付慧英，黃　燦,鄢業(yè)鴻，彭小東，張志謙

(1.中國人民解放軍第94醫(yī)院腫瘤科,南昌 330001； 2.南昌大學第一附屬醫(yī)院a.腫瘤科； b.普外科,南昌 330006; 3.南昌市第三醫(yī)院肝膽外科,南昌330009)

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CHAF1A在肝細胞癌組織中的表達及其臨床意義

付慧英1，黃燦2a,鄢業(yè)鴻2b，彭小東2a，張志謙3

(1.中國人民解放軍第94醫(yī)院腫瘤科,南昌 330001； 2.南昌大學第一附屬醫(yī)院a.腫瘤科； b.普外科,南昌 330006; 3.南昌市第三醫(yī)院肝膽外科,南昌330009)

摘要：目的研究染色質裝配因子1(Chromatin assembly factor 1，CAF-1)的最大亞基p150(CHAF1A)在原發(fā)性肝細胞癌中的表達情況，并分析其表達與原發(fā)性肝細胞癌患者的性別、年齡、病理分化、門靜脈癌栓、腫瘤大小、臨床分期、血清HBsAg狀況、肝硬化及血清AFP水平等臨床病理特征的關系。方法篩選自2010年6月至2014年10月在南昌大學第一附屬醫(yī)院普外科行手術切除，并且全部經過病理診斷證實為原發(fā)性肝細胞癌的患者80例，取對應患者病灶邊緣2 cm處的正常肝組織80例及因外傷或肝內膽管結石行手術切除的正常肝組織患者20例分別作為癌旁和正常對照。應用免疫組織化學檢測CHAF1A在肝癌組織、癌旁肝組織、正常肝組織中的表達，采用χ2檢驗分析CHAF1A在這三組中的表達差異，并分析CHAF1A的表達與肝癌臨床病理特征的關系。結果CHAF1A在正常肝組織和癌旁肝組織的高表達率顯著高于肝癌組織(P<0.05)。CHAF1A在不同病理分化肝癌組織中的高表達率差異有統(tǒng)計學意義(P=0.027)；在有無伴門靜脈癌栓肝臟組織中，高表達率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CHAF1A在肝癌組織中的表達與性別、年齡、臨床分期、腫瘤大小、血清HBsAg、肝硬化及血清AFP水平無相關性(P>0.05)。結論CHAF1A的表達可能影響肝癌組織分化和侵襲性。但與肝癌患者的性別、年齡、臨床分期、腫瘤的大小、HBsAg狀況、肝硬化及血清AFP水平無相關性。

關鍵詞：CHAF1A； 原發(fā)性肝細胞癌； 免疫組化； 門脈癌栓； 低分化

染色質裝配因子1(Chromatin assembly factor 1，CAF-1，一個由p150、p60、p48三個亞基組成的異源三聚體復合物，其主要功能是作為一個組蛋白分子伴侶能沉積H3和H4到新合成的DNA復制叉上，以促進核小體裝配的第一步[1]。隨后有報道CAF-1不但參與DNA合成、修復后染色質裝配，而且在調控異染色質的合成和修復中都扮演著重要的角色[2]。有報道[3]證實，CAF-1特別是p150亞基(后統(tǒng)稱“CHAF1A”)是負責橋接細胞周期進展和激活DNA損傷檢查點的關鍵基因，CAF-1/CHAF1A故障會導致持續(xù)的細胞增殖，抵抗細胞死亡，增加基因組的不穩(wěn)定性，最終表現(xiàn)一個更具侵襲性的癌癥表型。CHAF1A被證實其的表達特性和乳腺癌、前列腺癌、舌癌、大腸癌、神經膠質瘤、膠質母細胞瘤和神經母細胞瘤等[4-12]疾病的發(fā)病機制有關。但目前CHAF1A在肝癌中表達情況的相關研究在國內外很少有報道。

1資料與方法

選自2010年6月至2014年10月在南昌大學第一附屬醫(yī)院普外科行手術切除，并且全部經過病理診斷證實為原發(fā)性肝細胞癌的患者80例，取對應患者病灶邊緣約2 cm處的正常肝組織80例及因外傷或肝內膽管結石行手術切除的正常肝組織患者20例分別作為癌旁和正常對照。病例入組標準：1)所有患者術前均未接受其他治療(包括放療、化療及介入治療等)；2)所選患者都是第1次行肝癌根治性切除術，并且全部經過病理診斷證實為原發(fā)性肝細胞癌；3)術前均行包括三大常規(guī)、生化常規(guī)、血清AFP、血清HBsAg狀況、胸腹部CT(肝增強掃描)、心電圖等術前常規(guī)檢查；4)20例正常肝組織患者手術前都行上述常規(guī)檢查，結果都未見異常。

1.1臨床病理資料

80例肝癌患者中：男72例，女8例；年齡19～72歲，中位年齡為50.72，其中<50歲的30例，≥50歲的50例；按腫瘤的大小分，其中<5 cm的36例，≥5 cm的44例；其中按高、中、低病理分化程度劃分，依次為7、66、7例；按有無伴門靜脈癌栓的劃分，伴有者15例，不伴有者65例；按臨床分期[13]劃分，Ⅰ期18例，Ⅱ期21例，Ⅲ期41例，分為Ⅰ～Ⅱ期 39例和Ⅲ～Ⅳ期 41例2組；按是否伴有肝硬化劃分，伴有者36例，不伴有者44例； AFP<400 ng·mL-1患者50例，AFP≥400 ng·mL-130例；按血清HBsAg表達狀況劃分，陽性者57例，陰性者23例。

本實驗中按Edmondson4級分法[14]把肝細胞癌分3個等級：Ⅰ級為高分化，Ⅱ、Ⅲ級為中分化，Ⅳ級為低分化。

1.2免疫組化

CHAF1A兔抗人單克隆一抗[EPR5576(2)](ab126625)購自英國abcam生物科技公司。多聚賴氨酸、即用型通用二抗sp-9000(sp-9000)、DAB(zli-9032)顯色試劑，都是購自河北博海生物工程開發(fā)有限公司。實驗步驟按試劑盒說明書進行,一抗稀釋度為1：200。以檸檬酸鹽進行抗原修復,4e孵育過夜,DAB顯色,以胞漿染為棕黃色為陽性細胞。本實驗中對3組標本的陰性對照都以PBS代替CHAF1A兔抗人單克隆一抗。

1.3結果判斷

由2位有經驗的病理醫(yī)師采取雙盲法對免疫組織化學檢測結果進行評估，結果評分均采用雙評分半定量法。具體判斷方法和標準如下：

1)染色強度評分標準：根據陽性表達于細胞膜或(和)胞漿上呈現(xiàn)棕黃色顆粒定，不顯色定0分，呈現(xiàn)淡黃色定1分，呈現(xiàn)棕黃色定2分，呈現(xiàn)棕褐色定3分。

2)陽性細胞率評分標準：每張切片上隨機取5個高倍視野，計算陽性細胞的比例進行評分，<5%為0分，5～25%為1分，25～50%為2分，>50%為3分。

3)免疫組化評價標準：將兩分相乘，0分為“-”，1～2分為“+”，3～5分為“”，6分以上為“”。

4)表達水平判斷標準：表達水平為“-～+”定為低表達，表達水平“～”歸類為高表達，高表達比率為表達強陽性率。

1.4統(tǒng)計學方法

所有分析應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學處理，CHAF1A在肝癌組織與相應癌旁肝組織及正常肝組織中高表達率之間的差異分別進行χ2檢驗；并分別對CHAF1A在肝癌組織中表達與肝癌各臨床病理特征之間的相關性采用χ2檢驗進行統(tǒng)計學分析；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1CHAF1A分別在肝癌組織、癌旁肝組織、正常肝組織中表達的比較

檢測CHAF1A在肝癌組織、癌旁肝組織、正常肝組織的表達，結果顯示陽性染色定位于細胞漿中呈彌散或散在分布，細胞核染色為陰性。其中在80例肝癌組織中，有4例胞漿中未見著色，76例標本中CHAF1A呈現(xiàn)不同的陽性表達；而CHAF1A在所有的另外2組組織中都呈現(xiàn)不同的陽性表達。CHAF1A在上述3類組織中的陽性表達率分別為95%(76/80)、100%(80/80)、100%(20/20)，高表達率分別為47.5%(38/80)、87.5%(70/80)、95%(19/20)。(見封四圖1)結果顯示CHAF1A在上述3類組織中的陽性表達率呈上升趨勢；肝癌組織和癌旁肝組織及肝癌組織和正常肝組織之間的高表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2CHAF1A在肝癌組織表達與各臨床病理特征之間的關系

2.2.1CHAF1A在肝癌組織表達與患者性別、年齡的關系

在本實驗80例肝癌患者中男性72例，女性8例，CHAF1A在2組中的高表達率分別是48.6%(35/72)、37.5%(3/8)，2組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.55)。所選80例患者中年齡在19～72歲之間，平均年齡為(50.72±11.48)歲，其中<50歲的30例，≥50歲的50例，CHAF1A在2組中的高表達率分別為36.7%(11/30)、54.0%(27/50)，2組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.133)。見表1。

2.2.2CHAF1A在肝癌組織中表達與臨床分期及腫瘤大小的關系

80例肝癌患者分為Ⅰ～Ⅱ期39例和Ⅲ～Ⅳ期41例2組，高表達率分別是48.7%(19/39)、46.3%(19/41)，2組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.832)。80例肝癌患者腫瘤大小<5 cm的36例，≥5 cm的44例，高表達率分別是52.8%(19/36)、43.2%(19/44)，2組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.393)。見表1。

2.2.3CHAF1A在肝癌組織中表達與病理分化及門靜脈癌栓與否的關系

80例肝癌患者按高、中、低病理分化程度分為3組，CHAF1A在3組中的高表達率分別是85.7%(6/7)、47.0%(31/66)、14.3%(1/7)，3組之間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.027)。按有無伴門靜脈癌栓的分組，伴有者15例，不伴有者65例，CHAF1A在2組的高表達率分別是20.0%(3/15)、53.8%(35/65)，兩者之間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.018)。見表1。

2.2.4CHAF1A在肝癌組織中表達與肝硬化、血清AFP水平及血清HBsAg的關系

80例肝癌患者按是否伴有肝硬化分組，其中伴有者36例，不伴有者44例(表1)，CHAF1A在2組的高表達率分別是41.7%(15/36)、52.3%(23/44)，2組間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.345)。80例肝癌患者中AFP≥400 ng·mL-1患者50例，AFP>400 ng·mL-130例，CHAF1A在2組的高表達率分別是52.0%(26/50)、40.0%(12/30)，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.298)。按血清HBsAg表達狀況分組，陽性者57例，陰性者23例，CHAF1A在2組高表達率分別是47.4%(27/57)、47.8%(11/23)，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.970)。見表1。

3討論

年齡、腫瘤大小、肝硬化等臨床病理特征是原發(fā)性肝癌的預后評價因素 。在本研究中筆者檢測CHAF1A在80例肝癌組織及其相應癌旁肝組織、20例正常肝組織中的表達情況，結果顯示陽性染色定位于細胞漿中呈彌散或散在分布，細胞核染色為陰性。正常肝組織高表達率>癌旁組織>肝癌組織，提示在肝癌的發(fā)生過程中同時伴隨著CHAF1A表達量的下降。有研究證實，CHAF1A在人類結腸癌組織中的表達陽性染色主要定位于細胞核，并指出CHAF1A在人類結腸癌組織普遍為過表達[4]，這與本實驗中肝癌組織的表達不同。

筆者檢測到CHAF1A在肝癌高、中、低分化的細胞中表達逐漸減少甚至不表達。伴有門靜脈癌栓患者的組織CHAF1A的高表達率低于無癌栓者，從另外一個方面提示CHAF1A在一定程度上具有影響肝癌分化和侵襲能力的作用。Staibano等[10]應用免疫組化檢測CAF-1的兩大亞基p60，p150在舌鱗癌中的表達，結果顯示CAF-1/p150下調提示不良預后，可以作為判斷預后指標之一，這和肝癌中的結果較吻合。CHAF1A可能是抑癌基因或者通過間接作用抑制肝癌和其他一些腫瘤的產生和發(fā)展。

本研究結果顯示CHAF1A表達下調與肝癌患者的性別、年齡、血清HBsAg的狀況、肝硬化、血清AFP值、腫瘤大小及臨床分期臨床特征之間無明顯相關性。目前已經很明確肝癌的發(fā)生與HBV感染及肝硬化密切相關，而HBV致癌機理與HBV基因組引起宿主細胞基因受傷有關。結果顯示CHAF1A表達與HBsAg陽性與否及有無伴肝硬化無相關性，此結果可能需要更深入的研究來證實。而血清AFP在臨床上是用來診斷和評價肝癌預后的重要標志物。AFP在正常人體內表達很低，而肝癌細胞自身可產生AFP[13]，癌變時有可能升高。但是其濃度與腫瘤的大小有關，而且并非所有肝癌細胞都分泌這種蛋白，尤其在早期和小細胞肝癌時，AFP的升高并不明顯，容易造成漏診[14]。CHAF1A有潛力成為不依賴于AFP的肝癌標記物。這些結果顯示CHAF1A表達可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。

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(責任編輯：劉大仁)

The Expression and Clinical Value of CHAF1A in Hepatocellular Carcinoma

FU Hui-ying1,HUANG Can2a,Yan Ye-hong2b,PENG Xiao-dong2a,ZHANG Zhi-qian3

(1.DepartmentofOncology，the94thHospitaloftheChinesePeople’sLiberationArmy,Nanchang330001,China； 2a.DepartmentofOncology；2b.DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China； 3.DepartmentofLiverSurgery,theThirdNanchangHospital,Nanchang330009,China)

ABSTRACT：ObjectiveResearch the expression of largest subunit p150 of Chromatin assembly factor 1 (CAF-1) (CHAF1A) in hepatocellular carcinoma (HCC),and analyze the ralativity between its expression and clinical pathological characteristics of HCC patients.such as age,gender,pathological differentiation,portal venous tumor emboli,tumor size,clinical stage,HBsAg situation,cirrhosis of the liver and serum AFP.MethodsScreening 80 patients,all of them from June 2010 to October 2014 have accepted surgical resection in the first affiliated hospital of Nanchang university general surgery,and are confirmed by pathological diagnosis to be HCC.Tumor tissues and normal liver tissues 2 cm far near the cancer and normal liver tissues of 20 patients due to trauma or intrahepatic biliary calculi surgical resection of tissues are collected.Expression of CHAF1A in liver cancer are detected by immunohistochemistry.The differences of CHAF1A expression in the three groups and the relationship between expression of CHAF1A with clinical pathological characteristics of patients.ResultsThe high expression rate of CHAF1A in paraneoplastic and normal liver tissue was significantly higher than that in liver cancer tissue(P<0.05).CHAF1A expression in poorly differentiation liver cancer tissue or liver cancer tissue associated with portal venous tumor emboli is lower than high differentiation liver cancer tissue(P=0.027) or no portal venous tumor emboli (P<0.05).The expression of CHAF1A in liver cancer tissue is not related with gender,age,clinical stage,tumor size,HBsAg,cirrhosis of the liver and serum AFP Of patients(P>0.05).ConclusionCHAF1A expression maybe affect differentiation and invasiveness of liver cancer .The expression of CHAF1A in liver cancer tissue is not related with gender,age,clinical stage,tumor size,HBsAg,cirrhosis of the liver and serum AFP Of patients.

KEY WORDS：CHAF1A; hepatocellular carcinoma; Immunohistochemistry;portal vein tumor thrombosis; poorly differentiated

收稿日期：2015-10-20

作者簡介：付慧英 (1979—)，女，碩士，住院醫(yī)師，主要從事消化系統(tǒng)惡性腫瘤的綜合診治研究。

通信作者：彭小東，主任醫(yī)師，E-mial:pxddhbb@163.com

中圖分類號：R735.7

文獻標志碼：A

文章編號：1009-8194(2016)01-0005-05

DOI:10.13764/j.cnki.lcsy.2016.01.002