董紅敏， 李 路， 沈麗雯， 李 玉， 李慧妍， 秦 文

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014）

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川明參中蛋白與多糖的同步提取及抗氧化性測定

董紅敏， 李 路， 沈麗雯， 李 玉， 李慧妍， 秦 文*

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014）

摘要：目的 利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波輔助同步提取川明參渣中蛋白和多糖工藝，并探究其體外抗氧化活性。方法 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計對超聲輔助提取條件進行優(yōu)化。考察提取劑pH、超聲功率、超聲時間、液料比、超聲溫度對蛋白和多糖得率的影響。然后，采用DPPH法測定蛋白和多糖的抗氧化性。結(jié)果 川明參蛋白和多糖超聲波輔助同步提取的最佳條件為超聲功率225 W、超聲時間38 min、液料比20∶1、超聲溫度49℃。在此工藝條件下，川明參蛋白和多糖得率分別為（24.17±0.84）mg/g和（25.92±0.67）％。而且，川明參蛋白和不同類型的川明參多糖均具有較強的抗氧化性能。結(jié)論 該方法能夠較好地預(yù)測川明參蛋白的得率，可用于指導(dǎo)生產(chǎn)實踐。

關(guān)鍵詞：川明參；蛋白；多糖；抗氧化性；響應(yīng)面分析；超聲提取

川明參是傘形科植物川明參屬植物川明參Chuanminshen violaceum Sheh et Shan的干燥根，又名明參、明沙參、土明參、沙參，是我國特有的單種屬植物，為四川道地藥材［1-2］，具有滋陰補肺，健脾等功效，主治熱病傷陰、肺熱咳嗽、脾虛食少、病后體弱等［2］。川明參中含有多糖、蛋白質(zhì)、香豆素、黃酮、甾醇、有機酸、酚類等化學(xué)成分［3］，其中以多糖含有量為最高，達80％以上，具有抗突變、鎮(zhèn)咳、祛痰、免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞以及抗病毒作用等。另外，粗蛋白含有量高達5％以上，其水解氨基酸總含有量超過3％，各類氨基酸達13種以上，尤其是人體必需的7種氨基酸占總含有量的40％以上，可能是川明參的主要功能成分之一［4-8］，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和保健食品領(lǐng)域，市場前景廣闊。因此，高效提取川明參蛋白和多糖具有重要意義。

目前，川明參多糖和川明參蛋白大多被單獨提取，但由于蛋白總量較低，單獨提取必然增加產(chǎn)品開發(fā)的成本，而采用堿提法可將這兩種成分同時提取出來，并且剩余殘渣仍可用于提取水溶性多糖。因此，為綜合利用川明參資源，本實驗以95％乙醇提取川明參后的殘渣為原料，采用超聲波輔助堿提法同步提取川明參中的蛋白和多糖，通過單因素試驗和響應(yīng)面設(shè)計，探討殘渣中兩者的最佳超聲輔助提取工藝，并對其抗氧化性進行初步探究，可為其提取及綜合開發(fā)利用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 川明參（2013年春由四川閬中供銷社提供）；川明參渣（95％乙醇超聲提取川明參干燥粉后的殘渣）。

牛血清蛋白（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司）；考馬斯亮藍G250（上海寶曼生物科技有限公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，美國Sigma公司）。葡萄糖、石油醚、無水乙醇、濃硫酸、苯酚均為分析純（成都市科龍化工試劑廠）。

FW177中藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；UV-3200掃描型紫外可見分光光度計（上海美普達儀器有限公司）；Sorva1ST16高速冷凍離心機、Heto Power Dry PL3000凍干機（美國Thermo Scientific公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-III循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；101-4恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有效公司）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 川明參蛋白與多糖提取工藝流程如下

原料預(yù)處理：將95％乙醇提取過的川明參渣用石油醚索氏回流脫脂2次，每次6 h，50℃恒溫烘干至質(zhì)量恒定，粉碎，過80目篩。

水溶性蛋白和堿溶性多糖同步提?。悍Q取預(yù)處理的川明參粉5 g，加入一定pH和液料比的氫氧化鈉溶液，在一定超聲功率和溫度下超聲提取一定時間，將混合液用冷凍離心機離心后過濾，取上清液。往里加鹽酸溶液調(diào)pH至川明參蛋白等電點，離心，分別收集沉淀和清液，將前者復(fù)溶，調(diào)pH=7.0，真空冷凍干燥，即得川明參蛋白；將后者減壓濃縮至原體積的1/4，加無水乙醇至含醇量80％，4℃下靜置過夜使沉淀析出，離心，沉淀復(fù)溶，真空冷凍干燥，得川明參堿提多糖。

所得固體殘渣按料液比1∶40，超聲功率140 W，超聲溫度70℃提取45 min［9］。提取液過濾減壓濃縮操作同上，即得川明參水提多糖。堿提多糖用蒸餾水溶解并調(diào)pH至7.0，出現(xiàn)渾濁，混合物用流動水透析3 d，離心，分別收集沉淀與清液，前者干燥后即得堿提水不溶多糖，而后者濃縮醇沉，冷凍干燥，即得堿提水溶性多糖。

1.2.2 測定方法 多糖含有量的測定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標準品，制作標準曲線來測定多糖含有量［9］；蛋白含有量的測定采用考馬斯亮藍染色法［10］；微量凱氏定氮法（食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定，GB5009.5-2010）測定川明參渣中總蛋白的含有量。以提取液中多糖含有量為總多糖含有量，以蛋白和多糖的純度計算粗蛋白和粗多糖中的蛋白和多糖含有量，以兩者得率分別計算為粗蛋白干品中蛋白質(zhì)量和粗多糖干品中多糖質(zhì)量與原料質(zhì)量的比值（蛋白得率以mg/g計，多糖得率以％計）。

1.2.3 川明參蛋白等電點的確定［11］稱取川明參粉10 g，固定其他提取條件，制備川明參蛋白提取液，離心（8 000 r/min）20 min，得上清液，取6份，每份10 mL，加鹽酸調(diào)pH=1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，靜置30 min，再離心（8 000 r/min）20 min，測定上清液中蛋白質(zhì)的含有量，計算川明參蛋白的沉淀率，并繪制沉淀率與pH值的曲線圖，沉淀率最大時的pH值即為川明參蛋白的等電點。

1.2.4 超聲輔助提取工藝參數(shù)的單因素試驗 精密稱取川明參粉5.0 g，固定其他條件（pH=12.5，液料比20∶1，超聲功率200 W，超聲溫度60℃，超聲時間30 min），采用不同堿液pH、料液比、超聲功率、超聲溫度和超聲時間進行超聲波輔助提取試驗，依次考察各提取條件對川明參蛋白和堿溶性多糖得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，采用四因素三水平，選擇超聲功率、超聲時間、液料比和超聲溫度為自變量，以蛋白得率（Y1）和多糖得率（Y2）為響應(yīng)值，對超聲波輔助同步提取川明參蛋白和堿溶性多糖的工藝參數(shù)進行優(yōu)化。響應(yīng)曲面因素與水平表見表1。

表1　響應(yīng)面分析因素與水平

1.2.6 清除DPPH自由基能力的測定 取不同質(zhì)量濃度的待測樣品溶液2.0 mL和0.2 mmo1/L DPPH-乙醇溶液2.0 mL，充分混勻，避光反應(yīng)30 min，95％乙醇調(diào)零，于波長517 nm處測定吸光度。對照組用95％乙醇2.0 mL代替DPPH溶液，空白組為DPPH溶液2.0 mL與蒸餾水（95％乙醇）2.0 mL混合，以BHT為陽性對照，計算DPPH自由基清除率［12］，計算公式如下。反應(yīng)體系吸光度

注：I表示清除率；Ai為樣品組吸光度；Aj為對照組吸光度；Ao為空白組吸光度。

1.2.7 總還原能力的測定 采用鐵離子還原能力測定法［12］，分別往不同質(zhì)量濃度的樣品溶液中加入pH=6.6的磷酸鹽緩沖液（0.2 mo1/L）2.5 mL和1％鐵氰化鉀（K3Fe ［CN］6）溶液2.5 mL，迅速混勻，50℃水浴反應(yīng)20 min，立即冷卻后加入10％三氯乙酸（TCA）溶液2.5 mL，混勻后6 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加蒸餾水2.5 mL和0.1％三氯化鐵（FeC13）溶液0.5 mL，混勻，反應(yīng)10 min，測定其在700 nm波長處的吸光度。吸光度越高，還原能力越強。

2 結(jié)果與分析

2.1 川明參蛋白等電點（圖1） 由圖可知，川明參蛋白的沉淀率隨著pH值的升高，呈先上升后下降的趨勢，在pH=2.0時沉淀率最大，即川明參蛋白質(zhì)的等電點為2.0。在等電點沉淀蛋白后，離心去上清液，沉淀即為純化的川明參蛋白。因此，選擇pH=2.0作為沉淀川明參蛋白等電點。越低，說明清除DPPH自由基能力越強。

圖1　川明參蛋白等電點

2.2 超聲波輔助提取單因素試驗

2.2.1 提取劑pH對川明參蛋白和多糖得率的影響 不同pH對川明參蛋白和多糖得率的影響結(jié)果見圖2。pH在10～12之間時，蛋白和多糖的得率增加顯著，隨后多糖得率略有下降，而蛋白得率在pH=12.5時達到最大，之后得率變化不明顯。由于川明參中多糖含有量較高，蛋白含有量較低，故為提高蛋白得率，后續(xù)試驗選擇pH=12.5來進一步優(yōu)化提取條件。

圖2　pH對川明參蛋白和多糖得率的影響

2.2.2 超聲功率對川明參蛋白和多糖得率的影響 不同超聲功率對川明參蛋白和多糖得率的影響結(jié)果見圖3。隨著超聲功率的增加，川明參蛋白和多糖的得率逐漸增加，當功率分別達到200 W和225 W時，兩者得率達到最大值，隨后開始下降，其原因可能是隨著超聲功率增大，空化作用加強，超聲波對細胞壁的破碎作用增強，兩者的溶出速率加快，得率升高。但功率過大時，空化作用及其伴隨的機械效應(yīng)會破壞兩者的結(jié)構(gòu)，影響得率［13］。因此，超聲功率以175～225 W為宜。

圖3　超聲功率對川明參蛋白和多糖得率的影響

2.2.3 超聲時間對川明參蛋白和多糖得率的影響 不同超聲時間對川明參蛋白和多糖得率的影響結(jié)果見圖4。在10～30 min時，蛋白和多糖的得率隨著超聲時間的增加而明顯提高，隨后呈下降趨勢，其原因可能是隨著時間增加，在超聲波作用下川明參的細胞破碎度逐漸增大，兩者溶出量逐漸增加，得率提高。但超聲波作用時間過長時，其機械剪切作用同樣會破壞兩者的結(jié)構(gòu)，影響得率［14 -15］。因此，超聲波作用時間以30 min為宜。

圖4　超聲時間對川明參蛋白和多糖得率的影響

2.2.4 液料比對川明參蛋白和多糖得率的影響 不同液料比對川明參蛋白和多糖得率的影響結(jié)果見圖5。液料比為20∶1時，川明參蛋白和多糖得率均達到最大值，隨后明顯下降，隨著液料比的增加，固相與液相間濃度差提高，有利于兩者充分溶出［15-16］。當液料比達到一定程度后，在超聲波功率和時間恒定的情況下，其增加會使超聲波空化作用相對降低，從而使得率下降。另外，液料比過大使得濃縮時間過長，導(dǎo)致能耗提高。綜合各方面因素，料液比應(yīng)不大于20∶1。

圖5　料液比對川明參蛋白和多糖得率的影響

2.2.5 超聲溫度對川明參蛋白和多糖得率的影響 不同超聲溫度對川明參蛋白和多糖得率的影響結(jié)果見圖6。隨著溫度升高，川明參蛋白和多糖的得率均呈先升高后下降的趨勢，可能是因為低溫時，超聲波未能使細胞徹底破碎，而隨著溫度的升高，超聲波與溫度的協(xié)同作用進一步破壞了細胞結(jié)構(gòu)，從而使兩者充分釋放。但溫度過高時，這種作用也會引起蛋白的變性和多糖的分解［17］。綜合考慮，超聲溫度應(yīng)控制在40～60℃之間。

圖6　超聲溫度對川明參蛋白和多糖得率的影響

2.3 響應(yīng)面分析法對超聲波輔助提取工藝的優(yōu)化

2.3.1 二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。應(yīng)用Design Expert 8.0.5b數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件對表2實驗結(jié)果進行多元回歸擬合，得超聲輔助提取川明參蛋白得率（Y1）和多糖得率（Y2）對超聲功率（X1）、超聲時間（X2）、液料比（X3）與溫度（X4）的二次多項式回歸模型分別為Y1=23.14 +1.87X1+0.60X2+ 0.65X3-1.52X4-0.21X1X2-0.80X1X3+0.24X1X4+ 0.35X2X3-0.46X2X4-0.10X3X4-1.20X21-0.62X22-1.54X23-2.09X24；Y2=25.26 +1.78X1+0.49X2+0.81X3-0.34X4-0.045X1X2-0.91X1X3+0.86X1X4+0.175X2X3-0.37X2X4+0.1X3X4-1.34 X21-0.068X22-0.94X23-1.13X24

然后，對回歸模型分別進行方差分析，結(jié)果見表3，回歸系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果見表4。

表2　響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表3　回歸模型方差分析

由表3可知，Y1和Y2兩個數(shù)學(xué)模型P＜0.000 1，表明二次回歸方程模型極顯著，模型的相關(guān)系數(shù)R2分別為0.943 6和0.991 0，接近1，模型修正R2（分別為0.887 2 和0.982 1）與預(yù)測R2（分別為0.702 9和0.951 3）均相差不大，表明兩模型實際值與預(yù)測值擬合均較好，且失擬項P分別為0.151 3和0.072 9，大于0.05，失擬項不顯著，實驗誤差較小。因此，兩模型可用于對川明參蛋白和多糖的超聲提取工藝進行分析和預(yù)測。

由表4可知，Y1模型一次項X1、X3、X4，二次項X21、X23、X24對響應(yīng)值Y1影響都極顯著（P＜0.01）；一次項X2、交互項X1X3和二次項X22對Y1影響顯著（P＜0.05）；Y2模型一次項X1、X2、X3、X4，交互項X1X3、X1X4、X2X4，二次項X21、X23、X24對響應(yīng)值Y2影響都極顯著（P＜0.01）。根據(jù)F值大小，可知各因素對川明參蛋白得率的影響的程度依次是超聲功率（X1）＞超聲溫度（X4）＞液料比（X3）＞超聲時間（X2），對川明參多糖得率的影響的程度依次是超聲功率（X1）＞液料比（X3）＞超聲時間（X2）＞超聲溫度（X4）。

表4　回歸系數(shù)的顯著性檢驗

2.3.2 川明參蛋白和多糖同步超聲提取條件的確定 運用Design Expert8.0.5b數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件，可以預(yù)測出蛋白和多糖得率兩個響應(yīng)值均達到最大時各因素的最佳值。結(jié)果，得到最佳超聲輔助提取工藝條件組合為超聲功率219.38 W，超聲時間37.75 min，液料比19.75∶1，超聲溫度48.5℃?？紤]到實際操作的可行性，將超聲輔助提取工藝條件修正為超聲功率225 W、超聲時間38 min、液料比20∶1、超聲溫度49℃。采用上述優(yōu)化條件進行3次驗證實驗，川明參蛋白和多糖的平均得率分別為（24.17± 0.84）mg/g和（25.92±0.67）％，兩者與預(yù)測值基本吻合，表明該模型能較好的預(yù)測川明參蛋白和多糖的得率，可用于指導(dǎo)生產(chǎn)實踐。

經(jīng)微量凱氏定氮法測得川明參渣中總蛋白含有量為（4.24±0.27）％，所得可溶性蛋白占總蛋白的57％，表明該實驗條件下，川明參蛋白的提取率為57％。在最佳提取條件下，采用苯酚-硫酸法測定所得提取液中總多糖含有量為（32.19±2.13）％，川明參多糖的提取率為80.65％。

2.4 川明參蛋白和不同類型川明參多糖的抗氧化活性 由圖7可知，川明參蛋白和不同類型川明參多糖都具有清除DPPH自由基的活性，隨著質(zhì)量濃度的增大，清除DPPH自由基的能力也隨之增強，兩者呈正相關(guān)關(guān)系。當質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時，川明參蛋白、堿提水不溶性多糖、堿提水溶性多糖和水提多糖的清除率分別為75.86％、71.88％、65.03％和60.46％，均表現(xiàn)出良好的清除DPPH自由基能力，IC50分別為0.564、0.516、0.598、0.779 mg/mL，即不同類型川明參多糖清除DPPH自由基的能力的大小順序為堿提水不溶性多糖＞堿提水溶性多糖＞水提多糖。

另外，川明參蛋白和多糖還均表現(xiàn)出一定的還原能力和明顯的量效關(guān)系，吸光度越大，還原能力越強，抗氧化性越好。由圖8可知，川明參蛋白和多糖的還原能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，其還原能力強弱依次為蛋白＞堿提水不溶性多糖＞堿提水溶性多糖＞水提多糖。

圖7　川明參蛋白和川明參多糖對DPPH自由基的清除作用

圖8　川明參蛋白和不同類型多糖的總還原力

3 結(jié)論

本實驗旨在以95％乙醇提取川明參有效成分后的殘渣為原料，采用堿溶酸沉和水提醇沉相結(jié)合的方法同步提取川明參蛋白和多糖，通過單因素和響應(yīng)面試驗優(yōu)化超聲輔助提取工藝，所得最佳工藝參數(shù)為超聲功率225 W、超聲時間38 min、液料比20∶1、超聲溫度49℃。在此工藝條件下，川明參蛋白和多糖得率分別為（24.17±0.84）mg/g和（25.92±0.67）％。通過方差分析，確定各因素對得率的影響程度，其中超聲功率、超聲功率和液料比的交互作用對蛋白和多糖得率的影響均較大。該方法有效避免了由于川明參蛋白總含有量相對較低而導(dǎo)致單獨提取成本較高的問題，可提高原料利用率，大大降低了成本，而且工藝操作簡單方便，提取時間短，得率高，有利于川明參資源的綜合利用，為其多糖和蛋白的進一步開發(fā)利用提供參考。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，許多疾病與體內(nèi)自由基引發(fā)的氧化損傷有關(guān)，而天然抗氧化劑以其安全高效的特點正引起廣大學(xué)者的關(guān)注。川明參作為一種傳統(tǒng)中藥，具有免疫調(diào)節(jié)、抗突變、抗病毒等功效，并含有大量多糖和蛋白，但迄今為止，有關(guān)川明參多糖和蛋白抗氧化活性方面的研究尚未見報道。本實驗通過DPPH法對川明參蛋白和多糖的抗氧化能力進行初步測定，結(jié)果顯示兩者對DPPH自由基均有明顯的清除作用，并且具有一定的還原能力，川明參蛋白、堿提水不溶性多糖、堿提水溶性多糖和水提多糖清除DPPH自由基的IC50值分別為0.564、0.516、0.598、0.779 mg/mL，表明川明參蛋白和多糖具有較強的抗氧化能力。本實驗為川明參蛋白和多糖作為天然抗氧化功能因子提供了理論依據(jù)，為其下一步活性研究與開發(fā)利用提供實驗基礎(chǔ)。

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*通信作者：秦 文（1967—），女，教授，主要從事農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)后處理與品質(zhì)控制研究。Te1：13981616637，E-mai1：qinwen1967@ a1iyun.com.cn

作者簡介：董紅敏（1989—），女，碩士生，主要從事農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)后處理與品質(zhì)控制研究。Te1：18227550988

收稿日期：2014-08-14

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.051

中圖分類號：R284.2

文獻標志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）01-0207-06

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2014-10-31

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detai1/31.1368.R.20141031.1314.001.htm1