■李 杰 張劉運 王立群

（1.東北農(nóng)業(yè)大學，黑龍江哈爾濱 150030；2.黑龍江省華森畜牧科技有限責任公司，黑龍江哈爾濱 150030）

豆粕是飼料工業(yè)應用量最大的蛋白質飼料原料。但因其含有多種抗營養(yǎng)因子（胰蛋白酶抑制因子、脲酶和植酸酶等）而降低了動物對其營養(yǎng)物質的消化、吸收和利用。豆粕經(jīng)過微生物發(fā)酵后可有效去除其中的多種抗營養(yǎng)因子，將大分子蛋白物質分解成動物容易消化、吸收和利用的多肽和小肽，使消化能力弱的幼小動物對植物蛋白質的消化利用率得到大幅度提高。多肽是經(jīng)過蛋白酶水解處理后得到的由3～10個氨基酸組成的小分子肽，其分子量一般為1 000 Da。因多肽具有溶解度好、黏度低、吸收好和促進微生物發(fā)酵等特點，而成為發(fā)酵豆粕飼料的重要指標。此外，發(fā)酵豆粕含有多種益生菌及多種發(fā)酵有益代謝產(chǎn)物和生物活性物質，具有調節(jié)動物生理功能和增強動物免疫力的作用。發(fā)酵豆粕是具有營養(yǎng)、調理動物生理和免疫力雙重作用的優(yōu)質蛋白質飼料。豆粕發(fā)酵過程是一個抗營養(yǎng)因子消除、大分子蛋白質降解成小分子肽、微生物源及代謝產(chǎn)物產(chǎn)生等一系列復雜的益生菌發(fā)酵過程，其產(chǎn)品是具有無（低）抗原、易吸收、生物安全，富含營養(yǎng)的優(yōu)質發(fā)酵蛋白質飼料。

一些試驗表明，在規(guī)?；a(chǎn)中，37～45℃條件下，微生物生長旺盛，蛋白酶活性較高，當溫度≥50℃，雖然菌種仍有生長，但蛋白酶活性較低，豆粕發(fā)酵速度較慢。在南方很容易達到以上豆粕發(fā)酵的溫度，而在北方年平均溫度較低，要達到這樣的發(fā)酵溫度，需要提供較多的熱能，這就導致豆粕發(fā)酵成本大幅度提高，發(fā)酵豆粕價格較高，不利于發(fā)酵豆粕飼料的推廣和應用。北方是我國大豆的主要產(chǎn)區(qū)，非轉基因大豆資源豐富，所產(chǎn)豆粕質優(yōu)價廉，利用地產(chǎn)大豆生產(chǎn)發(fā)酵豆粕具有資源優(yōu)勢。因此，研究北方地區(qū)溫度條件下豆粕發(fā)酵的技術和生產(chǎn)工藝對北方豆粕資源的利用和提高附加值具有重要意義和促進作用。

1 豆粕發(fā)酵工藝參數(shù)

我國豆粕發(fā)酵生產(chǎn)的起步較晚，目前對豆粕發(fā)酵工藝參數(shù)缺乏系統(tǒng)的研究,而這些參數(shù)對于發(fā)酵豆粕質量具有重要的影響作用。豆粕發(fā)酵受諸多因素的影響，比如水分、養(yǎng)分、pH值、溫度、發(fā)酵方式等。莫重文等(2007)試驗結果表明，豆粕發(fā)酵菌種接種量為6%，發(fā)酵溫度為28℃，發(fā)酵時間為72 h，發(fā)酵豆粕中粗蛋白質含量可達49.10%，比原料提高12.1%。戚薇等（2008）利用納豆芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌發(fā)酵豆粕，結果表明，兩種菌（兩菌比例為1∶1）接種時間隔開，接種量為10%，初始含水量為40%，初始pH值自然，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時間縮短為48 h。發(fā)酵豆粕的蛋白質水解度達到20.14%。王金斌等（2009）采用枯草芽孢桿菌和熱帶假絲酵母（接種比例為1∶1），發(fā)酵溫度為38℃，基質初始含水量為52%，發(fā)酵時間為48 h。發(fā)酵豆粕粗蛋白質含量由31.75%升至49.27%。馬文強等（2008）的試驗結果表明，發(fā)酵豆粕中高分子量蛋白質含量下降，低分子蛋白質含量提高，粗蛋白質、粗脂肪、磷和氨基酸的含量顯著高于發(fā)酵前，胰蛋白酶抑制因子等抗營養(yǎng)因子含量顯著降低。吳勝華等（2008）采用2種芽孢桿菌、乳酸菌及酵母菌進行豆粕固態(tài)發(fā)酵，料水比為1∶1.2，通氣量為60 g/ml，接種量為4%，發(fā)酵溫度為40℃。發(fā)酵豆粕中的小肽含量可達12.01%。以上研究結果表明，發(fā)酵溫度為28～38℃，接種量為4%～7.5%，料水比為1∶1.2，發(fā)酵時間為48～72 h，起始溫度越高發(fā)酵時間越短。

2 北方地區(qū)豆粕發(fā)酵技術及工藝參數(shù)

工廠化生產(chǎn)發(fā)酵豆粕通常采用堆式發(fā)酵，成本低，易于操作，但缺點是堆外側的豆粕與微生物接觸較少，發(fā)酵不完全。固態(tài)堆式發(fā)酵時豆粕堆的高度可達到1 m左右，發(fā)酵物料堆中因可溶性碳水化合物分解產(chǎn)生熱量，使發(fā)酵堆內部溫度可升高達到50～60℃。雖然豆粕發(fā)酵過程能夠產(chǎn)生熱量，但如果環(huán)境溫度過低，豆粕堆式發(fā)酵的初期微生物活性較低，繁殖速度較慢，豆粕發(fā)酵升溫過程很緩慢，發(fā)酵時間較長，有時會導致異常發(fā)酵。在北方環(huán)境溫度條件下，尤其是在冬季豆粕發(fā)酵車間的溫度一般維持在10～16℃之間，如果不采取任何措施，在此溫度條件下，豆粕發(fā)酵的菌種活力較低，豆粕的發(fā)酵速度緩慢。楊玉芬等研究不同溫度對豆粕發(fā)酵的影響，結果表明，35℃條件下發(fā)酵豆粕的粗蛋白含量高于25℃。由此看出，堆式豆粕發(fā)酵的決定因素是起始溫度。起始溫度適宜，豆粕發(fā)酵溫度升高速度快，微生物繁殖快，發(fā)酵速度就快。

2.1 豆粕發(fā)酵菌種的篩選和培育

北方發(fā)酵豆粕的生產(chǎn)和研究都剛剛起步，在發(fā)酵菌種的培育和發(fā)酵工藝參數(shù)方面的研究報道較少。國內豆粕發(fā)酵始于南方，發(fā)酵所用的菌種也來源于南方，發(fā)酵豆粕菌種對北方氣溫條件的適應性較差，有必要篩選和培育適應于北方氣溫條件的豆粕發(fā)酵菌種，提高發(fā)酵豆粕的生產(chǎn)效率。

東北農(nóng)業(yè)大學微生物教研室近年來一直從事豆粕發(fā)酵菌種的低溫馴化和菌種的培育研究。他們在市售的產(chǎn)品中分離和篩選了產(chǎn)酶高的豆粕發(fā)酵菌種進行低溫馴化。并根據(jù)蛋白酶的高低篩選出5株芽孢桿菌優(yōu)良菌株進行紫外誘變，以菌株蛋白酶活力、酸溶蛋白含量和游離氨基酸含量，以及胰蛋白酶抑制因子和植酸含量為指標進行復選，篩選出優(yōu)良菌株2枚——JY14和JY15。用這兩株菌進行豆粕發(fā)酵試驗，蛋白酶活性分別提高122.14%和170.69%，酸溶蛋白分別提高108.85%和151.95%，游離氨基酸含量分提高49.45%和50.07%，胰蛋白酶抑制因子分別降低38.18%和73.88%，植酸含量分別降低50.40%和80.29%。其中JY15無論是蛋白酶活性、酸溶蛋白含量還是抗營養(yǎng)因子降低的程度都優(yōu)于JY14。

2.2 略低溫度菌種擴繁培養(yǎng)基優(yōu)化

一般芽孢桿菌的培養(yǎng)都在37℃度條件下進行，陳雷采用上述低溫馴化的芽孢桿菌菌株放置到30℃條件下進行培養(yǎng)與擴繁，與37℃條件下培養(yǎng)的菌種進行比較，結果表明，在30℃培養(yǎng)的活菌數(shù)量和酶活性與37℃沒有顯著差異，表明以上經(jīng)過低溫馴化的菌種在略低溫度條件下具有較高的活力。同時采用以玉米、豆粕、小麥麩常規(guī)飼料為主的原料進行菌種擴繁，以降低菌種培養(yǎng)的成本。結果表明，在30℃條件下進行菌種液體發(fā)酵，不同的培養(yǎng)基配方培養(yǎng)的活菌數(shù)量不同，其中由1.5%玉米、0.5%小麥麩、1.0%豆粕及少量礦物質組成的配方其活菌數(shù)量可達到2.08×1010cfu/ml，與37℃對照組相比差異不顯著；蛋白酶和淀粉酶活性分別略高于37℃對照組。由此看出，經(jīng)過低溫馴化的芽孢桿菌在比正常溫度低7℃的條件下進行液體發(fā)酵，其活菌數(shù)量和產(chǎn)酶活性均可達到與37℃條件下相同的水平。

2.3 北方溫度條件下豆粕發(fā)酵升溫技術

劉天蒙等在實驗室條件下進行溫度對豆粕發(fā)酵影響的試驗，結果表明，不同的溫度條件下微生物所產(chǎn)蛋白酶的活性不同，在28℃條件下主要為堿性和中性蛋白酶，酶活力較低，酶活高峰出現(xiàn)在78 h，以后酶活力明顯下降；在30℃條件下，所產(chǎn)酶的活性明顯高于28℃，酶活高峰出現(xiàn)在66 h，32℃條件酶活性高峰出現(xiàn)在56 h，但酶活性較低，他們認為30℃是米曲霉發(fā)酵豆粕的最佳發(fā)酵溫度。

在北方豆粕發(fā)酵車間溫度能夠超過20℃的月份為6～9月，其他月份（即使是冬季供暖條件下）車間溫度也就在10～20℃之間。解決低溫豆粕發(fā)酵困難的方法有兩種：一是在豆粕發(fā)酵時加熱水提高物料堆的溫度，但也僅在發(fā)酵堆內部保持這個溫度，而在堆外側的豆粕很快變涼，與車間溫度相同；二是在豆粕發(fā)酵時添加升溫物質，提高豆粕發(fā)酵溫度升高的速度，但堆外側豆粕溫度很快降低。解決發(fā)酵堆外側豆粕溫度降低的方法是在堆外面覆蓋透氣、保溫的覆蓋物。

在車間溫度15℃的條件下，陳雷等在發(fā)酵豆粕時加熱水使發(fā)酵豆粕的溫度達到24℃左右，并在豆粕發(fā)酵時不添加任何物質（試驗1組）、添加0.2%糖化酶（試驗2組）和添加0.2%糖化酶+0.1%酵母菌（試驗3組），與起始溫度30℃（對照組）進行比較試驗。結果表明，起始溫度對豆粕發(fā)酵過程的溫度有較大影響，30℃對照組溫度升高速度較快，發(fā)酵12 h達到38℃，而24℃發(fā)酵組僅達到28℃左右；發(fā)酵24 h對照組溫度達到51.4℃，開始翻堆，而3個試驗組溫度僅達到27～32℃，其中試驗3組的溫度高于試驗2組，而試驗2組高于試驗1組。3個試驗組在發(fā)酵的40 h溫度達到50℃，進行翻堆，翻堆后的溫度一直維持在40～50℃之間。發(fā)酵時間為64 h。3個試驗組豆粕發(fā)酵成熟時間比30℃晚12～16 h。衛(wèi)琳等進行恒溫和變溫豆粕發(fā)酵試驗，將溫度恒定在30℃，固態(tài)發(fā)酵豆粕則需要96 h，將溫度由30℃升高為45℃，發(fā)酵時間可縮短為72 h。朱曦等（2007）的試驗結果表明，在平均溫度25℃條件下，48 h翻料1次，翻料溫度為60℃左右，發(fā)酵時間為72 h。由此可見，堆式發(fā)酵豆粕的產(chǎn)熱可提高微生物繁殖速度，縮短豆粕發(fā)酵時間。

卓林霞等用枯草芽孢桿菌在pH值6.6、接種量為3.8%、料水比為1∶1條件下發(fā)酵豆粕，蛋白酶活力比發(fā)酵前提高了2.55倍。陳雷等的試驗結果表明，在發(fā)酵結束時，30℃對照組小肽含量從3.81%提高到9.3%，而試驗1、2、3組分別達到8.72%、9.03%和9.14%，試驗2組和試驗3組小肽含量接近對照組。發(fā)酵后對照組脲酶活性和胰蛋白酶抑制因子比發(fā)酵前降低55.69%和32.46%，而試驗1、2和3組脲酶活性分別降低61.57%、51.37%和77.25%，胰蛋白酶抑制因子比發(fā)酵前分別降低56.24%、47.95%和51.17%。3個試驗組抗營養(yǎng)因子含量降低的幅度均高于對照組，其中試驗3組降低的幅度最大。由此看出，在24℃溫度條件下豆粕發(fā)酵時添加糖化酶+酵母菌可以提高豆粕發(fā)酵過程的溫度，使發(fā)酵豆粕小肽含量提高和抗營養(yǎng)因子降低的程度與30℃對照組相比沒有顯著差異。這表明在24℃條件下豆粕發(fā)酵時，添加糖化酶使豆粕堆中的可溶性碳水化合物快速分解，釋放熱量，添加酵母菌加快這一過程，二者聯(lián)合使用比單獨添加糖化酶產(chǎn)熱量大。王衛(wèi)國等的試驗結果也表明，在豆粕發(fā)酵時添加糖化酶可提高其發(fā)酵速度，縮短發(fā)酵時間。添加酵母菌還可以加快豆粕的發(fā)酵過程，分解豆粕蛋白，產(chǎn)生較多的菌體蛋白和生物活性物質，有利于提高動物的免疫力和抗病力。

2.4 北方溫度條件下豆粕發(fā)酵保溫技術

堆式發(fā)酵豆粕堆外側的溫度與環(huán)境溫度相同，或由于含水量大，低于環(huán)境溫度。為保持堆外側豆粕的溫度，可采用覆蓋物進行保溫。但是由于豆粕發(fā)酵產(chǎn)熱及主要發(fā)酵菌種是需氧菌，選擇的覆蓋物即要保溫，又要透氣，而且又要防止雜菌污染。

陳雷采用市售的帆布苫布和薄層棉被進行豆粕發(fā)酵保溫試驗。車間溫度在12～15℃條件下，加熱水使發(fā)酵豆粕達到22.5～22.9℃，由于環(huán)境溫度低，發(fā)酵溫度升高比較緩慢，到44 h，才達到50℃以上。棉被組在發(fā)酵32 h后溫度首先到達30℃以上，分別高出對照組和苫布組4.6℃和2.4℃；隨著發(fā)酵的進行，該組的溫度始終高于對照組和苫布組，比對照組和苫布組提前4 h，達到50℃。棉被組發(fā)酵豆粕的小肽含量略高于對照組，氨基酸總量比對照組高4.37%；脲酶活性比對照組低29.17%；苫布組以上指標均優(yōu)于對照組，但略遜于棉被組。該試驗結果表明，在環(huán)境溫度較低的季節(jié)，以堆式發(fā)酵豆粕時，在堆外覆蓋薄層棉被或苫布可保持豆粕發(fā)酵的溫度，但棉被的透氣性優(yōu)于苫布，使豆粕發(fā)酵得更完全，時間可縮短4 h。

3 結論

在北方地區(qū)低溫條件下進行工廠化生產(chǎn)發(fā)酵豆粕，首先篩選和培育適合于北方溫度條件下的豆粕發(fā)酵菌種，并進行相應溫度條件下的菌種擴繁；在北方溫度條件下[（22～24）℃]豆粕發(fā)酵時添加糖化酶+酵母菌及覆蓋薄層棉被可提高堆式發(fā)酵豆粕的溫度和速度，以及提高發(fā)酵豆粕的質量。