公司，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院鄧可眾副教授鑒定為睡蓮科植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥葉。甲醇、乙腈均為色譜純（西隴化工股份有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 E1ite hypersi1 ODS2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B，含0.3％磷酸和0.4％三乙胺），梯度洗脫（0～10 min，14％ A；10～17 min，14％～5％ A；17～25 min，5％～14％ A；25～50 min，14％ A；50～75 min，14％～34％ A）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長256 nm；柱溫25℃?；旌蠈φ掌泛凸┰嚻飞V圖見圖1。

A.混合對照品 B.供試品 1.蘆丁 2.荷葉堿 3.槲皮素A.mixed reference substances B.samp1es 1.rutin 2.nuciferine 3 quercetin圖1　混合對照品及荷葉樣品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s ofm ixed reference substances and Nelumbinis Folium samp les

2.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取荷葉堿、蘆丁、槲皮素15.00、12.00、10.40 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，作為對照品貯備液。再分別量取2 mL，置于同一100 mL量瓶中，甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取荷葉樣品粉末（過3號篩）0.500 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（200 W、45 kHz）1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液，0.22 μm有機(jī)微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，將上述混合對照品溶液分別進(jìn)樣0.5、1、2、4、6、8、10 μL，以進(jìn)樣質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)（X），色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，Y荷葉堿=1 816.7X-0.960 5（r=0.999 9）、Y蘆丁=2 540.1X-0.512 4 （r=0.999 9）、Y槲皮素=3 357.4X-0.536（r= 0.999 9），表明荷葉堿、蘆丁、槲皮素分別在0.015～0.300、0.012～0.240、0.010 4～0.208 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液10 μL，注入HPLC色譜儀，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果，荷葉堿、蘆丁、槲皮素的峰面積RSD分別為0.19％、0.22％、0.22％，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液適量，0.22 μm微孔濾膜濾過后，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測定。結(jié)果，荷葉堿、蘆丁、槲皮素的峰面積RSD分別為0.37％、0.54％、0.78％，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一荷葉樣品粉末6份，每份約0.500 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過后，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL。結(jié)果，荷葉堿、蘆丁、槲皮素的峰面積RSD分別為0.17％、0.22％、0.24％，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的荷葉樣品粉末6份，每份約0.250 g，分別精密加入荷葉堿（245.15 μg/mL）對照品溶液1 mL、蘆丁（106.07 μg/mL）對照品溶液1 mL、槲皮素（90.06 μg/mL）對照品溶液0.5 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾后，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1　加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of recovery tests（n=6）

2.9 樣品測定 精密稱取3批荷葉樣品粉末，每批3份，每份0.500 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過后，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL測定，結(jié)果見表2。

3 討論

在優(yōu)化荷葉藥材提取條件時(shí)，分別考察了20、40、60、80 min超聲時(shí)間。結(jié)果表明，隨著超聲時(shí)間的延長，荷葉樣品中這3種成分的含有量逐漸增大，但60 min后逐漸呈下降趨勢，因此60 min為最佳超聲時(shí)間。另外，還分別考察了20、40、60、80、100倍量超聲體積的甲醇，結(jié)果表明，100倍量的甲醇提取效果最佳。

表2　樣品中3個(gè)化合物的含有量（n=3）Tab.2 Contents of three compounds in samples（n=3）

荷葉堿、蘆丁、槲皮素經(jīng)過紫外吸收波長測定后，分別以256、266、270 nm作為HPLC檢測波長進(jìn)行比較。結(jié)果表明，在256 nm下，3種物質(zhì)的檢測靈敏度均較高，因此選擇256 nm作為檢測波長。

色譜條件優(yōu)化時(shí)，分別以乙腈-0.1％冰醋酸、乙腈-0.1％磷酸、乙腈-水（含0.1％冰醋酸和0.2％三乙胺）、乙腈-水（含0.1％磷酸和0.2％三乙胺）、乙腈-水（含0.3％磷酸和0.4％三乙胺）作為流動(dòng)相進(jìn)行考察。結(jié)果表明，以乙腈-水（含0.3％磷酸和0.4％三乙胺）為流動(dòng)相時(shí)，荷葉樣品中這3種成分的峰形均較好，分離度高。

荷葉堿屬于生物堿類，而蘆丁、槲皮素屬于黃酮類，均具有較好的生物活性，但《中國藥典》2010年版一部僅以荷葉堿的含有量作為控制荷葉藥材質(zhì)量的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)建立的方法可同時(shí)對以上3種成分進(jìn)行分析，有助于更全面地控制荷葉藥材的質(zhì)量。

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Simultaneous determ ination of nuciferine，rutin and quercetin in Nelumbinis Folium by HPLC

LIMeng-jie， LIU Su-zhen， ZHOU Bin*， CUIXiao-di， CHEN Zhen-hua
（School of Pharmacy，Jiangxi Science and Technology Normal University，Nanchang 33OO13，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish amethod for the simu1taneous determination of nuciferine，rutin and quercetin in Nelumbinis Folium by HPLC.METHODS The ana1ysis of N.Folium methano1ic extract was performed on E1ite hypersi1ODS2 co1umn（4.6 mm×250 mm，5 μm），mobi1e phase was acetonitri1e（A）-water containing 0.3％ phosphoric acid and 0.4％ triethy1amine（B）with gradient e1ution（0 -10 min，14％ A；10 -17 min，14％ -5％ A；17 -25 min，5％ -14％ A；25 -50 min，14％ A；50 -75 min，14％ -34％ A），f1ow rate was 1.0 mL/min，detection wave1ength was setat256 nm，and co1umn temperature wasmaintained at25℃.RESULTS The ca1ibration curves of nuciferine，rutin and quercetin were within the ranges of 0.015 -0.300 μg （r=0.999 9），0.012 -0.240 μg（r=0.999 9）and 0.010 4 -0.208 μg（r=0.999 9），respective1y.Their average recoveries（n =6）were 99.7％（RSD was 1.3％），100.0％（RSD was 1.4％）and 100.1％（RSD was 1.6％），respective1y.CONCLUSION Thismethod can be used for the qua1ity contro1of N.Folium.

KEY WORDS：Nelumbinis Folium；nuciferine；rutin；quercetin；HPLC

*通信作者：周 斌（1970—），男，博士，副教授，主要從事中藥活性成分研究。Te1：15870664871，E-mai1：tju-zhoubin@163.com

作者簡介：李夢杰（1988—），女，碩士，主要從事天然藥物活性成分研究。Te1：15779576179，E-mai1：1imengjie-com@163.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81560635）

收稿日期：2015-08-20

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.024

中圖分類號：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）01-0111-04